雞新城疫、傳染性法氏囊和傳染性支氣管炎病毒三重RT-PCR檢測方法建立

王通輝 楊偉 姜玲玲 吳松成 張亞楠 楊先富 吳政明 余波*

（1，貴州省劍河縣岑松鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心 556400；2，貴州省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所 550000；3，貴州省黔東南州動物疫病預(yù)防控制中心 556000；4，貴州省黔東南州畜牧技術(shù)推廣站 556000）

新城疫(ND)、傳染性法氏囊（IBD）和傳染性支氣管炎(IB) 是嚴(yán)重危害禽類的病毒性疾病，常以單獨或混合感染的方式感染家禽，發(fā)病率和死亡率都很高，給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[1]。新城疫（Newcastle Disease,ND）是一種由屬副黏病毒科腮腺炎病毒屬新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）感染引起的急性、高度傳染性、病毒性禽類疾病[2-4]。傳染性法氏囊（Infectious Bursal Disease,IBD）是一種由雙RNA病毒科、禽雙RNA 病毒屬的傳染性法氏囊病毒 （Infectious Bursal Disease Virus,IBDV）感染引起的一種急性、高度接觸性、病毒性禽類傳染病，以法氏囊發(fā)炎、壞死、萎縮等為主要特征[5-8]。傳染性支氣管炎（Infectious Bronchitis,IB）是一種由冠狀病毒科冠狀病毒屬的傳染性支氣管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus,IBV）感染引起的高度接觸性禽類呼吸道急性傳染病[9-11]。由于這些疫病均能導(dǎo)致嚴(yán)重的禽類呼吸道疾病[12]，且流行病學(xué)、發(fā)病特征、臨床癥狀和剖檢變化極為相似，且不易區(qū)分[13-15]。傳統(tǒng)的病原分離鑒定和血清學(xué)方法無法進行快速檢測和鑒別診斷，嚴(yán)重影響對這些疫病的有效防制。因此，建立一種可同時檢測NDV、IBDV 和IBV3 種病毒的特異、敏感、快速的檢測方法，對于上述3 種病毒性傳染病的診斷和防控十分必要。

隨著聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù) （Polymerase Chain Reaction,PCR）的出現(xiàn)及其技術(shù)不斷改進，這種針對病原核酸的診斷方法具有更準(zhǔn)確、靈敏、特異的特點，完全可用于早期快速診斷目的，并具有其自身獨特的優(yōu)勢和廣闊的應(yīng)用前景。利用普通PCR、實時熒光定量PCR、核酸探針、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增、固相基因芯片、液相芯片等技術(shù)檢測病毒已有很多報道，其中PCR技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于多種疫病檢測診斷中。多重PCR （Multiplex Polymerase Chain Reaction,mPCR）技術(shù)不僅具有普通PCR特異性強、敏感性高、快捷簡便等優(yōu)點，而且可在一個反應(yīng)體系中同時擴增多份DNA 或RNA 樣本的不同目的基因片段，由此可以檢測鑒別多種不同的病原體，特別適用快速診斷多種混合感染的臨床樣本。本研究建立針對上述3 種RNA 病毒的多重PCR 檢測方法，以達(dá)到在同一反應(yīng)體系中同時擴增出對應(yīng)病原體特異核酸片段的目的，為早期、快速、特異、敏感地實現(xiàn)對雞新城疫、傳染性法氏囊和傳染性支氣管炎病原的單一或混合感染的快速準(zhǔn)確檢測奠定基礎(chǔ)，為雞新城疫、傳染性法氏囊和傳染性支氣管炎的流行病學(xué)調(diào)查和診斷防控提供了有效的理論和技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 參考菌株

雞新城疫病毒、傳染性法氏囊病毒與傳染性支氣管炎病毒毒株均由貴州省畜牧獸醫(yī)研究所畜禽疫病研究室提供。

1.2 引物設(shè)計

參照NCBI 中NDV-NP （KT445901.1）、IBDV（LM651365.1）和IBV-N （FJ548847.1）的基因序列，應(yīng)用SnapGene、DNAStar、Primer5.0、Oligo 等軟件，分別設(shè)計3 對特異性引物，并通過http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/對這3 對引物特異性進行鑒定，均具有良好的特異性。PAGE 級，OD 值為2.0，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。詳細(xì)引物序列，見表1。

1.3 主要試劑

Mini BEST Universal Genomic DNA&RNA Extraction Kit Ver.4.0 核酸提取試劑盒、PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver.2均購自寶生物工程 （大連）有限公司；氨芐西林、RNA Inhibitor、pMD18-T Vector、DH-5α 感受態(tài)細(xì)胞、E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit (50) 膠回收試劑盒、普通質(zhì)粒小提試劑盒、去離子水均購自天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂粉、異丙醇、醋酸、無水乙醇等國產(chǎn)分析純購自索來寶科技（北京）有限公司。

