10個觀賞海棠品種葉片春季色彩變化及其與色素含量的相關(guān)性

韓文學(xué)，江皓，卞健，云金虎，孫艷艷，張往祥,4，彭冶*

（1.南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京210037；2.南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，南京210037；3.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南京210037；4.揚州小蘋果園藝有限公司，江蘇 揚州225200）

海棠（Malusspp.）是薔薇科（Rosaceae）蘋果屬（MalusMill.）中的一類觀賞植物，被廣泛地應(yīng)用于園林造景中，在全世界的品種數(shù)量為700多個[1]。源自北美的觀賞海棠品種不僅花色艷麗，其新葉色彩也有一定的觀賞性；不同品種觀賞期不同，長的達(dá)40 d，短的也有15 d 左右[2]。近年來，北美觀賞海棠被大量引入我國，學(xué)者們對其不同品種的花色、葉色等進(jìn)行了研究。如：張往祥等[3-4]對觀賞海棠品種花色動態(tài)變化及色素組分動態(tài)特征進(jìn)行了研究，揭示了花色變化過程中色素含量的動態(tài)變化特征。姜文龍等[5-6]根據(jù)葉片在枝條上的不同葉位，研究了觀賞海棠品種葉片色彩特征及色素含量差異，系統(tǒng)區(qū)劃了品種群，探究了不同品種群葉位間葉片色彩及色素含量的區(qū)別。此外，張洋等[7]和張曼等[8]從大尺度的視角觀察了不同品種觀賞海棠葉片色彩變化，發(fā)現(xiàn)在葉片發(fā)育初期色彩最為豐富，隨著葉片成熟葉色最終趨于一致。盡管前人從不同角度研究了觀賞海棠豐富多彩的葉色，但針對觀賞海棠葉片在春季展葉期間的葉色變化規(guī)律，以及色素含量對色彩影響的研究還不多見。因此，本研究以10個展葉期葉片呈紅色、引自北美觀花海棠品種作為試驗材料，利用色差計對同一枝條上處于不同階段（展葉前期L1、展葉初期L2、展葉后期L3）的葉片，進(jìn)行了色彩參數(shù)明度（lightness,L*）、紅度（redness,a*）、黃度（yellowness,b*）值的測定和分析，并初步建立了這10 個觀賞海棠品種葉片的色彩圖譜；此外，通過測定不同發(fā)育階段葉片中葉綠素、花青素和類胡蘿卜素的含量，并與色彩參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，以揭示色素含量對觀賞海棠葉色變化的影響，進(jìn)而為觀賞海棠種質(zhì)資源的深入開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2019 年4 月初，于江蘇省揚州市江都區(qū)仙女鎮(zhèn)國家海棠種質(zhì)資源圃，選擇10 個展葉期葉片呈紅色、引自北美的觀賞海棠品種，取其2～3 年生苗為試驗材料，品種名見表1。每個品種選擇生長健壯且同一生長環(huán)境的植株50～70株。

1.2 試驗葉片的選擇

依據(jù)每個品種的物候期，展葉15 d 后，從當(dāng)年抽生未木質(zhì)化的枝條上采摘葉片（長度30 cm 左右）。采摘時，選擇同一枝條上不同發(fā)育時期的葉片（圖1）：展葉前期（L1）葉，即新梢上的未展葉；展葉初期（L2）葉，即新梢下第2—3 片葉；展葉后期（L3）葉，即第4—5片葉。采摘的葉片一部分用于葉色參數(shù)的測定，另一部分立即放于冰盒中帶回實驗室，于－80 ℃冰箱中保存，用于葉綠素、類胡蘿卜素和花青素含量的測定。所有樣品均設(shè)置3個重復(fù)。

表1 供試觀賞海棠品種Table 1 Ornamental crabapple varieties tested

1.3 色彩及色素含量測定方法

利用美國愛色麗便攜式色差儀X-Rite Ci60 對待測葉片的葉色進(jìn)行測定。測定時，選用內(nèi)置D65光源，測量孔徑4 mm，于室內(nèi)操作，以排除外界光源的干擾。選取每個葉片上與葉脈對稱的6個點進(jìn)行測定，記錄色彩參數(shù)明度（L*）、紅度（a*）、黃度（b*），其中：L*為垂直軸，表示色彩明亮度，其值為0（白）～100（黑）；a*為橫軸，表示紅綠色相，紅色相為＋a*，綠色相為－a*；b*為縱軸，表示黃藍(lán)色相，黃色相為＋b*，藍(lán)色相為－b*[9]。利用色彩參數(shù)（L*、a*、b*）繪制色彩圖譜。

