瘤胃內(nèi)甲烷生成與厭氧氧化過(guò)程耦聯(lián)研究進(jìn)展

徐欣欣，王佳堃

（浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院奶業(yè)科學(xué)研究所，杭州310058）

減少反芻動(dòng)物甲烷產(chǎn)量能夠提高飼料利用效率，且有利于保護(hù)生態(tài)環(huán)境。離子載體[1]、有機(jī)酸[2]、鹵代化合物[3]等化學(xué)物質(zhì)，皂苷[4]、單寧[5]、蒽醌[6]等植物提取物，及細(xì)菌素[7]、驅(qū)原蟲(chóng)劑[8]、產(chǎn)甲烷菌疫苗[9]等生物方法都曾是反芻動(dòng)物甲烷減排的熱點(diǎn)技術(shù)，但在動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中這些方法又受限于纖維消化的抑制或降甲烷效果瞬時(shí)性的影響。體外瘤胃發(fā)酵證實(shí)，添加硝酸鹽和硫酸鹽降甲烷效果顯著，推測(cè)這一過(guò)程是通過(guò)硝酸鹽和硫酸鹽還原途徑與甲烷生成途徑競(jìng)爭(zhēng)氫來(lái)實(shí)現(xiàn)的[10]。而事實(shí)上，NO－3和SO2－4是多種環(huán)境中甲烷厭氧氧化（anaerobic methane oxidation, AMO）的電子受體，在NO－3或SO2－4存在時(shí)，甲烷氧化菌可以將甲烷氧化[11]。其中反向產(chǎn)甲烷途徑是AMO的方式之一。即參與甲烷生成的酶是一類“雙向酶”，它們既參與產(chǎn)甲烷菌利用氫氣和二氧化碳生成甲烷的生成過(guò)程，也參與以甲烷為底物生成二氧化碳的AMO 過(guò)程[11]。每年自然環(huán)境中有0.3 Gt 的甲烷經(jīng)厭氧氧化途徑被消耗[12]。而在反芻動(dòng)物的瘤胃中，尤其是在添加硝酸鹽和硫酸鹽的情況下，甲烷生成量的減少是競(jìng)爭(zhēng)氫的結(jié)果，還是甲烷氧化的結(jié)果，不得而知。因此，深入研究在自然環(huán)境和瘤胃2 種不同生境下AMO 途徑中硝酸鹽和硫酸鹽對(duì)甲烷生成量差異的影響，能夠更好地闡釋硝酸鹽和硫酸鹽抑制瘤胃甲烷排放的內(nèi)在機(jī)制。

1 自然環(huán)境中甲烷厭氧氧化途徑

AMO 是沼澤、濕地、農(nóng)田土壤、水底淤泥等厭氧環(huán)境中甲烷排放量降低的主要因素，且AMO 普遍存在于這些生境中（表1）。AMO 途徑依據(jù)其末端電子受體類型可以分為硫酸鹽依賴型甲烷厭氧氧化（sulfate-dependent anaerobic methane oxidation,S-DAMO）、硝酸鹽/亞硝酸鹽依賴型甲烷厭氧氧化（nitrate/nitrite-dependent anaerobic methane oxidation,N-DAMO）及金屬依賴型甲烷厭氧氧化（metaldependent anaerobic methane oxidation,M-DAMO）。

1.1 硫酸鹽依賴型甲烷厭氧氧化（S-DAMO）

S-DAMO 是甲烷厭氧氧化古菌（anaerobic methanotrophic archaea, ANME）和硫酸鹽還原菌（sulfate-reducing bacteria,SRB）以SO2－4為終端電子受體，經(jīng)硫酸鹽還原反應(yīng)將甲烷氧化為HCO－3和HS－的過(guò)程。目前，該過(guò)程有反向產(chǎn)甲烷、乙酸化與甲基化3種假說(shuō)途徑。

表1 不同類型甲烷厭氧氧化途徑中甲烷氧化速率Table 1 Methane oxidation rates in the different types of anaerobic methane oxidation processes