1.4 主要儀器

核酸提取儀（Lab-Aid820）購自廈門百維信生物科技有限公司，電子天平（AR2140）購自美國奧豪斯，紫外分光光度計（NanoDrop 2000/2000c）、高速冷凍離心機（艾本德5810R）購自美國賽默飛，pH 測量儀（Delta 320A/C）購自梅特勒-托利多，梯度PCR 擴增儀、電泳儀、紫外透射儀、Gel DOC XR 凝膠成像系統(tǒng)(University Hood Ⅱ) 均購自美國BIO-RAD；超純水器（ATZ-10-T）購自臺灣艾科蒲，槍頭、PCR 管與離心管等耗材購自美國AXYGEN。

1.5 DNA 的提取

病毒RNA 的提取參照MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0 核酸提取試劑盒說明書進行。將提取的RNA 于-20 ℃保存。

1.6 單一RT-PCR 方法的建立

1.6.1 pMD-18T-NP、VP、N 陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建

以雞新城疫病毒、傳染性法氏囊病毒與傳染性支氣管炎病毒毒株各自RNA 為模板進行RT-PCR 擴增，反應(yīng)條件為：50℃40min；95℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃45s，35 個循環(huán)；最后72℃10min；12℃，∞。

將擴增的PCR 產(chǎn)物與pMD-18T 克隆載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH-5α，重組質(zhì)粒命名為pMD-18T-NP、VP、N，將建構(gòu)的陽性標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.6.2 單一RT-PCR 擴增體系的優(yōu)化

單一病毒的RT-PCR 反應(yīng)體系為25μl，其中NDV、IBDV和IBV 的反應(yīng)體系分別為2×1 Step Buffer 12.5μl，上下游引物分別各為1.0μl，RNA 模板為1.0μl，PrimeScript One Step Enzyme Mix 為1.0μl，RNase Free H2O 各為8.5μl、RT-PCR 反應(yīng)條件為50℃40min；95℃5min；94℃30s，預(yù)設(shè)8 個退火溫度54～59.5.0℃ （54.0、54.4、55.2、56.3、57.7、58.8 和59.5℃）30s，72℃45s，共進行35 個循環(huán)；72℃10min；以確定最佳的退火溫度。

1.7 多重RT-PCR 的建立

1.7.1 三重RT-PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化

將方法1.3.2 獲得的NDV、IBDV 和IBV 這3 種病毒基因重組質(zhì)粒進行相應(yīng)稀釋，并等比例混合作為多重PCR 反應(yīng)模板。對三重PCR 反應(yīng)預(yù)設(shè)置8 個梯度的退火溫度54～60.0℃（54.0、54.4、55.2、56.3、57.7、58.8、59.5 和60.0℃）進行優(yōu)化，以確定最佳退火溫度。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7.2 三重RT-PCR 特異性、敏感性及重復(fù)性試驗

通過建立的三重RT-PCR 方法分別以NDV、IBDV 和IBV的病毒基因重組質(zhì)粒核酸與多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌、E.coli及正常組織的DNA/cDNA 模板進行RT-PCR 擴增，檢測該三重RT-PCR 方法是否具有特異性；用滅菌三蒸水對3 個病毒的核酸進行10 倍系列稀釋，然后取每個稀釋度的核酸為模板分別運用三重PCR 方法檢測其敏感性；選取3 種病毒最佳濃度的病毒基因重組質(zhì)粒核酸混合核酸作為模板及最佳的反應(yīng)體系及條件，進行3 次三重RT-PCR 重復(fù)性試驗。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 引物序列及片段大小

1.7.3 三重RT-PCR 對臨床病料的檢測

利用已建立的三重RT-PCR 方法對2018～2019 年收集于貴州省內(nèi)的共xx 份疑似新城疫、傳染性法氏囊與雞傳染性支氣管炎臨床樣品進行檢測。取采集到的拭子、組織和血液與PBS 溶液(0.01 mol/L) 按1：1 體積比混合。4℃條件下，12000×g 離心10min，取上清分裝于滅菌處理后的EP 管中并做好標(biāo)記，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。各?00μl 上清，參照DNA&RNA的提取參照核酸提取試劑盒說明書進行，對提取到的核酸進行三重RT-PCR 擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果

2.1 單一RT-PCR 方法的建立

2.1.1 陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建

測序結(jié)果表明，構(gòu)建陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒與雞新城疫病毒NP 基因、傳染性法氏囊病毒VP 基因及傳染性支氣管炎病毒N 基因相似性為100%。