葉綠素和類胡蘿卜素含量測定采用丙酮-乙醇等量混合浸提法[10]，以SPECORD 200 PLUS 型分光光度計在470、649和665 nm波長下測定吸光度值?；ㄇ嗨睾繙y定采用2%鹽酸-甲醇浸提法[11]，以SPECORD 200 PLUS 型分光光度計在530、653 nm波長下測定吸光度值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2016 對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，然后使用GraphPad Prism 7繪制柱狀圖和用統(tǒng)計軟件SPSS 21.0進(jìn)行相關(guān)性和顯著性分析，并運用Adobe Photoshop CC 2015.5繪制色彩圖譜。

2 結(jié)果

2.1 不同發(fā)育時期觀賞海棠葉片色彩變化規(guī)律

從圖2A 中可知，不同觀賞海棠品種隨著發(fā)育時期的變化，葉片的明度L*整體變化幅度不大。其中：‘豐盛’‘高原紅’‘皇家雨點’‘時光秀’‘碩紅’‘完美紫’‘紫王子’7 個品種葉色明度穩(wěn)定性較好；僅‘魯?shù)婪颉? 個品種葉色明度呈梯度降低，穩(wěn)定性最差（P＜0.05）；‘黛玉’‘粉冠’2個品種葉色明度呈顯著增加趨勢。

從圖2B 中可知，10 個觀賞海棠品種葉片紅綠色相a*值的變化呈現(xiàn)不同的趨勢。其中：‘黛玉’‘粉冠’‘豐盛’‘魯?shù)婪颉T紅’‘完美紫’‘紫王子’7 個品種的a*值呈顯著降低趨勢（P＜0.05），即葉片紅色程度逐漸減弱，綠色程度逐漸增強，且‘黛玉’和‘碩紅’的a*值最終為負(fù)，即葉片呈綠色。而‘高原紅’‘皇家雨點’‘時光秀’3 個品種的a*值呈增高趨勢，即這3 個品種葉片色彩的紅色程度強于其他品種，其呈紅色周期長，達(dá)35 d左右，觀賞價值較高，并且‘高原紅’在3個發(fā)育時期中，葉色持續(xù)變紅，增長趨勢明顯（P＜0.05），可作為最優(yōu)的觀葉品種進(jìn)行培育改良。

圖1 葉片發(fā)育時期Fig.1 Leaf developmental stages

從圖2C 中可知，10 個觀賞海棠品種葉片色彩黃藍(lán)色相b*值隨著發(fā)育時期的變化增長趨勢明顯（P＜0.05），即10 個觀賞海棠品種葉片色彩呈黃色程度逐漸增強。

2.2 10 個觀賞海棠品種葉片色彩圖譜

同一發(fā)育時期，不同品種間色彩參數(shù)存在顯著性差異，即葉片呈現(xiàn)的色彩也不同。結(jié)合圖2和圖3對10個觀賞海棠品種葉片色彩特性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在3個發(fā)育時期，10個觀賞海棠葉片明度L*值變化不大，所以，主要對紅綠色相a*和黃藍(lán)色相b*值進(jìn)行分析。

在L1時期，10 個觀賞海棠葉片主色調(diào)均為紅色，色彩最為豐富?！?shù)婪颉蕝?shù)a*、b*值最大（a*=12.33，b*=9.58），色彩鮮艷醒目，‘碩紅’色彩參數(shù)a*值最?。?.62），b*值僅次于‘魯?shù)婪颉?，葉色觀賞特性遠(yuǎn)不及‘魯?shù)婪颉?，表明紅綠色相a*值可作為觀賞海棠觀葉特征的主要指示值，黃綠色相b*值是觀賞海棠葉色變化的輔助指示值。

在L2時期，‘黛玉’‘粉冠’‘豐盛’‘碩紅’4 個品種葉片紅綠色相a*值在1.20～5.54 之間，黃綠色相b*值在7.95～16.20 之間，且隨著發(fā)育時期的變化，b*值的增加量大于a*值的減少量，即葉片的紅色漸退，呈現(xiàn)黃綠色?！咴t’‘皇家雨點’‘魯?shù)婪颉畷r光秀’‘碩紅’‘完美紫’‘紫王子’6 個品種的a*值在7.04～9.52之間，b*值在4.61～12.50之間，且隨著發(fā)育時期的變化，b*值的增加量小于a*值的減少量，其葉片仍以紅色為主。