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析，在與SRB共生的ANME類群中，ANME-1 與產(chǎn)甲烷八疊球菌目（Methanosarcinales）和產(chǎn)甲烷微菌目（Methanomicrobiales）的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)[19-20]，ANME-2 屬于產(chǎn)甲烷八疊球菌目[20]，ANME-3 與擬甲烷球菌屬（Methanococcoides）的親緣關(guān)系較近[20]，其中ANME-2 可以再細(xì)分為ANME-2a、ANME-2b、ANME-2c[21]和ANME-2d[22]。ANME-2d 也被稱為GoM-ArcⅠ[23]或AAA 古菌[24]。在S-DAMO 中，與ANME-1 和ANME-2 共 生 的SRB 通常屬于脫硫八疊球菌屬（Desulfosarcina）和脫硫球菌屬（Desulfococcus）[19-20,25]，與ANME-3共生的SRB一般屬于脫硫葉菌屬（Desulfobulbus）[26-27]。

如圖1 所示，甲烷生成途徑中大部分酶催化的反應(yīng)都是可逆的[11]，反向產(chǎn)甲烷理論正是以此為基礎(chǔ)提出的。甲烷生成途徑的最后一步是甲基輔酶M 還原酶（methyl-coenzyme M reductase,Mcr）將輔酶M（coenzyme M, CoM）連接的甲基催化為甲烷[21]，而在反向產(chǎn)甲烷途徑中，Mcr被證實(shí)是活化甲烷即催化AMO 的關(guān)鍵酶[28]。除亞甲基四氫甲烷蝶呤還原酶（methylene-H4MPT reductase,Mer）和一些氫化酶的編碼基因外，ANME-1的基因組具有編碼二氧化碳還原生成甲烷的其他全部酶基因[29]。因此，在基因?qū)用嫔?，反向產(chǎn)甲烷途徑中的大部分環(huán)節(jié)都能在ANME-1 中實(shí)現(xiàn)，表明ANME-1 與SRB至少能通過(guò)部分反向產(chǎn)甲烷途徑完成S-DAMO。Mcr 的可逆性及甲烷生成所需的關(guān)鍵酶基因的存在[28-30]，都支持了反向產(chǎn)甲烷途徑。但有研究發(fā)現(xiàn)，在低氫、高甲烷含量的環(huán)境中無(wú)法成功誘導(dǎo)反向產(chǎn)甲烷途徑[31]。通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析和顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與產(chǎn)甲烷八疊球菌目有較近親緣關(guān)系的古菌參與了某些環(huán)境中的S-DAMO[32]，但許多產(chǎn)甲烷八疊球菌目的微生物不能利用氫氣完成產(chǎn)甲烷過(guò)程，而是更傾向于在富含甲基化合物和乙酸的環(huán)境中生長(zhǎng)[33]。出于對(duì)以上幾點(diǎn)的考慮，VALENTINE 等推測(cè)可能存在其他途徑供ANME 與SRB 完成SDAMO[33]，并由此提出乙酸化理論。乙酸化理論包括2種代謝途徑，都涉及甲烷的氧化與乙酸的生成，但ANME 是直接將2 分子的甲烷氧化為乙酸和氫氣，還是利用二氧化碳將甲烷轉(zhuǎn)化為乙酸[33]，尚需要系統(tǒng)的研究。