2.1.2 單一RT-PCR 擴增體系的優(yōu)化

在25μl 體系中，通過固定陽性質(zhì)粒模板量，改變引物濃度的系列試驗，確定反應(yīng)體系的最佳引物量。結(jié)果表明在3 對引物中，NDV、IBDV 和IBV 上下游引物各1.0μl 時RT-PCR檢測效果最明顯。NDV、IBDV 和IBV 最佳反應(yīng)體系（25μl），見表2。

表2

對單一RT-PCR 反應(yīng)的退火溫度54.0～59.5℃（54.0、54.4、55.2、56.3、57.7、58.8 和59.5℃）進行優(yōu)化，以確定最佳反應(yīng)條件。試驗結(jié)果表明，火溫度在54.0～60.0℃之間均可擴增出目的條帶，其中NDV 和IBDV 最佳反應(yīng)程序為50℃40min；95℃5min；94℃30s，56.5℃30s，72℃30s，35 cycles；72℃10min；12℃，∞。IBV 最佳反應(yīng)程序為50℃40min；95℃5 min；94℃30s，56.5℃30s，72℃45s，35 cycles；72℃10min；12℃，∞。各退火溫度優(yōu)化擴增結(jié)果見圖1、圖2 與圖3。

2.2 三重RT-PCR 的構(gòu)建

2.2.1 三重RT-PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化

圖1 NDV 退火溫度優(yōu)化

圖2 IBDV 退火溫度優(yōu)化

圖3 IBV 退火溫度優(yōu)化

通過固定陽性質(zhì)粒模板量，改變引物濃度的系列試驗，確定反應(yīng)體系的最佳引物量。結(jié)果表明，三重PCR 反應(yīng)在50μl反應(yīng)體系條件下最佳，其中2×1 Step Buffer 25.0μl，3 對引物上下游引物濃度各1.75μl，NDV、IBDV 和IBV 模板各1.0μl，PrimeScript One Step Enzyme Mix 2.0μl，RNase Free H2O 9.5μl；當(dāng)反應(yīng)循環(huán)數(shù)為30 個循環(huán)，退火溫度為54.5℃時三重RT-PCR擴增效果最佳，三重RT-PCR 最佳反應(yīng)條件：50℃40min；95℃5min；94℃30s，57.7℃30s，72℃45s，30cycles；72℃10min。每個基因均能出現(xiàn)特異性條帶，且無非特異性擴增，見圖4。

2.2.2 三重PCR 特異性、敏感性及重復(fù)性試驗

三重RT-PCR 特異性試驗結(jié)果表明，禽白血病毒、馬立克氏病病毒、多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌、E.coli 及正常組織的模板均未擴增出條帶，而NDV、IBDV 和IBV 模板均擴增出與目的片段大小相符的特異性條帶，見圖5；對NDV、IBDV 和IBV3 個病毒的核酸進行10 倍梯度稀釋，在建立的三重RTPCR 檢測方法反應(yīng)條件下進行擴增，敏感性結(jié)果顯示，各種病毒的最低檢測量分別為NDV6.18×101copies/μl、IBDV 8.64×106copies/μl 和IBV2.57×102copies/μl，見圖6；重復(fù)性試驗結(jié)果表明，3 次重復(fù)試驗均能擴增出均勻一致的目的條帶，具有良好的重復(fù)性，表明建立的三重RT-PCR 方法具有較好的重復(fù)性。

2.2.3 三重RT-PCR 對臨床樣品的檢測

不同來源的75 份臨床病料檢測結(jié)果表明：雞場存在不同程度的NDV、IBDV 和IBV 混合感染現(xiàn)象。在75 份樣品中，其中病毒單一感染率為46.6% （35/75），NDV 與IBDV 的二重感染陽性率為16.0% （12/75），NDV 與IBV 的二重感染率為14.6% （11/75），IBDV 和IBV 的二重感染率為10.6% （8/75），NDV、IBDV 和IBV 的三重感染率為5.3% （4/75）。

3 討論

隨著規(guī)模化養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，病毒感染在養(yǎng)雞業(yè)較為常見，尤其是NDV、IBDV 及IBV 感染，一直對養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展造成嚴(yán)重危害，禽類病毒病的流行特別是多種病毒病的混合感染，而其病理變化和臨床特征均十分相似，實際工作中難以區(qū)分給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[16-18]。臨床上這3 種病原混合感染的情況日益增多，常規(guī)診斷診斷方法難以滿足臨床診斷的需要。mPCR 是在普通PCR 的基礎(chǔ)上，在同一個反應(yīng)體系中加入不同的引物對，針對不同的模板或同一模板的不同區(qū)域進行特異性的擴增，從而得到多個目的片段，結(jié)合一定的檢測手段進而實現(xiàn)同時對多個靶標(biāo)進行診斷的技術(shù)[19]。和普通PCR 相比，mPCR 不但保留了高特異性、高敏感性的優(yōu)點，且操作更加簡潔快速，省時省力，已成功應(yīng)用于基因檢測的多個領(lǐng)域，包括轉(zhuǎn)基因鑒定、食品檢測、病原體檢測、腫瘤診斷等[20]。

