中藥血竭UPLC指紋圖譜與主成分分析研究

魏荷琳 肖隆祥 封家福 吳亮

【摘要】血揭是傳統(tǒng)中藥，有進(jìn)口血竭和國產(chǎn)血揭之分，但兩者外觀相似。為了準(zhǔn)確鑒定兩種血竭，以保證用藥安全，本研究采用超高效液相色譜（UPLC）方法對5批進(jìn)口血竭樣品和5批國產(chǎn)血竭樣品進(jìn)行了分析，計(jì)算共有峰的相對保留時間（RRT）和相對峰面積（EPA）。通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)對色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行相似度和主成分分析。結(jié)果證明，該UPLC方法具有良好的準(zhǔn)確度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。進(jìn)口血竭RRT的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于0.17%，國產(chǎn)血竭RRT的RSD小于0.06%，證明UPLC指紋圖譜方法準(zhǔn)確。進(jìn)口血竭EPA的RSD為32.78-70.43%，國產(chǎn)血竭RPA的RSD為22.30-60.31%，說明血竭的化學(xué)成分的含量差異較大。相似度分析的結(jié)果顯示，相同產(chǎn)地血竭的相似度較高，不同產(chǎn)地血竭的指紋圖譜有明顯差異;主成分分析能明顯區(qū)分兩種不同產(chǎn)地的血竭。本研究有助于不同來源血竭的準(zhǔn)確鑒定，并為其質(zhì)量評價與安全用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】血竭 超高效液相色譜 指紋圖譜 主成分分析

血竭為傳統(tǒng)中醫(yī)活血化瘀名貴藥，《本草綱目》以“麒鱗竭”為其正名。《綱目》云：“騏麟竭，木之脂液，如人之膏血，其味甘咸而走血;血竭除血痛，為活血之圣藥是矣?！??！吨袊幍洹罚?015年版，1部）記載，血竭具有活由定痛，化疲生肌之功效，內(nèi)服主要用于心腹瘀痛，外用主治跌打損傷等病癥。目前，中國市售血竭有進(jìn)口血竭和國產(chǎn)血竭兩種：進(jìn)口血竭來源于棕櫚科黃藤屬植物麒麟竭（Dae-monorops draco，RDD）果實(shí)滲出的樹脂，國產(chǎn)血竭來源于百合科龍血樹屬植物劍葉龍血樹（Dracaena cochinchinensis，RDC）莖干提取的樹脂[。很顯然，進(jìn)口血竭和國產(chǎn)血竭的植物來源不同，兩者化學(xué)組成是否具有差異，以及能否相互替代使用目前也還有諸多疑問。

中藥指紋圖譜技術(shù)是評價中藥優(yōu)劣、鑒別真?zhèn)?、區(qū)分物種和確保其一致性和穩(wěn)定性的有效方法。中藥指紋圖譜技術(shù)的理論體系和方法是解析中藥的主導(dǎo)技術(shù)和實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的核心力量，該體系理論和技術(shù)的成熟及完善可為現(xiàn)代中藥創(chuàng)制提供強(qiáng)有力的理論和日支術(shù)支撐。隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的發(fā)展，中藥指紋圖譜技術(shù)在研究中藥有效成分、控制中藥質(zhì)量以及鑒別方面越來越成熟，已得到國際上廣泛的認(rèn)可。

為明確區(qū)分兩種不同植物來源的血竭，探索其活性成分，本研究應(yīng)用超高效液相色譜（UPLC）對進(jìn)口血竭及國產(chǎn)血竭的指紋圖譜技術(shù)，通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)對色譜數(shù)據(jù)對進(jìn)口血竭和國產(chǎn)血竭進(jìn)行相似度評價和主成分分析。

1 材料與方法

1.1 藥材與試劑

5批進(jìn)口血竭和5批國產(chǎn)血竭為市場收集，經(jīng)樂山師范學(xué)院陳封政教授鑒定為麒麟竭Daemonorops draco果實(shí)以及劍葉龍血樹Dracaena cochinchinensis莖干的樹脂。

乙腈，甲醇和甲酸從Lab-scan （Bangkok，Thailand）購得，去離子水由Milli-Q水凈化系統(tǒng)（Millipore，Bedford，MA，USA）獲得。

1.2 儀器

1875HTAG TRU-SWEEP型超聲波清洗機(jī)（Crest，New York，USA）、5810離心機(jī)（Eppendorf，Hamburg，Germany）、粉碎機(jī)（RT-04，F(xiàn)argo，Taiwan）和Adventurer電子秤（OHAUS，USA）。 Waters AcquityUPLC超高效液相色譜儀配備真空脫氣器、四級泵、自動取樣器、柱溫箱和紫外檢測器。EPOWER PRO色譜工作站用于數(shù)據(jù)采集和處理。BEH C18柱（2.1mm×100mm，1.8μm）用于樣品分離。

1.3 色譜條件

以0.1甲酸水溶液（A）和1%甲酸乙腈（B）為流動相，用UPLC梯度洗脫分離。流速為0.3mL/min;柱溫設(shè)定為40oC，檢測波民為280nm，進(jìn)樣量為1μL。梯度洗脫條件如下：0-8min，15-20% B;8-30min，20-68% B;30-30.5min，100% B;30.5-35min，100% B;35-35.5min，100-15% B;35.5-40min，15% B。