除反向產(chǎn)甲烷理論與乙酸化理論外，甲基化理論作為一種新的AMO 理論模型也被用于解釋AMO[34]。從熱力學(xué)角度來(lái)看，當(dāng)海洋環(huán)境中氫氣濃度超過(guò)0.29 nmol/L時(shí)，S-DAMO會(huì)受到抑制[35]。但MORAN 等[34]接種來(lái)自Eel 河盆地和水合物脊（hydrate ridge）的沉積物后發(fā)現(xiàn)，0.43 mmol/L 的氫氣濃度并不抑制S-DAMO，說(shuō)明氫氣并非是SDAMO的產(chǎn)物；因此，作者推斷在S-DAMO過(guò)程中存在其他電子傳遞體。然而，當(dāng)MORAN 等向培養(yǎng)體系中添加甲硫醇（MeSH）時(shí)，S-DAMO 的反應(yīng)速率降低了68%，由此推斷甲基硫化物充當(dāng)了這一過(guò)程中的電子傳遞體，從而提出了甲基化理論。即甲烷與輔酶M（CoM）結(jié)合時(shí)被活化并釋放電子，此時(shí)HCO－3作為電子受體，在碳酸酐酶作用下轉(zhuǎn)化為二氧化碳，二氧化碳被ANME利用后還原為甲基化合物并與CoM 結(jié)合，硫化物取代結(jié)合物中的CoM，再次釋放的CoM 可再被作用于甲烷活化和二氧化碳還原，而甲基硫化物則充當(dāng)這一過(guò)程中的電子傳遞體并被SRB利用，其與SO2－4反應(yīng)后產(chǎn)生的HCO－3和HS－又可用于AMO的起始階段[34]。不同環(huán)境下SDAMO的發(fā)生機(jī)制可能存在一定的差異，而具體是通過(guò)哪一種機(jī)制來(lái)完成AMO 過(guò)程，尚需要在不同試驗(yàn)條件下進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2 硝酸鹽/亞硝酸鹽依賴型甲烷厭氧氧化（NDAMO）

N-DAMO 常在濕地[15]和淡水[36]等缺氧且富含NO－2或者NO－3的區(qū)域發(fā)生，是ANME和NC10門(mén)細(xì)菌（CandidatusMethylomirabilis oxyfera,M.oxyfera）以NO－2或NO－3作為電子受體，與脫氮耦聯(lián)并將甲烷氧化為二氧化碳的過(guò)程。1991年，SMITH等在富含硝酸鹽的地下水域中監(jiān)測(cè)到了甲烷氧化的發(fā)生，由此推測(cè)NO－3也許能夠作為電子受體，將反硝化與甲烷氧化耦合[37]。之后，RAGHOEBARSING 等通過(guò)對(duì)河流的厭氧沉積物進(jìn)行富集培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該富集培養(yǎng)物由1種細(xì)菌和1種與ANME-2親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的古菌組成，其在厭氧條件下能夠完成甲烷氧化和反硝化，故認(rèn)為在N-DAMO中，首先由古菌完成甲烷的氧化，再將電子傳遞給NC10 門(mén)細(xì)菌以完成NO－3和NO－2的還原[16]。ETTWIG 等在抑制Mcr 的條件下培養(yǎng)由NC10門(mén)細(xì)菌和產(chǎn)甲烷八疊球菌目的古菌組成的富集培養(yǎng)物，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)體系中甲烷和亞硝酸鹽的轉(zhuǎn)化速率保持穩(wěn)定，古菌在培養(yǎng)過(guò)程中逐漸消失；由此推斷，N-DAMO 過(guò)程主要由NC10 門(mén)細(xì)菌完成，并且NO－2比NO－3更適合作為該培養(yǎng)體系的電子受體[36]。借助同位素標(biāo)記法，ETTWIG等在同時(shí)存在甲烷和亞硝酸鹽的體系中培養(yǎng)M.oxyfera，監(jiān)測(cè)到了甲烷的氧化和氮?dú)獾纳蒣40]?；蚪M及轉(zhuǎn)錄組等組學(xué)技術(shù)揭示了M. oxyfera具有還原NO－3、NO－2和NO 的基因，能夠使2 分子NO 轉(zhuǎn)化為N2和O2，而不是將NO轉(zhuǎn)化為N2O，但M.oxyfera缺少目前已知的編碼N2O還原酶的基因[40]。HAROON等[30]發(fā)現(xiàn)：在淡水沉積物與厭氧廢水污泥的兩者混合物中，占主導(dǎo)地位的ANME-2d 的基因組信息中包括所有Mcr 亞單位基因（McrABCDG）及F420依賴型Mer 在內(nèi)的完整的反向產(chǎn)甲烷途徑[30]；同位素標(biāo)記試驗(yàn)結(jié)果表明，ANME-2d 能夠利用NO－3作為電子受體，獨(dú)立完成AMO 過(guò)程（圖1），完整的固碳途徑和乙酰輔酶A合成酶也存在于ANME-2d的基因組中，暗示其具有產(chǎn)生乙酸的可能性。