在L3時期，‘黛玉’‘粉冠’‘豐盛’‘碩紅’4 個品種紅綠色相a*值在－6.83～2.75之間，黃綠色相b*值在12.70～21.02之間，即a*值較低，b*值較高，葉片色彩泛綠。在3 個發(fā)育時期中，這4 個觀賞海棠品種葉片色彩紅色周期短，為15 d左右，葉片較早轉(zhuǎn)綠，觀賞價值較低。相反，‘高原紅’‘皇家雨點’‘時光秀’3 個品種a*值在6.28～9.57 之間，b*值在6.14～8.36 之間；在3 個發(fā)育時期中，其葉片紅色周期長，可達(dá)35 d 左右，觀賞價值較高。而‘魯?shù)婪颉昝雷稀贤踝印? 個品種紅綠色相a*值范圍為4.97～6.44，黃綠色相b*值范圍為7.44～13.56，紅色周期為25 d左右，觀賞價值次之。

2.3 10 個觀賞海棠品種色素含量變化特征

圖2 不同發(fā)育時期觀賞海棠葉片色彩參數(shù)分析Fig.2 Analysis of leaf color parameters of ornamental crabapple at different developmental stages

圖3 10個觀賞海棠品種葉片色彩圖譜Fig.3 Leaf color maps of 10 ornamental crabapple varieties

從圖4A～C 中可以看出：在10 個觀賞海棠品種葉片中，葉綠素所占權(quán)重最大，隨發(fā)育時期的變化，葉綠素含量逐漸增大，在3 個發(fā)育時期中，其占權(quán) 重 分 別 為（61.04±6.57）% 、（70.23±4.97）% 、（75.33±6.34）%?；ㄇ嗨厮紮?quán)重次之，但隨發(fā)育時期的變化逐漸減小，在3個發(fā)育時期中，其占權(quán)重分 別 為（25.87±7.77）%、（16.29±6.22）%、（11.51±7.60）%。類胡蘿卜素所占權(quán)重最小，隨發(fā)育時期的變化其值比較穩(wěn)定，在3個發(fā)育時期中，其占權(quán)重分別 為（13.10±1.74）% 、（13.48±1.82）% 、（13.16±1.50）%。以上結(jié)果表明，無論觀賞海棠展葉期葉片色素含量如何變化，其葉綠素含量所占權(quán)重均高于花青素、類胡蘿卜素含量所占權(quán)重。結(jié)合圖譜（圖3）中葉片色彩轉(zhuǎn)綠最為明顯的‘黛玉’‘豐盛’‘粉冠’‘碩紅’4個品種進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：隨著發(fā)育時期的變化，葉綠素權(quán)重顯著增大，從61.03%上升到81.88%；花青素權(quán)重顯著減小，從25.40%下降到3.18%；類胡蘿卜素權(quán)重呈不規(guī)律變化。表明觀賞海棠葉色轉(zhuǎn)綠主要受花青素和葉綠素含量變化的影響。

從圖4D中可以看出，10個觀賞海棠葉片葉綠素含量的變化隨發(fā)育時期均呈上升趨勢。其中，‘完美紫’的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在3個發(fā)育時期中均最高，為1.35～2.10 mg/g，‘黛玉’葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在3 個發(fā)育時期中均最低，為0.43～1.39 mg/g，但‘黛玉’葉色在整個發(fā)育過程中較‘完美紫’綠，表明葉片的綠色并不是由葉綠素含量多少直接決定的。

從圖4E 中可以看出，10 個觀賞海棠葉片花青素含量隨發(fā)育時期的變化均呈不同變化趨勢?！煊瘛酃凇S盛’‘魯?shù)婪颉T紅’‘完美紫’‘紫王子’7 個品種葉片中花青素含量隨發(fā)育時期逐步降低。而‘高原紅’‘皇家雨點’‘時光秀’3 個品種葉片中花青素含量隨發(fā)育時期逐漸增大，且這3 個品種的花青素權(quán)重變化幅度較其他品種小，范圍分別為36.85%～25.07%、33.35%～22.82%和24.41%～18.59%，其葉片較其他品種紅色程度強，即這3個品種可作為優(yōu)質(zhì)的紅葉海棠而被開發(fā)利用。

從圖4F中可以看出，10個觀賞海棠葉片類胡蘿卜素含量的變化隨發(fā)育時期呈上升趨勢，不同品種間類胡蘿卜素含量相差不大：在L1時期10個品種類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值為（0.16±0.06）mg/g，在L2時期均值為（0.26±0.04）mg/g，在L3時期為（0.31±0.03）mg/g，并且在這3 大色素中，類胡蘿卜素所占權(quán)重最小。