1.4 供試品溶液的制備

粉碎10批血竭樣品，將粉末通過20目篩，在室溫下真空干燥至恒重。取樣品0.1g，精密稱定置25mL離心管中，精密加入100%甲醇10mL，擰緊瓶蓋混勻，在室溫下超聲萃?。üβ?70kw，頻率40k Hz）30分鐘，放冷，轉(zhuǎn)移至離心機(jī)，于3500r/min條件下離心10min，冷卻后，將上清液過濾轉(zhuǎn)移到25mL容量瓶中，藥渣再加10mL100%甲醇按上述重復(fù)萃取1次，兩次得到的上清液用100%甲醇定容至25mL，搖勻靜置30min。提取液用孔徑為0.22μm的濾膜過濾后，進(jìn)行UPLC分析。

1.5 方法學(xué)考察

1.5.1 精密度試驗(yàn)

分別取進(jìn)口血竭和國產(chǎn)血竭供試品各一批，按“1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析6次，記錄色譜圖，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”，以各自活險成分為參照峰，計(jì)算各共有峰陽對峰面積的RSD和相對保留時間的RSD。

1.5.2 重復(fù)性試驗(yàn)

分別取進(jìn)口血竭和國產(chǎn)血竭供試品各一批，按“1.4”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以各自活勝成分為參照峰，計(jì)算各共有峰相對峰面積的RSD和相對保留時間的RSD。

1.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別取進(jìn)口血竭和國產(chǎn)血竭供試品各一批，按“1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在0、2、4、8、16、24 h按“1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以各自活性成分為參照峰，計(jì)算各共有峰相對峰面積的RSD和相對保留時間的RSDo

1.6 指紋圖譜建立及相似度評價

1.6.1 共有峰及參照峰的選擇

根據(jù)5批進(jìn)口血竭和5批國產(chǎn)血竭的UPLC色譜圖，進(jìn)口血竭發(fā)現(xiàn)9個共有峰，選擇，號峰作為參照峰。國產(chǎn)血竭發(fā)現(xiàn)7個共有峰，選擇7號峰作為參照峰，構(gòu)建進(jìn)口血竭和國產(chǎn)血竭UPLC色譜圖特征指紋圖譜，以此作為它們鑒別的依據(jù)。

1.6.2 相似度計(jì)算及對照指紋圖譜的生成

經(jīng)UPLC檢測得到5批進(jìn)口血竭和5批國產(chǎn)血竭指紋圖譜，見圖1。將5批進(jìn)口血竭和5批國產(chǎn)血竭樣品指紋圖譜分別導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，分別設(shè)置樣品RDD-1、RDC-1圖譜為參照圖譜，對照圖譜生成方法采用中位數(shù)法，時間窗寬度為0.1，自動匹配，生成對照指紋圖譜，與5批進(jìn)口血竭和5批國產(chǎn)血竭圖譜進(jìn)行比較，進(jìn)行相似度計(jì)算。

1.7 聚類分析和主成分分析

將標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)聚類分析和主成分分析前將。選擇第一和第二個主分量繪制主成分分析的散點(diǎn)圖。聚類分析采用組間平均連接方法，用平方歐式距離來測量觀測距離矩陣。使用SPSS軟件（IBM SPSS Statistics 25，Armonk，USA！對所有樣本進(jìn)行聚類分析和主成分分析。

2 結(jié)果

2.1 檢測波長的選擇

紫外波長掃描用光電二極管陣列（PDA）探測器在280nm波長下對目標(biāo)峰具有較高的信噪比，選擇其作為檢測波長。

2.2 流動相的選擇

本研究采用0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相，具有良好的分辨率、適中的停留時間和平滑的基線。

2.3 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性

運(yùn)用穩(wěn)定性、精密度和重復(fù)性試驗(yàn)，對本方法的進(jìn)行綜合驗(yàn)證，結(jié)果為表1和表2。通過在儀器中用相同樣品注射六次來評估該方法的精確度。相對保留時間RRT為單個峰的保留時間與參考峰的保留時間之比。相對峰面積（RPA）為單個峰的保留峰面積與參考峰的保留峰面積之比。進(jìn)口血竭RRT的RSD小于0.10%;國產(chǎn)血竭RRT的RSD小于0.02%。該方法可認(rèn)為是可靠的。對同一個樣品進(jìn)行提取6次，來評估該方法的重復(fù)性。進(jìn)口血竭RRT的RSD值小于0.09%，國產(chǎn)血竭RR丁的RSD值分別為小于0.07%，表明該方法具有較高的重現(xiàn)性。在24小時穩(wěn)定性試驗(yàn)中，將相同的樣品分別在0、2、4、8、16和24小時進(jìn)行分析。進(jìn)口血竭RRT的RSD值小于0.08%，國產(chǎn)血竭RRT的RSD值小于0.17%。結(jié)果表明，樣品溶液在24小時內(nèi)穩(wěn)定。這些數(shù)據(jù)表明UPLC方法適用于血竭的定性和定量分析。

