福建白兔胎兒成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)和鑒定

陳冬金 王錦祥 孫世坤 陳巖鋒 桑雷 謝喜平

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 350013)

福建白兔是福建省地方優(yōu)良兔品種之一，2014 年列入國家畜禽遺傳資源保護(hù)名錄[1]。該品種全身被毛白色，體型較小，具有良好的繁殖性能、較強(qiáng)的抗病力、優(yōu)質(zhì)的肉品質(zhì)等優(yōu)點。當(dāng)前對福建白兔種質(zhì)資源保護(hù)、開發(fā)利用已成為福建白兔產(chǎn)業(yè)發(fā)展的共性需求。而相對于傳統(tǒng)的畜禽保種場建設(shè)，體細(xì)胞保存具有成本低、占地少等明顯優(yōu)勢。同時，建立福建白兔體細(xì)胞系對開展體細(xì)胞克隆、基因編輯、細(xì)胞水平功能等生物技術(shù)研究具有重要意義。

動物體細(xì)胞是生產(chǎn)克隆動物?轉(zhuǎn)基因動物及基因編輯等分子生物學(xué)研究重要的細(xì)胞來源。動物胎兒成纖維細(xì)胞目前成為最常用的細(xì)胞之一，其與成年成纖維細(xì)胞相比具有以下優(yōu)點：體外分離較容易、培養(yǎng)生長速度較快、純度較高、易進(jìn)行基因編輯等優(yōu)點[2]、國內(nèi)已有灘羊[3]、昆明犬[4]、廣靈驢[5]、豬[6]、牛[7]等胎兒成纖維細(xì)胞系。以胎兒成纖維細(xì)胞為供體，已成功克隆出豬[8]、牛[9]和山羊[10]等此外，胎兒成纖維細(xì)胞為不同物質(zhì)在細(xì)胞水平的功能研究提供了載體，如BALAJI S等[11]研究白介素-10 和透明質(zhì)酸在小鼠胎兒成纖維細(xì)胞功能中的作用，WANG X 等[12]研究富含ras 同源基因與fk506 結(jié)合蛋白38 在山羊胎兒成纖維細(xì)胞中的直接相互作用。

家兔是毛用和肉用兼用型、節(jié)糧型的傳統(tǒng)經(jīng)濟(jì)動物和草食動物。其飼草轉(zhuǎn)化率較高，適宜農(nóng)村養(yǎng)殖，是農(nóng)村脫貧致富的首選畜牧產(chǎn)業(yè)之一，發(fā)展家兔產(chǎn)業(yè)對中國畜牧業(yè)轉(zhuǎn)型升級具有重要作用。同時，兔由于其理化性能、調(diào)控機(jī)制和人類較相似，而且體型適中，是醫(yī)學(xué)上常用的試驗?zāi)Ｊ絼游颷13]。福建白兔與新西蘭白兔相比，理化參數(shù)大部分相近，但其體型較小，成本低，有望開發(fā)成醫(yī)學(xué)實驗動物[14]。在兔的干細(xì)胞[15-17]、轉(zhuǎn)基因兔[18，19]和克隆兔[20]方面的研究已取得較好的進(jìn)展。本試驗以20d 的福建白兔胎兒組織為研究對象，采用組織貼壁和酶消化法分離細(xì)胞、利用免疫熒光鑒定技術(shù)福建白兔胎兒成纖維細(xì)胞，以期為福建白兔種質(zhì)資源保存、開發(fā)利用和相關(guān)分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）試驗動物：懷孕20d 的福建白兔，購自福建省龍巖市武平縣武東鎮(zhèn)茶頭嶺福建白兔生態(tài)養(yǎng)殖場。

（2）試驗試劑：培養(yǎng)基DMEM/F12、青霉素/鏈霉素溶液、PBS、胎牛血清FBS、武漢博士德抗體（纖維連接蛋白、角蛋白）等。

（3）試驗儀器：潔凈工作臺SW-CJ-1D，CO2培養(yǎng)箱，移液器等。

1.2 試驗方法

1.2.1 福建白兔胎兒成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

使用酶消化法、細(xì)胞懸液培養(yǎng)法和組織塊貼壁法對福建白兔胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行分離：采集胎兔，用75%的酒精消毒2～3 遍，然后用含雙抗的PBS 洗滌3～4 次，去除頭部、四肢、內(nèi)臟及脂肪，將剩余的組織剪成約1mm3 大小的組織塊，加入0.25%胰酶37℃消化5min，800rpm 離心3min 棄上清液。加入200IU/ml 的Ⅰ型膠原酶在37℃消化15min （期間每隔2min 輕輕吹打消化中的組織塊），加入培養(yǎng)液（含有15%FBS 1%雙抗的DMEM/F12 溶液）輕輕混勻后，300rpm 離心3min。細(xì)胞懸液培養(yǎng)：離心的上清液加入至培養(yǎng)瓶中，加培養(yǎng)液正常培養(yǎng)。組織塊貼壁培養(yǎng)：離心的絮狀沉淀組織塊均勻接種于含有1ml 培養(yǎng)液的T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每個培養(yǎng)瓶均勻放置9 個組織塊，置于37℃，5%CO2，60%～80%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，待組織塊貼于培養(yǎng)瓶后加入含有7ml 培養(yǎng)液再培養(yǎng)，每隔4～6h換一次培養(yǎng)液，用于去掉懸浮的脂肪等其他雜質(zhì)組織，連續(xù)換液4～5 次后正常培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2.2 福建白兔胎兒成纖維細(xì)胞傳代和凍存