2.4 觀賞海棠葉色參數(shù)與色素含量的相關(guān)性分析

為探究在3個發(fā)育時期中觀賞海棠葉片色素含量變化對葉片色彩的影響，對10個觀賞海棠葉片色彩參數(shù)與葉綠素、花青素、類胡蘿卜素含量進(jìn)行相關(guān)性分析。由表2 可知，10 個觀賞海棠品種葉綠素含量與葉片黃藍(lán)色相b*值呈正相關(guān)，除‘完美紫’和‘紫王子’2個品種外，其他8個品種的葉綠素含量與葉片b*值呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）?！煊瘛酃凇S盛’‘魯?shù)婪颉T紅’5個品種葉綠素含量與a*值呈顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）負(fù)相關(guān)，而其他5個品種葉綠素含量與a*值呈顯著或不顯著正相關(guān)。即10 個觀賞海棠葉片葉綠素含量對黃藍(lán)色有正向影響，而對葉片紅綠色因品種的差異存在不同的影響。

10 個觀賞海棠品種花青素含量與葉片紅綠色相a*值呈顯著或極顯著正相關(guān)：‘紫王子’‘碩紅’2個品種的花青素含量與a*值呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；‘黛玉’‘粉冠’‘豐盛’‘高原紅’‘皇家雨點’‘魯?shù)婪颉畷r光秀’‘完美紫’8個品種的花青素含量與葉片a*值呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），即花青素含量越高，紅綠色相a*值越大，葉片紅色程度越高。而花青素含量與葉片色彩明亮度L*值的相關(guān)性因品種而不同：‘黛玉’‘皇家雨點’與L*值呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），而‘粉冠’與其呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；‘魯?shù)婪颉畷r光秀’與L*值呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），其他品種與L*值不存在顯著相關(guān)性?；ㄇ嗨睾颗c葉片黃藍(lán)色相b*值的相關(guān)性同樣因品種而不同：‘黛玉’‘粉冠’‘豐盛’‘魯?shù)婪颉T紅’‘完美紫’6 個品種與b*值呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），‘紫王子’‘時光秀’2個品種與其呈負(fù)相關(guān)（P＞0.05）；‘高原紅’‘皇家雨點’2 個品種與b*值呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。即10個觀賞海棠葉片紅綠色的變化受到花青素含量的影響，花青素含量越高葉片越紅。

圖4 10個觀賞海棠品種葉綠素含量動態(tài)變化Fig.4 Dynamic changes of chlorophyll contents in 10 ornamental crabapple varieties

10 個觀賞海棠品種類胡蘿卜素含量與葉片黃藍(lán)色相b*值均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），即類胡蘿卜素含量越高，黃藍(lán)色相b*值越大，葉片越黃。而胡蘿卜素含量與色彩明亮度L*值的相關(guān)性因品種而不同：‘黛玉’‘粉冠’‘高原紅’‘時光秀’‘碩紅’這5 個品種與L*值呈正相關(guān)，且‘黛玉’‘粉冠’與其呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；其他5 個品種與L*值呈顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）負(fù)相關(guān)。類胡蘿卜素含量與紅綠色相a*值的相關(guān)性也因品種而不同：‘黛玉’‘豐盛’‘魯?shù)婪颉T紅’‘完美紫’這5 個品種與a*值呈顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）負(fù)相關(guān)；而‘高原紅’‘皇家雨點’2個品種與a*值呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。綜上所述，10 種觀賞海棠葉片黃藍(lán)色受類胡蘿卜素含量的影響。

表2 觀賞海棠葉片色彩參數(shù)與色素含量變化的相關(guān)性Table 2 Correlation between color parameters and pigment contents in leaves of ornamental crabapple

3 討論與結(jié)論

3.1 10 個觀賞海棠品種葉片色彩變化特征

為挖掘春季具有較長觀賞期的觀葉海棠品種，本文采用基于量化的色彩參數(shù)對所觀察的10 個觀賞海棠品種葉色進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨著葉片的生長發(fā)育，各品種間葉片色彩均由紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色，而品種間色彩由紅變綠的快慢存在差異。這與姜文龍等[6]、張洋等[7]、張曼等[8]的研究結(jié)果一致。

色彩圖譜可更具體、直觀地展現(xiàn)觀賞海棠葉片的顏色特征。結(jié)合10 個觀賞海棠品種葉片的色彩圖譜，從觀紅葉的角度分析，‘黛玉’‘粉冠’‘豐盛’‘碩紅’品種的葉片色彩呈紅色周期短，為15 d 左右，且較早泛綠，不適合觀紅葉?！咴t’‘皇家雨點’‘時光秀’3 個品種的葉片呈紅色周期長，可達(dá)35 d 左右，具較高的觀賞價值。相比較于‘魯?shù)婪颉昝雷稀贤踝印?個廣泛應(yīng)用的觀紅葉品種，在3個發(fā)育時期中，‘高原紅’葉片葉色持續(xù)為紅色，葉紅期長于‘魯?shù)婪颉昝雷稀汀贤踝印?，表現(xiàn)出較高的潛在觀紅葉價值。