2.4 相似度分析

采用所建立的方法對10批血竭樣品進(jìn)行了分析，得到了U-PLC指紋圖譜。在所有分析的進(jìn)口血竭樣品中發(fā)現(xiàn)9個共有峰，國產(chǎn)血竭樣品中發(fā)現(xiàn)7個共有峰。用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012年版）分別計(jì)算進(jìn)口血竭9個共有峰和國產(chǎn)血竭7個共有峰的相對保留時間（RRT）和相對保留面積（RPA），結(jié)果總結(jié)在表3和表4。進(jìn)口血竭RRT的RSD值略微波動在0.04-0.17%的范圍內(nèi)，RSD值小于0.17%;而國產(chǎn)血竭RRT的RSD值略微波動在0.02-0.06%的范圍，RSD值小于0.06%，證明了兩者指紋圖譜分析的準(zhǔn)確性。進(jìn)口血竭RPA的RSD值在32.78-79.43%范圍，國產(chǎn)血竭RPA的RSD值在22.39-66.31%范圍，兩者波動均較大，說明不同產(chǎn)地的進(jìn)口血竭樣品里面的化學(xué)成分含量相差較大，國產(chǎn)血喝亦然。

圖1為10批血竭樣品的指紋圖譜，表5是進(jìn)口血竭和國產(chǎn)血竭的相似度分析。進(jìn)口血竭5個樣本的相似度為0.919-0.987范圍內(nèi)，國產(chǎn)血竭5個樣本的相似度為0.886-0.984范圍內(nèi)，表明各批次進(jìn)口血竭和國產(chǎn)血竭質(zhì)量相對穩(wěn)定。

2.5 主成分分析

將相似度評價系統(tǒng)計(jì)算的共有峰的相對峰面積代入主成分分析，進(jìn)口血竭樣品和國產(chǎn)血竭樣品通過散點(diǎn)圖進(jìn)行區(qū)分（圖2）。RDD-1、2、5和RDD-3、4各自分布得比較相近，而RDC-1、2、5和RDC-3、4各自分布得比較靠近，原因可能是不同來源的同種血竭的成分不同而導(dǎo)致的。

而且進(jìn)口血竭主要分布在散點(diǎn)圖的左上相限區(qū)域（RDD-1～RDD-5），國產(chǎn)血竭主要分布在右下相限區(qū)域（RDC-1～RDC-5），因此可以明顯得出進(jìn)口血蝎和國產(chǎn)血竭的成分具有明顯差異，分成兩組。

3 討論

5批進(jìn)口血竭樣品和5批國產(chǎn)血竭樣品的相似度都比較相近，所以能分別體現(xiàn)出5批血竭是同種血竭。

而進(jìn)口血竭和國產(chǎn)血竭的RRT的RSD值都比較小，能表現(xiàn)不同批次的同種血竭具有大部分相同的化學(xué)成分，它們的指紋圖譜均比較準(zhǔn)確。進(jìn)口血竭和國產(chǎn)血竭的RPA的RSD值分別的差異比較大，所以不同來源的同種血竭含有化學(xué)成分的含量明顯不同。因此，本研究提出的指紋圖譜方法適用于兩種藥物的種間鑒定和種內(nèi)一致性評價。進(jìn)口血竭和國產(chǎn)血竭具有的藥理作用有相同也有不同，而且對于相同的藥理作用藥效也有差異，況且它們的外觀相近，難以鑒別，所以開發(fā)一種中藥指紋圖譜方法來鑒定這兩種藥物不可或缺。中藥指紋圖譜技術(shù)是符合中醫(yī)理論及現(xiàn)狀的較好的質(zhì)量控制技術(shù)，它以指標(biāo)性成份峰作為標(biāo)記，結(jié)臺非指標(biāo)成份進(jìn)行比對，用來綜合評價藥物質(zhì)量，既符合中醫(yī)藥理論的整體觀點(diǎn)，也滿足了對中藥質(zhì)量的可控、保證其療效的要求。因此，中藥指紋圖譜不僅是一種中藥質(zhì)量控制模式和技術(shù)，更可以發(fā)展成為一種采用各種指紋圖語來進(jìn)行中藥理論（復(fù)雜系統(tǒng)）和新藥開發(fā)的研究體系和研究模式。

本研究UPLC指紋圖譜方法的建立為進(jìn)口血竭和國產(chǎn)血竭的質(zhì)量控制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，為血竭質(zhì)量評價和標(biāo)準(zhǔn)化提供有價值的參考。

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基金項(xiàng)目：本課題為四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（2018JC0445），藥食同源植物資源開發(fā)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金重點(diǎn)項(xiàng)目（10Y201810），樂山市科技局產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目（15CXY0012）和2018年樂山職業(yè)技術(shù)學(xué)院院級課題（KY2018005）階段性成果。

作者簡介：魏荷琳（1987.01-），女，漢族，講師，碩士研究生，現(xiàn)從事中藥相關(guān)專業(yè)教學(xué)、科研工作。