圖1 硝酸鹽或亞硝酸鹽競(jìng)爭(zhēng)氫氣、氫營(yíng)養(yǎng)型甲烷生成途徑及反向產(chǎn)甲烷途徑[21,30,38-39]Fig.1 Nitrate and nitritecompetition for hydrogen,hydrogenotrophic methanogenesis and reverse methanogenesis processes[21,30,38-39]

1.3 金屬依賴型甲烷厭氧氧化（M-DAMO）

除S-DAMO 和N-DAMO 外，研究者發(fā)現(xiàn)，在湖泊[41]、湖水[42]及海岸[18]等生境中，AMO 還與金屬離子還原耦合，尤其是與Fe3＋和Mn4＋的還原反應(yīng)[43]。從熱力學(xué)角度來(lái)看，金屬離子比硫酸鹽更適合作為AMO過(guò)程中的電子受體（表2）。

ETTWIG 等在連續(xù)通入甲烷、亞硝酸鹽和硝酸鹽的河流沉積物中，富集到了一種與硝酸鹽型甲烷厭氧氧化菌（CandidatusMethanoperedens nitroreducens）相關(guān)的古菌群——AAA 簇古菌（ANME-2d），發(fā)現(xiàn)該古菌群能夠直接耦合甲烷的氧化及Fe3＋和Mn4＋的還原[43]。BEAL 等發(fā)現(xiàn)：河流盆地沉淀物中的微生物能夠利用Fe3+和Mn4＋氧化甲烷[14]；通過(guò)16S rRNA 和Mcr-A 的多樣性分析發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)體系中同時(shí)存在ANME 及大量的細(xì)菌，擬桿菌屬（Bacteriodes）和酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）等中約40%的細(xì)菌能夠還原Mn4＋，表明Mn4＋依賴型AMO不是由ANME 單獨(dú)完成的，其中Mn4＋還原菌在此過(guò)程中發(fā)揮著重要作用；此外，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，ANME-2的數(shù)量顯著下降，ANME-3的數(shù)量顯著增加，而ANME-1 的數(shù)量始終保持穩(wěn)定，說(shuō)明Mn4＋依賴型AMO 主要由ANME-1 和ANME-3 及某些Mn4＋還原菌共同完成。SCHELLER 等將檸檬酸鐵添加至包含ANME-2a和ANME-2c的培養(yǎng)體系中，發(fā)現(xiàn)在Fe3＋作為唯一電子受體時(shí)能夠監(jiān)測(cè)到AMO[44]。CAI 等利用同位素標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)淡水沉積物中存在由ANME 獨(dú)立介導(dǎo)完成的Fe3＋依賴型AMO，且該培養(yǎng)體系中ANME 的基因組信息表明其具有編碼反向產(chǎn)甲烷途徑的所有基因[45]；因此，在基因?qū)用?，ANME 能夠利用反向產(chǎn)甲烷途徑完成AMO。SOO 等將ANME-1 編碼Mcr的基因克隆到醋酸甲烷八疊球菌（Methanosarcina acetivorans）中，在甲烷作為碳源與Fe3＋作為電子供體的條件下，結(jié)合同位素示蹤試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)甲烷的消耗伴隨著乙酸鹽的增加，推測(cè)醋酸甲烷八疊球菌能夠逆轉(zhuǎn)乙酸營(yíng)養(yǎng)型甲烷生成途徑以完成AMO[46]。

2 瘤胃中硝酸鹽和硫酸鹽還原反應(yīng)

