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    蘆花雞膜聯(lián)蛋白A2 基因PCR 擴增

    2020-11-29 11:09:58孫夢雪張淑萍郭延敏張世超王思琪毛亞娟姜莉莉
    中國畜禽種業(yè) 2020年11期
    關鍵詞:氨基酸編碼引物

    孫夢雪 張淑萍 郭延敏 張世超 王思琪 毛亞娟 姜莉莉*

    (1,菏澤學院藥學院 274015;2,菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院 274000)

    膜聯(lián)蛋白A2 (ANXA2)是一種鈣和脂結合蛋白,以鈣依賴的方式結合磷脂和細胞骨架,可參與細胞分化,囊泡運輸,胞膜運動等多種生理過程[1]。ANXA2 可與多種病毒的蛋白發(fā)生相互作用,影響病毒的組裝、釋放,對病毒增殖產(chǎn)生影響[2,3]。ANXA2 可作為HIV-1 感染的輔助因子,協(xié)助HIV-1 進入巨噬細胞;同時,ANXA2 還可作為HIV-1 Gag 蛋白的結合蛋白以及定位在內涵體膜上的Gag 蛋白積累輔助因子,對HIV 的正確組裝至關重要[3]。Anx2 通過與胞膜上的HIV-1Gag 相互作用,在HIV-1 復制的后期發(fā)揮作用[2]。近幾年研究表明ANXA2 能與病毒蛋白相互作用,影響病毒復制。雞ANXA2 與禽流感病毒的NS1 蛋白相互作用,抑制宿主細胞凋亡,促進病毒增殖[4],ANXA2 與H5N1高致病性禽流感病毒非結構蛋白NS1 相互作用,促進病毒的復制[5]。ANXA2 可與豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)Nsp9 蛋白和波形蛋白相互作用,促進病毒復制[6,7]。AxnA2 的c 端結構域通過與牛流行熱病毒(BEFV) 基質蛋白M 相互作用,介導M 蛋白在質膜上的定位,影響B(tài)EFV 復制[7]。本研究克隆雞ANXA2 基因,并對其進行序列分析,為進一步對雞ANXA2 基因功能及深入了解其抗病毒機制奠定基礎。

    1 材料與方法

    1.1 引物設計

    參考ncbi 中已發(fā)表的雞ANXA2 基因序列 (登錄號:NM_205351.1),設計ANXA2 基因擴增引物FA/RA,F(xiàn)A:5' -TGCCAACATGTCTACTGTC-3';RA:5' -TCACAGCTTTCAGT CCTCTC-3',引物由華大基因公司合成。

    1.2 ANXA2 基因PCR 擴增

    Trizol 法提取健康蘆花雞肝臟組織RNA 并反轉錄為cDNA。以提取的cDNA 為模板,用引物FA/RA 擴增ANXA2 基因。PCR 反應體系50μL:2×Taq PCR MasterMix 25μL,cDNA 模板1μL,上下游引物各2μL,ddH2O 20μL。PCR 反應程序為:94℃預變性5min,94℃變性30s,54℃退火30s,72℃延伸1min,共35 個循環(huán);72℃延伸10min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,膠回收產(chǎn)物送華大基因公司進行序列測定。

    1.3 ANXA2 編碼氨基酸序列理化特性分析

    使用在線工具ProtParam 分析ANXA2 編碼氨基酸理化特性。

    2 試驗結果

    2.1 ANXA2 基因PCR 擴增

    ANXA2 基因PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測,結果如附圖所示,目的基因片段大約1000bp 左右,與預期結果一致。

    附圖 ANXA2 基因PCR 擴增結果

    2.2 ANXA2 基因核苷酸序列分析

    膠回收產(chǎn)物測序結果表明,擴增片段全長1036bp,用DNA Star 軟件分析蘆花雞ANXA2 基因的核苷酸序列,結果表明,ANXA2 基因的CDs 區(qū)全長1020bp,理論分子質量為38.64KD,A (31.67%)、G (24.80%)、T (23.63%)、C(19.90%),(G+C)%為44.71%。

    2.3 ANXA2 編碼氨基酸序列理化特性分析

    使用在線工具ProtParam 對ANXA2 的編碼氨基酸序列分析,結果表明,ANXA2 分子式為C1701H2748N466O529S14,編碼氨基酸中Ala (A) 數(shù)目最多,占總氨基酸數(shù)目的7.4%,N末端編碼氨基酸是Ala (A),該蛋白不含Trp 殘基。整條肽鏈中疏水氨基酸的數(shù)目為109。該蛋白在哺乳動物網(wǎng)狀細胞中半衰期為4.4h,在酵母菌中理論半衰期>20h,在大腸桿菌中理論半衰期>10h。該蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為43.36,提示該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為31.67,整條肽鏈中氨基酸親水性的平均值為-0.502。

    3 討論

    ANXA2 是一種鈣依賴的膜結合蛋白,可以聚集含有磷脂的脂質筏,具有相當廣泛地組織分布性,可存在于上皮細胞,巨噬細胞,單核細胞,樹突狀細胞等多種真核細胞的表面。在巨噬細胞中高水平表達,在T 淋巴細胞或293T 細胞系中不表達[2]。膜聯(lián)單白可由單體和異源四聚體兩種不同的形式存在[8];單體主要在細胞質中,參與細胞內細胞器膜的組裝、溶解和修復等一系列工作,異源四聚體主要分布在細胞膜的表面,由兩分子的ANXA2 和A2t 組成,ANXA2 主要參與信號傳導和鈣離子通道的形成,調控炎癥反應,細胞分化,囊泡運輸,胞膜運動,細胞骨架間蛋白間的相互作用等多種生理生化過程。人ANXA2 與惡性腫瘤的存在有密切聯(lián)系,對疾病發(fā)病機理研究有重要意義。有研究表明,ANXA2 作為J 亞群禽白血病病毒(ALV-J)的受體結合蛋白,顯著抑制ALV-J 感染和復制[9]。ANXA2 作為一種新的抗病毒生物標志物,提示其可作為分子靶標,進行疾病早期診斷。研究結果為進一步對雞ANXA2基因功能及深入研究其抗病毒機制奠定基礎。

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