3.2 10個觀賞海棠品種色素含量對色彩變化的影響

觀賞植物葉片色彩漸變的現(xiàn)象普遍存在，如紅楓、紅葉石楠、紅花檵木、紫葉李等[12-15]的葉片。葉片色彩的變化主要受色素含量的影響，引自北美的觀花海棠品種也存在這種現(xiàn)象，隨著發(fā)育期的進(jìn)行，葉片由初期的紅色或紫色漸變?yōu)榫G色。本研究測定了3 個發(fā)育時期不同觀賞海棠品種葉片葉綠素、花青素、類胡蘿卜素的含量，發(fā)現(xiàn)各品種中葉片葉綠素含量所占權(quán)重最高，并隨發(fā)育時期的變化葉綠素含量逐漸增加，表明葉綠素是決定觀賞海棠葉片基調(diào)色的色素。這與姜文龍等[6]的研究結(jié)果一致。齊睿等[13]的研究也表明，在紅葉石楠葉片色彩變化中，葉綠素是呈色的基調(diào)色素，這也解釋了葉片為何最終呈現(xiàn)綠色。同時，轉(zhuǎn)綠較快的葉片中花青素含量急劇下降，而葉綠素和類胡蘿卜素含量呈增加趨勢，這解釋了不同品種間色彩轉(zhuǎn)綠有快有慢的原因。

對葉綠素、花青素、類胡蘿卜素的含量與葉片色彩參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，葉綠素含量與色彩參數(shù)L*、a*和b*值的相關(guān)性因品種而異，即葉綠素含量變化對觀賞海棠葉色的影響并非存在絕對性。而花青素含量與葉片紅綠色相a*值呈顯著或極顯著正相關(guān)，這與齊睿等[13]對紅葉石楠葉色的研究結(jié)果一致，即花青素含量的變化決定葉片紅綠色的快慢轉(zhuǎn)變。朱書香等[16]研究了紫葉李、紫葉矮櫻、黑桿櫻李和美人梅4 種彩葉植物葉色和色素的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)花青素含量與紅綠色相a*值呈顯著正相關(guān)。在本研究中，類胡蘿卜素含量與10 個觀賞海棠黃藍(lán)色相b*值均呈顯著正相關(guān)，即觀賞海棠葉片中類胡蘿卜素含量對葉色的黃藍(lán)色轉(zhuǎn)化速度有決定性影響。

3.3 觀賞海棠葉片色彩改良策略

我國是海棠資源分布中心[17]，海棠栽培歷史悠久，在18 世紀(jì)時中國海棠被引入歐美等國家，通過反復(fù)雜交和選育，他們培育出了大量觀賞價值極高的品種。有學(xué)者利用分子標(biāo)記手段對歐美觀賞海棠的親本進(jìn)行追溯，結(jié)果表明，觀賞海棠的親本主要是亞洲山荊子[Malus Baccata(L.) Borkh.]、蘋果（Malus pumila）、三葉海棠（Malus sieboldii）、楸子（Malus prunifolia）、新疆紅肉蘋果（Malus pumila‘Niedzwetzkyana’）等[17]。周婷等[1]對海棠品種的親本進(jìn)行追溯，發(fā)現(xiàn)本研究中的‘粉冠’和‘紫王子’都是由新疆紅肉蘋果雜交而來的。董聚苗[18]基于簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats, SSR）標(biāo)記法將70份觀賞海棠種質(zhì)分為3類，發(fā)現(xiàn)‘高原紅’和‘皇家雨點’親緣關(guān)系相近，‘完美紫’‘紫王子’‘粉冠’‘豐盛’親緣關(guān)系相近，遺傳性狀表現(xiàn)相似；本研究分析葉片色彩變化的結(jié)果與此一致，‘高原紅’和‘皇家雨點’葉片由紅變綠存在共性，葉片呈紅色周期都為35 d左右，‘完美紫’‘紫王子’‘粉冠’‘豐盛’葉片呈紅色周期僅為25 d 左右。張往祥等[4]研究表明，北美園藝家對海棠花色的雜交選育主要通過提高花青素含量來實現(xiàn)，以提高其觀賞價值。而本研究的10個北美觀賞海棠葉片的花青素含量較高，可能因為在選育高花青素含量的觀花品種時，其葉片中花青素含量也相應(yīng)提高，從而提高了其葉片的觀賞特性。