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    芒果苷對(duì)不同血凝素(HA)亞型流感病毒的抑制作用研究

    2020-11-28 07:51:53邱泰坤安維婕何紅玉況凌楓羅茂丹蔣立
    商情 2020年8期
    關(guān)鍵詞:血凝素吸附流感病毒

    邱泰坤 安維婕 何紅玉 況凌楓 羅茂丹 蔣立

    【摘要】目的:研究芒果苷對(duì)不同血凝素(HA)亞型流感病毒吸附及復(fù)制過(guò)程抑制作用。方法:使用A/Puerto Rico/8/34毒株為骨架,將流感病毒HA基因片段替換為H1、H4、和H7亞型,通過(guò)反向遺傳技術(shù),構(gòu)建不同HA亞型的重組流感病毒。使用定量RT -PCR方法檢測(cè)芒果苷在不同給藥方式下病毒復(fù)制情況,從而判斷該藥物對(duì)不同HA亞型流感病毒的抑制作用。結(jié)果:在病毒吸附過(guò)程中加入芒果苷后,使用不合藥物的維持液,病毒的復(fù)制拷貝數(shù)不受影響。然而,在含芒果苷的維持液中,病毒復(fù)制的拷貝數(shù)明顯低于單純病毒對(duì)照組。結(jié)論:芒果苷對(duì)不同HA亞型的流感病毒的吸附過(guò)程沒(méi)有特異性的抑制作用。其作用靶點(diǎn)可能在病毒進(jìn)入細(xì)胞后的復(fù)制過(guò)程。

    【關(guān)鍵詞】芒果苷 流感病毒 血凝素 吸附

    一、背景

    流行性感冒(influenza,流感)是流感病毒引起的急性呼吸道感染癥候群。引起該病的病毒,可分為甲,乙,丙三型。其中甲型流感病毒由于其抗原經(jīng)常發(fā)生變異,且傳播迅速,極易造成世界范圍的大流行。近年來(lái),有關(guān)抗流感病毒中藥的研究日益增多,從中篩選有效成分已成為當(dāng)前新藥研發(fā)的一個(gè)熱點(diǎn)。

    芒果苷( mangiferin),又名“莞知母寧”,是一種四羥基毗酮的碳糖苷。現(xiàn)代研究表明芒果苷具有抗炎,抗氧化,抗病毒,保肝利膽,免疫調(diào)節(jié),抗糖尿病、抗腫瘤等多方面作用。芒果苷抗病毒活性也得到了部分驗(yàn)證。體外實(shí)驗(yàn)研究顯示,芒果苷能夠抑制HIV-1蛋白酶活性,并具有降低皰疹I(lǐng)、II型病毒對(duì)宿主細(xì)胞的吸附的作用。體內(nèi)試驗(yàn)研究顯示,芒果苷能夠抑制鴨乙肝病毒感染,且停藥后不易出現(xiàn)反跳現(xiàn)象。在對(duì)抗流感病毒方面,芒果苷能夠明顯延長(zhǎng)小鼠平均存活時(shí)間,具有綜合抑制流感病毒作用。然而這些研究并沒(méi)有詳細(xì)的闡明芒果苷抗流感病毒的分子機(jī)制。本研究將針對(duì)流感病毒對(duì)宿主細(xì)胞的吸附及復(fù)制過(guò)程,使用A/Puerto Rico/8/34 (HIN1,PR8)毒株為骨架,將流感病毒HA基因片段替換為H1、H4、和H7亞型。通過(guò)反向遺傳技術(shù),統(tǒng)一流感病毒內(nèi)部基因。使用定量RT-PCR方法對(duì)病毒繁殖進(jìn)行定量分析,從而判斷芒果苷對(duì)不同HA亞型流感病毒的抑制作用。

    二、材料與方法

    1.材料

    病毒:流感病毒PR8毒株骨架及pHW2000質(zhì)粒由美國(guó)St.JudeChildren Research Hospital,Richard Webby教授惠贈(zèng)。A/Duck/ShanTou/461/2000 (H4N9)HA基因片段由泰國(guó)Mahidol University,Pi-laipan Puthavathana教授惠贈(zèng)。A/Anhui/l/2013 (H7N9)毒株HA基因片段由中國(guó)流感中心舒躍龍教授惠贈(zèng)。

    藥物:芒果苷,中國(guó)食品藥品檢定研究院。

    2.方法

    反向遺傳病毒構(gòu)建:分別將不同亞型HA(H1、H4、H7)克隆到pHW-2000質(zhì)粒上,再分別與流感病毒PR8的其他7個(gè)基因片段質(zhì)粒,使用TransIT⑩-LTI共轉(zhuǎn)染到聯(lián)合培養(yǎng)的MDCK和HEK-293T細(xì)胞中,獲得的重組流感病毒(rgHI-PR8,rgH4-PR8,rgH7-PR8)將進(jìn)一步在MDCK細(xì)胞中進(jìn)行增殖。

    藥物細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

    將MDCK細(xì)胞接種于96孔板,加入不同濃度的芒果苷,37℃5%CO2孵育72小時(shí)后,使用MTT比色法檢測(cè)其對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性,使用Reed-Iuench法計(jì)算半數(shù)中毒濃度(TC50)。