在反芻動(dòng)物瘤胃中，產(chǎn)甲烷菌能夠利用氫氣與發(fā)酵產(chǎn)物作為底物生成甲烷，這在一定程度上穩(wěn)定了瘤胃內(nèi)的氫分壓，也為瘤胃內(nèi)微生物的生存提供了保障。通過(guò)二氧化碳-氫氣反應(yīng)生成的甲烷占瘤胃甲烷生成量的82%[47]。硫酸鹽和硝酸鹽等能夠與二氧化碳競(jìng)爭(zhēng)氫氣，從而降低甲烷的產(chǎn)量。從熱動(dòng)力學(xué)角度（表2）來(lái)看，由硝酸鹽還原菌和硫酸鹽還原菌介導(dǎo)的還原反應(yīng)比氫營(yíng)養(yǎng)型甲烷生成反應(yīng)更有優(yōu)勢(shì)[48]，因此，在飼料中添加硝酸鹽和硫酸鹽是反芻動(dòng)物甲烷減排的研究熱點(diǎn)。

表2 利用不同電子受體進(jìn)行的還原或氧化反應(yīng)的吉布斯自由能[11,14,48,50]Table 2 Gibbs free energy for reduction or oxidation reactions using different electron receptors[11,14,48,50]

硫酸鹽作為最終電子受體被還原成H2S，這一過(guò)程在熱動(dòng)力學(xué)上略次于硝酸鹽還原反應(yīng)[48]。VAN ZIJDERVELD 等發(fā)現(xiàn)：補(bǔ)飼2.6%的硫酸鹽能降低綿羊16%甲烷產(chǎn)量；2.6%硝酸鹽與2.6%硫酸鹽聯(lián)用時(shí)，甲烷產(chǎn)量降低程度可高達(dá)47%；但單獨(dú)添加硫酸鹽的降甲烷效果不如單獨(dú)添加硝酸鹽[10]。許多關(guān)于硝酸鹽和硫酸鹽的研究均獲得了較為理想的降低甲烷產(chǎn)量的效果（表3）。

3 自然環(huán)境和瘤胃中硝酸鹽和硫酸鹽還原反應(yīng)降低甲烷產(chǎn)量的差異

目前，從瘤胃中分離出來(lái)的產(chǎn)甲烷菌主要有產(chǎn)甲烷桿菌屬（Methanobacterium）、產(chǎn)甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）、產(chǎn)甲烷微菌屬（Methanomicrobium）和產(chǎn)甲烷八疊球菌屬（Methanosarcine）[53-54]，其中大部分都通過(guò)還原二氧化碳來(lái)產(chǎn)生甲烷。甲烷的形成伴隨著細(xì)胞膜內(nèi)外Na＋和H＋化學(xué)梯度的形成，兩者分別由Na＋泵-甲基輔酶M轉(zhuǎn)移酶（methyl-H4MPT: CoM methyltransferase,Mtr）和細(xì)胞膜上的氫化酶來(lái)實(shí)現(xiàn)。Na＋和H＋梯度驅(qū)動(dòng)位于膜上的腺苷三磷酸（adenosine triphosphate,ATP）合酶，通過(guò)產(chǎn)生ATP 來(lái)實(shí)現(xiàn)能量轉(zhuǎn)換[55]。反向產(chǎn)甲烷途徑逆轉(zhuǎn)了甲烷生成的過(guò)程，在Mcr等一系列關(guān)鍵酶的催化下將甲烷氧化為二氧化碳[30]。HAROON 等通過(guò)ANME-2d 的基因組信息發(fā)現(xiàn)，ANME-2d 利用反向產(chǎn)甲烷途徑氧化甲烷過(guò)程中的能量轉(zhuǎn)換與甲烷生成過(guò)程類似，同樣是通過(guò)跨膜化學(xué)濃度梯度驅(qū)動(dòng)膜上的ATP合成酶，最終產(chǎn)生ATP[30]。而ETTWIG等的研究表明，M.oxyfera在還原N時(shí)產(chǎn)生O2，進(jìn)而用于甲烷氧化并獲取能量[40]。WU 等進(jìn)一步細(xì)化了M.oxyfera的中心分解代謝和能量代謝通路，發(fā)現(xiàn)甲烷在顆粒性甲烷單加氧酶（particulate methane mono-oxygenase, PMMO）的催化下轉(zhuǎn)化為甲醇，再經(jīng)甲醇脫氫酶（methanoldehydrogenase,Mdh）、亞甲基-四氫甲基蝶呤脫氫酶（methylene-H4MPT dehydrogenase, MtdB）或亞甲基-四氫葉酸脫氫酶（methylene-H4F dehydrogenase,FolD）一系列酶的作用形成甲酸，再由甲基脫氫酶（formate dehydrogenase,Fdh）催化甲酸轉(zhuǎn)化為二氧化碳[61]。N經(jīng)一系列酶催化后，最終轉(zhuǎn)化為N2和O2，其中3/4 的O2被用于甲烷的氧化，1/4 的O2被用于產(chǎn)能代謝等其他生化過(guò)程[61-62]。M. oxyfera作為呼吸型微生物，其通過(guò)化學(xué)滲透機(jī)制保存來(lái)自NDAMO產(chǎn)生的能量，以及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH）脫氫酶耦合還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NADH）的氧化和醌的還原，通過(guò)質(zhì)子的泵出實(shí)現(xiàn)跨膜H＋梯度進(jìn)而合成ATP；細(xì)胞色素bc1復(fù)合體對(duì)還原性醌進(jìn)行氧化，可再次實(shí)現(xiàn)H＋的跨膜轉(zhuǎn)移，而細(xì)胞色素c作為電子供體將電子傳遞給cd1型亞硝酸還原酶，進(jìn)行實(shí)現(xiàn)N的還原[61-62]。