圖4 NDV、IBV 和IBDV 三重退火溫度優(yōu)化

圖5 NDV、IBDV 和IBV 三重RT-PCR 特異性優(yōu)化

圖6 NDV、IBDV 和IBV 三重RT-PCR 敏感性

本研究參考Gen Bank 中雞新城疫、傳染性法氏囊和傳染性支氣管炎相應(yīng)靶基因的保守序列設(shè)計特異性引物。選擇新城疫NP 基因，傳染性法氏囊VP 基因，傳染性支氣管炎N 基因作為靶序列，應(yīng)用Primer Premier5.0 分別設(shè)計3 對特異性引物，通過NCBI BLAST 比對和DNAStar 軟件分析確保不同引物對之間沒有同源關(guān)系，不會形成穩(wěn)定的引物二聚體。分別設(shè)計3 個目的片段為144bp、429bp、600bp，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后大小之差約在200bp 左右，使目的片段分布在Marker 不同標(biāo)尺大小的區(qū)域，具有辨識度，不易造成誤判[21]。多重PCR技術(shù)的反應(yīng)體系較常規(guī)PCR 有較高的要求，們在對本研究中的每種待檢病毒進行普通PCR 檢測成功的基礎(chǔ)上，通過不斷優(yōu)化反應(yīng)體系及反應(yīng)程序中的退火溫度，確保每一重的擴增效率保持一致，以降低引物二聚體甚至多聚體的形成。且在試驗過程中選取了沙門氏菌核酸、大腸桿菌核酸、禽白血病病毒核酸以及禽支原體核酸進行特異性檢測，結(jié)果均未檢出這幾類常見禽類病原核酸，證實了本試驗建立的mPCR 具有較好的特異性。同時本研究在單一RT-PCR 檢測方法的基礎(chǔ)上，建立了一步法多重RT-PCR，在一個反應(yīng)體系中進行反轉(zhuǎn)錄（RT）與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），節(jié)省了時間和操作步驟，大大提高了病原檢測的效率。在本研究中，不僅可以從組織器官、排泄物、鼻腔拭子以及細(xì)胞培養(yǎng)物等臨床樣本中提取到病毒總RNA，還可以直接從血清、全血等血液樣本中提取出病毒總RNA。本研究建立的一步法多重RT-PCR 方法特異性強，敏感性比較高，其最低RNA 檢測下限達(dá)到了NDV6.18×101copies/μl、IBDV8.64×106copies/μl 和IBV2.57×102copies/μl，可以用來檢測血清中含量較低的NDV、IBDV 和IBV，因此，本方法可以用于血清病原篩查，可應(yīng)用于臨床大樣本量的快速檢測。

利用本研究中建立的多重RT-PCR 方法，對采集自貴州省不同時間和地點的疑似雞呼吸道癥狀的雞場的胚胎、內(nèi)臟、血液、血清和泄殖腔拭子，在75 份樣品中，其中病毒單一感染率為46.6% （35/75），NDV 與IBDV 的二重感染陽性率為16.0% （12/75），NDV 與IBV 的二重感染率為14.6% （11/75），IBDV 和IBV 的二重感染率為10.6% （8/75），NDV、IBDV 和IBV 的三重感染率為5.3% （4/75）。經(jīng)RT-PCR 檢測為陽性的樣本PCR 產(chǎn)物，進一步進行克隆回收純化，進一步進行DNA序列驗證，結(jié)果均與NDV、IBDV 和IBV 目的片段一致。上述研究表明，本研究建立的多重RT-PCR 檢測方法敏感性高、特異強，可應(yīng)用于臨床NDV、IBDV 和IBV 的大樣本檢測，為基層獸醫(yī)工作者開展NDV、IBDV 和IBV 的診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了有效的診斷方法。同時，建立的方法可以用于引種檢疫。

需要注意的是，雞場在防控常見病毒性疫病時免疫接種弱毒疫苗，如新城疫、傳染性法氏囊都有弱毒疫苗，疫苗免疫可能會影響對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確判定。弱毒疫苗株可能會造成多重RT-PCR 檢測出現(xiàn)假陽性結(jié)果，這也是流行病學(xué)調(diào)查許多禽畜傳染病時的一個難題[22]。所以在使用該技術(shù)時，應(yīng)考慮疫苗接種史，緊密結(jié)合臨床癥狀、解剖病變及流行病學(xué)進行綜合診斷，必要時對擴增產(chǎn)物進行基因測序，以幫助正確判斷疫情。