    病毒感染性測(cè)定

    將MDCK細(xì)胞接種6孔板,病毒行10倍稀釋后接種細(xì)胞中,使用微晶纖維素作為覆蓋系統(tǒng),培養(yǎng)72小時(shí),然后使用10%福爾馬林溶液固定,結(jié)晶紫染色液。一個(gè)蝕斑代表一個(gè)病毒體的繁殖后代品系,對(duì)活性病毒顆粒進(jìn)行定量。

    實(shí)時(shí)熒光RT-PCR(real-time RT-PCR)試驗(yàn)

    將病毒培養(yǎng)液使用QIAGEN RNeasy Mini Kit對(duì)病毒RNA進(jìn)行提取。使用QuantiTectTM Probe RT-PCR Kit -步法real-timeRT-PCR進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)體積為20μI,使用流感RNP基因通用引物進(jìn)行病毒核酸擴(kuò)增,上游引物:5-AGA TI'T CCA CCT GCG ACC G一3;下游引物:5-CAG CGG CTC TCT CCA CAA GT一3。以細(xì)胞CAPDH基因?yàn)閮?nèi)對(duì)照,上游引物:5-GGT GAA CCT CCC TGTCAA CG-3;下游引物:5-CTC CCT CCT CCA ACA TGC TG-3。反應(yīng)條件為:42。C 5min,95。C lOsec,95。C 5sec,60。C 34sec,共40個(gè)循環(huán)。采用相對(duì)定量的方法,△△Ct=(待測(cè)組目的基因Ct值.待測(cè)組內(nèi)參基因Ct值).(對(duì)照組目的基因Ct值.對(duì)照組內(nèi)參基因Ct值),相對(duì)含量變化=2-△△Ct。

    病毒感染與加藥

    使用6孔細(xì)胞板,分別將重組流感病毒(rgHl-PR8,rgH4 -PR8.rgH7-PR8)以MOI=O.01量與芒果苷0.8mg/ml使用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液1ml進(jìn)行混合,將混合液加入MDCK細(xì)胞中,37℃吸附1.5小時(shí),吸去培養(yǎng)液。此時(shí)病毒感染的細(xì)胞分為兩組,其中一組加入不含芒果苷DMEM維持液2ml進(jìn)行維持,另一組使用含芒果苷0.8mg/ml的DMEM維持液2ml進(jìn)行維持。維持72小時(shí)后,使用real-time RT-PCR對(duì)病毒復(fù)制情況進(jìn)行定量分析。

    統(tǒng)計(jì)方法

    采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x+s)表示;兩兩比較用t檢驗(yàn),p<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    三、結(jié)果

    知母寧不同加藥方式的抗病毒作用

    重組流感病毒rgHI-PR8,rgH4-PR8,rgH7-PR8均能在MDCK細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制。根據(jù)藥物細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)測(cè)得MDCK細(xì)胞對(duì)芒果苷半數(shù)中毒濃度為2.87mg/ml。本試驗(yàn)使用中濃度0.8mg/ml進(jìn)行流感病毒拷貝數(shù)變化觀察。

    試驗(yàn)結(jié)果顯示,所有三個(gè)不同HA亞型重組流感病毒在與細(xì)胞吸附過(guò)程中加入芒果苷后,使用不含芒果苷維持液進(jìn)行病毒培養(yǎng)(病毒+芒果苷+不含芒果苷維持液),與各自病毒對(duì)照組進(jìn)行比較,病毒拷貝數(shù)不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。然而在使用含芒果苷的維持液培養(yǎng)后,病毒的拷貝數(shù)明顯低于單純病毒組。

    四、討論

    芒果苷至今仍未被開(kāi)發(fā)為臨床藥物的原因之一是其藥理作用泛而弱,定位不突出。本研究圍繞流感病毒在細(xì)胞中的吸附和復(fù)制過(guò)程,通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察了芒果苷的抗流感病毒的作用。

    本研究顯示芒果苷對(duì)不同HA亞型流感病毒的吸附過(guò)程沒(méi)有特異性的抑制作用,但由于流感病毒的感染過(guò)程還包括膜融合、脫殼、核蛋白復(fù)合物入核、基因組的復(fù)制、組裝、出芽和釋放等步驟。因此,芒果苷作用的靶點(diǎn)還有待進(jìn)一步研究。

    本研究揭示芒果苷在病毒進(jìn)入細(xì)胞后的復(fù)制過(guò)程中起到了抑制作用。除了以上提到的病毒自身復(fù)制的步驟可能會(huì)受到影響外,從宿主細(xì)胞層面,芒果苷能對(duì)細(xì)胞MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中ERK、JNK、p38蛋白含量及磷酸化水平的產(chǎn)生影響。由于這些信號(hào)通路的活化能夠直接影響流感病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。因此芒果苷抗流感病毒的藥理機(jī)制也需要考慮其對(duì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制。

    根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,可判斷芒果苷對(duì)不同HA亞型流感病毒的吸附過(guò)程沒(méi)有特異性的抑制作用,其作用靶點(diǎn)可能在病毒進(jìn)入細(xì)胞后的復(fù)制過(guò)程。

    參考文獻(xiàn):

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    基金資助:貴州中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(貴中醫(yī)大創(chuàng)合字(2019)-53號(hào))。

    作者簡(jiǎn)介:邱泰坤、安維婕、何紅玉、況凌楓、羅茂丹:在讀本科生。通訊作者:蔣立(1980-),男,土家族,貴州人,課題指導(dǎo)老師,副主任檢驗(yàn)技師,博士,研究方向:中醫(yī)藥抗病毒。

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