1株藏豬源莢膜血清D型多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及其生物學(xué)特性

貢嘎，王一飛，格桑卓瑪，索朗斯珠，尼瑪央宗，拉巴次仁

（1.西藏農(nóng)牧學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝860000；2.西藏自治區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，拉薩850000）

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）系巴氏 桿菌科（Pasteurellaceae）巴氏桿菌屬（Pasteurella）菌株，是一種常見的革蘭氏陰性菌，能夠感染人和多種動物的呼吸系統(tǒng)[1-3]而導(dǎo)致疾病，也是養(yǎng)豬業(yè)中常見的呼吸道傳染病之一。

目前，雖然多殺性巴氏桿菌的致病機(jī)制尚未完全研究清楚，但莢膜、脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）、外膜蛋白及毒素等在該菌致病過程中的作用已逐漸被證實(shí)[4-8]。多殺性巴氏桿菌莢膜血清抗原可分為A、B、D、E 和F 等5 個血清型[9]，在豬群中以A 型、B 型和D 型為主[10]，且其血清型與致病性之間有著一定的相關(guān)性。如：A型主要引起豬的肺炎，是最常見的血清型；B型主要引起豬的出血性敗血癥；D型主要引起豬的萎縮性鼻炎[11]。脂多糖是革蘭氏陰性菌外膜的組成成分，也是致病菌重要的毒力因子，在多數(shù)革蘭氏陰性菌感染過程中所必需。多殺性巴氏桿菌的LPS基因型有8種（L1～L8），其中L3和L6型是目前在我國豬群中流行的主要基因型，且以L6型為主。

藏豬是西藏高原生態(tài)環(huán)境中特有的高原型原始豬種。藏豬養(yǎng)殖業(yè)是西藏地區(qū)主要的經(jīng)濟(jì)支柱產(chǎn)業(yè)之一，但是目前仍以傳統(tǒng)的放牧飼養(yǎng)為主。國內(nèi)外至今鮮有關(guān)于藏豬多殺性巴氏桿菌的相關(guān)研究報道，且其流行情況尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)對無菌采集的病死藏豬的內(nèi)臟進(jìn)行多殺性巴氏桿菌分離鑒定，得到1株D型多殺性巴氏桿菌，并對其毒力基因分布情況進(jìn)行檢測，旨在為西藏藏豬巴氏桿菌的進(jìn)一步研究奠定理論基礎(chǔ)。

1.1 病料

從西藏某藏豬養(yǎng)殖基地?zé)o菌采集病死豬肺、扁桃體組織各30 份，共60 份。采用常規(guī)細(xì)菌分離法分離并進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）鑒定。

1.2 主要試劑和儀器

血瓊脂平板購自杭州微生物試劑有限公司；TaqDNA 聚合酶、GreenTaqMix、PCR 試劑、核酸染料Gel View、克隆載體pMD18-T 等購自日本TaKaRa公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基等購自生工生物工程（上海）股份有限公司。PCR 儀、凝膠成像系統(tǒng)、CX22LED 顯微鏡等均由西藏農(nóng)牧學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)

將采集的60 份病死藏豬的組織樣品分別接種于血瓊脂平板上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，選擇單菌落進(jìn)行染色鏡檢，然后純化培養(yǎng)。

1.4 細(xì)菌鑒定及莢膜血清型分型

細(xì)菌及莢膜血清型鑒定所用引物參照文獻(xiàn)[12-13]，引物序列見表1。PCR 擴(kuò)增體系（20 μL）：GreenTaqMix 10 μL，上游及下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 6 μL。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35 個循環(huán)；最后，72 ℃延伸10 min。取6 μL PCR 產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測。

表1 多殺性巴氏桿菌鑒定及莢膜血清PCR 分型中的寡核苷酸序列Table 1 Sequences of the oligonucleotides used in P. multocida multiplex capsular serum PCR typing assay

1.5 細(xì)菌總DNA 的提取

取分離菌液1.5 mL 于離心管中，以1×104r/min離心1 min 后，向菌體沉淀中加入200 μL 緩沖液GA，振蕩至菌體徹底懸浮，然后向管中加入20 μL蛋白酶K溶液，混勻；接著加入220 μL緩沖液GB，振蕩15 s，70 ℃放置10 min 后，溶液變得清亮，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠；再加入220 μL無水乙醇，充分振蕩15 s，混勻，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。將所得溶液和絮狀沉淀都加入吸附柱CB3中（吸附柱放入吸附管中），以1.2×104r/min 離心30 s 后，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；接著向吸附柱CB3中加入500 μL緩沖液GD，以1.2×104r/min離心30 s后，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；再向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW，以1.2×104r/min離心1 min后，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中，重復(fù)前一操作步驟；將吸附柱CB3放回收集管中，以1.2×104r/min離心2 min后，倒掉廢液，將吸附柱CB3于室溫下放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；最后將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50 μL洗脫液和緩沖液TE，室溫放置2 min后，以1.2×104r/min離心2 min，將溶液收集到離心管中，從而得到細(xì)菌總DNA。