細(xì)胞生長匯合至85%～90%時，棄掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用復(fù)溫的PBS 洗滌兩次，加入1ml 的0.25%胰酶，于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中消化，大約3～5min 顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，細(xì)胞變圓但未漂浮起來時，立即加入適量的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打使細(xì)胞脫落，收集培養(yǎng)液，800rpm 離心3min 棄上清液。消化下來的細(xì)胞可以用于傳代或凍存。傳代：消化下來的細(xì)胞用適量10%胎牛血清1%雙抗DMEM/F12 培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，將懸液按一定比例(1：3) 接種于新的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，通過2～3 次選擇傳代，可進(jìn)一步純化成纖維細(xì)胞，形成成纖維細(xì)胞系[21]。凍存：消化下來的細(xì)胞加入配置好的細(xì)胞凍存液（DMSO：完全培養(yǎng)液：血清=1：2：7）重懸細(xì)胞沉淀后取1ml 加入滅菌的凍存管中，封口膜嚴(yán)密封口，做好記號，并放于凍存盒中，放在4℃冰箱中1h，-80℃冰箱24h后，移出放于液氮中分類保存。

1.2.3 福建白兔胎兒成纖維細(xì)胞的復(fù)蘇

將凍存管從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中輕輕晃動凍存管，使細(xì)胞懸液完全溶解，并吸入到預(yù)先加2ml 的含有20%FBS 1%雙抗的DMEM/F12 溶液的離心管中，800rpm 離心3min 棄上清液，再用完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，吸入到新的培養(yǎng)瓶中，加入8ml 完全培養(yǎng)液，于37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并檢測復(fù)蘇存活率。

1.2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

光學(xué)顯微鏡下觀察兔胎兒成纖維細(xì)胞生長形態(tài)。

1.2.5 生長曲線測定

消化對數(shù)生長期的成纖維細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，計數(shù)后用培養(yǎng)液稀釋，將細(xì)胞密度調(diào)整為1.0×104個/ml，接種于24 孔板中、接種日期記為0d，每隔24h 細(xì)胞計數(shù)一次，每次計3 孔取平均值，共計9d。以細(xì)胞生長時間為橫軸，細(xì)胞數(shù)量為縱軸繪制生長曲線。

1.2.6 兔胎兒成纖維細(xì)胞的免疫熒光鑒定

武漢博士德的纖維連接蛋白fibronectin、武漢博士德的角蛋白cytokeratin、Invitrogen 的Goat anti-Rabbit IgG (H+L) 的抗體，試驗步驟如下。清洗：取出細(xì)胞爬片，吸棄培養(yǎng)液，細(xì)胞爬片用PBS 振蕩洗3 次，每次5min；固定：用4%多聚甲醛覆蓋細(xì)胞爬片，室溫下固定15min，吸棄4%多聚甲醛，用PBS漂洗3 次，每次5min；透膜：用新鮮配制的含0.2% Triton-X-100 的PBS 在4℃通透化處理15min，用PBS 漂洗1 次，每次5min；封閉：用封閉液（即含5% BSA 的PBS）覆蓋細(xì)胞爬片，37℃孵育1h；一抗孵育：用封閉液按1:50 稀釋一抗，24 孔板中每個孔加入500μl 已稀釋的一抗，4℃孵育過夜；回收一抗：用清洗液（即含0.02% Tween20 的PBS）漂洗細(xì)胞爬片3 次，每次5min；二抗孵育：用封閉液按1:100 稀釋二抗，用鋁箔紙包裹后在37℃孵育30min；去除二抗，用清洗液漂洗細(xì)胞3 次，每次5min；DAPI 復(fù)染：用PBS 按1:1000 稀釋DAPI，室溫避光孵育30min，去除DAPI 染液，加入PBS 緩沖液；封片：加入甘油，放入濕盒中4℃避光保存；觀察：在熒光顯微鏡下觀察玻片，用合適波段激發(fā)，拍照并保存試驗結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 兔胎兒成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

細(xì)胞懸液法分離的細(xì)胞：在懸浮細(xì)胞培養(yǎng)6h 后，觀察到大部分細(xì)胞貼壁，形態(tài)呈現(xiàn)圓形，未展開。培養(yǎng)4d 后，細(xì)胞基本貼壁，形態(tài)不規(guī)則，呈多角形、梭形、扇形等，為典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)。培養(yǎng)9～10d 后，細(xì)胞生長旺盛，密度達(dá)到85%～90%，開始消化或凍存細(xì)胞得以保種。