表3 添加硝酸鹽或硫酸鹽降低瘤胃甲烷產(chǎn)量的研究Table 3 Studies of reducing methane production in rumen by adding nitrate or sulfate

4 小結(jié)

硝酸鹽或硫酸鹽等可替代電子受體來(lái)降低瘤胃甲烷產(chǎn)量的原因是多樣的，如硝酸鹽既可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)氫氣實(shí)現(xiàn)瘤胃甲烷產(chǎn)量的降低，也可通過(guò)對(duì)瘤胃產(chǎn)甲烷菌的毒性作用抑制甲烷生成。AMO 作為環(huán)境中減少甲烷排放的重要途徑之一，其與硝酸鹽或硫酸鹽影響瘤胃甲烷產(chǎn)量是否存在一定聯(lián)系尚未可知，但N-DAMO 微生物在瘤胃中的發(fā)現(xiàn)說(shuō)明AMO 可能在瘤胃中發(fā)生。同位素示蹤技術(shù)與體外試驗(yàn)相結(jié)合，可以直觀地監(jiān)測(cè)瘤胃微生物是否將甲烷氧化為二氧化碳；而添加硝酸鹽等使瘤胃中AMO 微生物數(shù)量增加，能夠再度監(jiān)測(cè)甲烷的轉(zhuǎn)化過(guò)程；另外，宏基因組技術(shù)與其他組學(xué)技術(shù)相結(jié)合，可以深度分析何種瘤胃微生物通過(guò)何種途徑實(shí)現(xiàn)了甲烷氧化為二氧化碳的過(guò)程，這也是打破硝酸鹽降低瘤胃甲烷生成量傳統(tǒng)認(rèn)知的關(guān)鍵。這些研究將為開(kāi)發(fā)瘤胃甲烷減排措施提供更廣闊的思路，對(duì)提高飼料利用效率和減緩甲烷對(duì)溫室效應(yīng)的影響具有重要意義。

表4 硝酸鹽和硫酸鹽在自然環(huán)境和瘤胃中對(duì)甲烷產(chǎn)量影響的差異[10-11,48,50]Table 4 Differences in the effects of nitrate and sulfate on methane production in natural habitats and rumen[10-11,48,50]