1.6 毒力基因檢測

用于毒力基因檢測的引物參照文獻(xiàn)[13]，引物序列及退火溫度見附表1（http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2020.02.013）。PCR 擴(kuò)增體系（20 μL）：GreenTaqMix 10 μL，上游及下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 6 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，退火（退火溫度見附表1）1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后，72 ℃延伸10 min。取6 μL PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測。

1.7 16S rRNA 序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

將測序所得序列用NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的Blast檢索工具進(jìn)行同源性分析，使用Clustal W 軟件與GenBank 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）中所收錄的序列進(jìn)行多次比對，并通過MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.8 耐藥性檢測

選擇4 類11 種常用抗菌藥物藥敏紙片進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)。根據(jù)抑菌圈大小判定為耐藥、中介或敏感。判定標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Criterion of antibiotics sensitivity tests

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離鑒定及莢膜血清的分型

從病死藏豬肺中分離獲得1 株菌，該菌株在血瓊脂平板上長出半透明露珠狀菌落（圖1），在顯微鏡下經(jīng)革蘭氏染色呈紅色短桿菌，經(jīng)亞甲藍(lán)染色呈典型兩極著色的短桿菌。細(xì)菌染色及菌落培養(yǎng)特性均符合多殺性巴氏桿菌特征。提取該菌株的總DNA，利用多殺性巴氏桿菌特異性引物對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。電泳結(jié)果顯示，其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小在460 bp 左右（圖2），與預(yù)期片段大小相符。對基因測序結(jié)果進(jìn)行Blast序列分析，確定該菌株為多殺性巴氏桿菌。利用5對多殺性巴氏桿菌莢膜血清分型引物對目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測。結(jié)果顯示，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物大小在657 bp 左右（圖2），與莢膜血清D 型引物設(shè)計擴(kuò)增片段大小相符，而其他4 種血清型引物均未擴(kuò)增出目的基因條帶。由此確定該菌株為莢膜血清D 型多殺性巴氏桿菌。

圖1 多殺性巴氏桿菌的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of P.multocida

2.2 毒力基因的檢測分析

提取細(xì)菌總DNA，通過PCR對23個毒力基因進(jìn)行檢測。結(jié)果（圖3）表明，該菌株中含有ptfA、fimA、hsf-1、hsf-2、sodA、sodC、ompA、ompH、oma87、plpB、exbB、exbD、tonB、hgbA、hgbB和Fur等16種毒力基因。

2.3 16S rRNA 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

16S rRNA 擴(kuò)增片段經(jīng)測序后用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果（圖4）顯示，所有多殺性巴氏桿菌菌株形成2個主要分支，其中：本次從藏豬體內(nèi)分離的菌株與伊朗家禽多殺性巴氏桿菌（AY225343）、伊朗牛多殺性巴氏桿菌（CP017961）、印度山羊多殺性巴氏桿菌（KX348143）、中國四川豬多殺性巴氏桿菌（KP222299）和中國湖南豬多殺性巴氏桿菌（KX449349）聚在一個分支，說明從藏豬體內(nèi)分離的菌株與這幾株菌具有一定的親緣關(guān)系；而該分離菌株與外族肺炎克雷伯菌KJ803938 和JX195716不在一個分支上。

圖2 多殺性巴氏桿菌的種特異性基因Kmt1與莢膜血清分型的PCR鑒定Fig.2 Identification of P. multocida Kmt1 gene and capsular serotype genes

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

圖3 多殺性巴氏桿菌毒力基因檢測Fig.3 Detection of P.multocida virulence genes

圖4 藏豬多殺性巴氏桿菌與其他多殺性巴氏桿菌菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of P.multocida isolated from Tibet swines and others

由表3 可見，本次從西藏地區(qū)藏豬體內(nèi)分離的莢膜血清D型多殺性巴氏桿菌對常用的4類11種抗菌藥物的敏感性不同：對β-內(nèi)酰胺類（阿莫西林和氨芐西林）和四環(huán)素類（四環(huán)素和多西環(huán)素）藥物均產(chǎn)生耐藥；在4 種氨基糖苷類藥物中除對卡那霉素和新霉素呈中度敏感外，對其余的2種藥物（鏈霉素和大觀霉素）均敏感；對喹諾酮類藥物（環(huán)丙沙星、諾氟沙星和恩諾沙星）均敏感。