用組織貼壁分離的細(xì)胞：發(fā)現(xiàn)組織塊貼壁2d 后就可在組織塊周圍看到明顯的成纖維細(xì)胞，此時游離出來的細(xì)胞呈梭形、紡錘形或者不規(guī)則多角形，周圍有少量上皮細(xì)胞，胞核清晰。培養(yǎng)第4 天，組織塊周圍有大量的成纖維細(xì)胞，成纖維細(xì)胞群開始向外分裂生長，此時細(xì)胞呈典型的多邊形和長梭形；培養(yǎng)第8 天，組織塊中基本不再游離出細(xì)胞，原游離的細(xì)胞呈現(xiàn)群體依賴性生長，呈典型的多邊形和梭形，此時細(xì)胞可生長成單層，漩渦狀排列或縱橫交錯，貼壁的細(xì)胞團(tuán)呈放射狀生長。第9 天由組織塊移出的單層細(xì)胞鋪滿瓶底，可消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞形態(tài)圖，見圖1。

2.2 細(xì)胞生長曲線

由圖2 可知，福建白兔成纖維細(xì)胞的生長曲線呈典型的S型，分為典型的4 個生長階段：潛伏生長期、對數(shù)生長期、平臺期及衰亡期。0～2d 細(xì)胞生長比較慢，處在潛伏期；第3 天細(xì)胞數(shù)量開始增加，3～8d 細(xì)胞快速增長，進(jìn)入對數(shù)生長期；8～9d細(xì)胞生長緩慢，處在平臺期；第9 天后細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞進(jìn)入衰亡期。從生長曲線上圖2 可分析出，原代胎兒成纖維細(xì)胞群體倍增時間約為36h。

2.3 復(fù)蘇存活率

成纖維細(xì)胞凍存前和凍存后的細(xì)胞活率大約為95%，凍存前后的細(xì)胞存活率差異不顯著。

2.4 免疫熒光鑒定兔胎兒成纖維細(xì)胞

圖1 福建白兔胎兒成纖維細(xì)胞生長形態(tài)(100x)

圖2 福建白兔原代成纖維細(xì)胞生長曲線

細(xì)胞角蛋白染色為陰性，見圖3-A1、A2、A3；纖維連接蛋白染色為陽性，見圖3-B1、B2、B3；這結(jié)果說明分離出來的兔胎兒成纖維細(xì)胞純度較高，活性較好。

3 討論

3.1 福建白兔胎兒日齡的選擇

福建白兔90 日齡成年體重（1514.44g）比中型新西蘭白兔同期體重（2034.42g）小且差異顯著[14]，其胎兒體重也比較小。研究表明，12～18d 的胎兒都可作為兔胎兒成纖維細(xì)胞的來源[22，23]，故本試驗選擇福建白兔20 日齡的胎兒作為試驗材料。

3.2 成纖維細(xì)胞分離方法的選擇

圖3 福建白兔胎兒成纖維細(xì)胞免疫熒光檢測(100x)

當(dāng)前對胎兒成纖維細(xì)胞的分離主要是采用組織貼壁法和酶消化法，或者兩者同時使用[3,24]。本試驗細(xì)胞分離采用兩種方法：首先是用胰酶消化，再用Ⅰ型膠原酶消化，然后一種是用消化好的細(xì)胞懸液直接培養(yǎng)分離成纖維細(xì)胞，另一種是用消化好的組織塊貼壁進(jìn)行分離培養(yǎng)細(xì)胞。兩種方法分離出來的原代細(xì)胞進(jìn)行對比：在形態(tài)上組織貼壁分離的細(xì)胞長得更整齊，生長速度上細(xì)胞懸液分離的細(xì)胞生長速度更快；但經(jīng)過2 代培養(yǎng)后，這兩種方法分離的細(xì)胞生長速度和形態(tài)就沒有較大區(qū)別，這與劉西梅等對成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)研究結(jié)果相近[25]。

3.3 免疫熒光檢測對細(xì)胞進(jìn)行鑒定

本試驗除了從細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生長曲線圖對細(xì)胞進(jìn)行鑒定，均符合成纖維細(xì)胞特性外，還采用免疫熒光法進(jìn)行鑒定。纖維連接蛋白是成纖維細(xì)胞的標(biāo)志之一，角蛋白是上皮細(xì)胞的標(biāo)志之一[26]，采用了纖維連接蛋白和角蛋白對福建白兔胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示纖維連接蛋白染色結(jié)果陽性，表明該細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞；細(xì)胞角蛋白染色呈陰性，說明沒有被上皮細(xì)胞污染。

4 結(jié)論

福建白兔是我國地方優(yōu)良兔品種，本試驗采用組織塊貼壁法和酶消化法成功分離了福建白兔胎兒成纖維細(xì)胞，并利用免疫熒光進(jìn)行鑒定，初步建立了福建白兔胎兒成纖維細(xì)胞系，為今后開展福建白兔種質(zhì)資源的保存、體細(xì)胞克隆、轉(zhuǎn)基因兔及基因敲除等試驗奠定基礎(chǔ)。