表3 分離菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Drug sensitivity test results of isolated strains

3 討論與結(jié)論

本研究利用細(xì)菌分離法從病死藏豬病料中分離出1 株豬源多殺性巴氏桿菌，并利用PCR 擴(kuò)增對分離的菌株進(jìn)行分子鑒定，同時，對其莢膜血清分型及毒力基因進(jìn)行鑒定。有研究報道，我國豬多殺性巴氏桿菌的莢膜血清型隨著時間而變化：由20 世紀(jì)90 年代之前的A、B、D 型到21 世紀(jì)前10 年的D、A、B 型，再到2010 年以后的A、D 型；此外，近年來也有關(guān)于F 型的報道[14]。2015—2016 年王豪男[15]對我國14 省份臨床診斷為肺炎的豬肺組織進(jìn)行細(xì)菌分離及莢膜血清型鑒定，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)A 型57 株（50%），D 型53 株（46%），說明豬源多殺性巴氏桿菌主要以莢膜血清A 型和D 型為主。本次從病死藏豬體內(nèi)分離鑒定的多殺性巴氏桿菌屬于莢膜血清D 型，這與我國近年關(guān)于豬多殺性巴氏桿菌的報道[16-19]一致。但目前對于西藏藏豬群體中多殺性巴氏桿菌莢膜血清分型鮮有報道，因此，無法追溯藏豬多殺性巴氏桿菌莢膜血清型的流行趨勢。

多殺性巴氏桿菌毒力基因在該菌的致病過程中起到很重要的作用[3,20]。有報道顯示，在多殺性巴氏桿菌中，毒力基因ptfA、fimA、hsf-2、exbB、exbD、tonB、Fur、sodA、sodC、ompA、ompH、oma87、plpB[21-22]等的檢出率較高。本次從西藏藏豬體內(nèi)分離的菌株中也檢測到16 種多殺性巴氏桿菌毒力基因（PtfA、fimA、hsf-1、hsf-2、sodA、sodC、ompA、ompH、oma87、plpB、exbB、exbD、tonB、hgbA、hgbB、Fur），與以上研究結(jié)果基本一致。

對系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析顯示，本次從藏豬體內(nèi)分離的菌株與伊朗家禽多殺性巴氏桿菌（AY225343）、伊朗牛多殺性巴氏桿菌（CP017961）、印度山羊多殺性巴氏桿菌（KX348143）、中國四川豬多殺性巴氏桿菌（KP222299）和中國湖南豬多殺性巴氏桿菌（KX449349）聚在一個分支，親緣關(guān)系較近。

由細(xì)菌引起的呼吸道傳染病是養(yǎng)豬業(yè)常發(fā)且主要流行的疫病之一。目前，抗菌藥物治療是控制細(xì)菌性傳染病最有效的方法之一。然而，由于抗菌藥物的廣泛、濫用問題日益突出，導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性問題越來越突出，使得細(xì)菌性傳染病的危害日益嚴(yán)重，且在動物性食品中出現(xiàn)了獸藥殘留現(xiàn)象，對公共健康構(gòu)成了潛在的威脅。本次西藏地區(qū)藏豬體內(nèi)分離的莢膜血清D 型多殺性巴氏桿菌對常用的11 種抗菌藥物產(chǎn)生了不同的耐藥性，其中：對四環(huán)素、多西環(huán)素、阿莫西林和氨芐西林等4 種藥物均產(chǎn)生耐藥性，對卡那霉素和新霉素呈中度敏感，對鏈霉素、大觀霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星和恩諾沙星等藥物均敏感。因此，今后在養(yǎng)殖過程中對藥物的使用必須合理且具有針對性，并經(jīng)常更換抗菌藥物種類，以免產(chǎn)生新的耐藥菌株。

總之，多殺性巴氏桿菌是規(guī)?；i場中一種重要的傳染病，由于西藏地區(qū)藏豬養(yǎng)殖場對預(yù)防該病的疫苗使用率不高，導(dǎo)致該病時有發(fā)生，嚴(yán)重影響了藏豬群體的健康狀況。目前，在我國豬群中流行的多殺性巴氏桿菌莢膜血清型存在一定程度的多樣性，其中莢膜血清D型多殺性巴氏桿菌的比例較高。本試驗(yàn)從西藏地區(qū)病死藏豬體內(nèi)也分離鑒定出莢膜血清D型多殺性巴氏桿菌，為該病的預(yù)防和進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)；同時，本研究還初步探討了藏豬莢膜血清D 型多殺性巴氏桿菌的藥物敏感性，為該血清型多殺性巴氏桿菌的治療提供了一定的理論依據(jù)。