斑馬魚作為模式動物在人類眼睛疾病研究中的應用

邸亞男，朱麗英，錢 雯，潘 衛(wèi),3,4

（1. 北京大學第三醫(yī)院北方院區(qū)檢驗科，北京 100089；2. 貴州醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗學院，貴陽 550025；3. 貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院貴州省產(chǎn)前診斷中心，貴陽 550025；4. 貴州醫(yī)科大學環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點實驗室，貴陽 550025）

視力損害是危害人類健康的主要公共衛(wèi)生問題之一。據(jù)統(tǒng)計，至2010年全球范圍內(nèi)大約有2.85億人伴有不同類型及程度的眼睛疾病，其中約有0.39億人失明[1]。視力損害的主要病因有屈光不正、白內(nèi)障、年齡相關性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜變性和青光眼[2]。雖然眼睛疾病很少危及生命，但對個人、家庭及社會造成了巨大影響。因此，眼睛疾病的防治非常重要。然而，目前許多眼睛疾病的發(fā)病機制不明確，并且缺乏有效的治療方法。因此，能夠有效復制人類眼睛疾病且用于快速高通量藥物篩選的模式生物具有十分重要的應用價值。

作為一種新興模式生物，斑馬魚（Zebrafish，Danio rerio）已經(jīng)被廣泛用于人類血液系統(tǒng)疾病、肌肉系統(tǒng)疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心臟疾病、腎臟疾病及眼睛疾病等的研究[3]。目前，斑馬魚信息網(wǎng)絡（zebrafish information network，ZFIN）已經(jīng)收錄了大量斑馬魚突變品系及轉(zhuǎn)基因品系的相關信息。由于斑馬魚在眼睛形態(tài)、解剖結構、基因表達及功能等方面與人類存在著極大的相似性，并且具有發(fā)育快、體外受精、胚胎透明、易于觀察等優(yōu)勢，因此其在眼睛發(fā)育及疾病的研究中具有重要意義。

隨著基因編輯技術、表型精細篩選技術、行為學觀察技術和基因及其功能鑒定技術的發(fā)展，斑馬魚作為模式動物在眼睛疾病中的應用越來越廣泛，已被用于眼睛缺損、青光眼、白內(nèi)障、視桿視錐細胞變性和糖尿病視網(wǎng)膜病變等眼睛疾病的研究[4]。除此之外，斑馬魚模型能夠?qū)崿F(xiàn)高通量和高效率的藥物篩選，可為篩選治療眼睛疾病的藥物提供良好的平臺[5]。本文對斑馬魚的生物學及基因組學特性、眼睛發(fā)育及結構，以及作為研究眼睛疾病模型的優(yōu)缺點等進行綜述。

1 斑馬魚的生物學及基因組學特性

斑馬魚屬鯉科熱帶淡水魚，原產(chǎn)于印度恒河流域。野生型斑馬魚體梭形，體側具有5～7條縱向暗藍與銀色相間條紋，為低溫低氧魚，耐寒性和耐熱性都很強。斑馬魚為雜食動物，以浮游生物和昆蟲為食，人工喂養(yǎng)以蛋黃和輪蟲等為食，成魚可喂豐年蝦和紅蟲等。斑馬魚繁殖周期短，多為7 d左右，若溫度適宜，一年四季均產(chǎn)卵。雌雄魚交配行為受光照刺激，可通過調(diào)控光周期或控制雌雄魚的接觸，實現(xiàn)產(chǎn)卵時間控制。每尾雌魚每次產(chǎn)卵可達200～300枚，為非黏性沉性卵，直徑大約0.7 mm，因其密度比水大而沉于缸底。卵細胞體外受精，體外發(fā)育且速度快，胚體透明[6]。魚卵受精后24 h，其主要器官已經(jīng)基本形成；3 d后幼魚逐漸從卵殼孵出，并開始游動和覓食；大約3～4個月時，幼魚達到性成熟，可以繁殖后代[7]。斑馬魚生長發(fā)育非常快。成魚體長約3～5 cm，壽命2～3年。

斑馬魚品系眾多，常用的主要是野生型Tuebingen品系、AB品系、WILK品系及多個突變品系和轉(zhuǎn)基因品系[8]。目前主要的斑馬魚保存機構有國際斑馬魚資源中心 （Zebrafish International Resource Center，ZIRC）、中國斑馬魚資源中心（China Zebrafish Resource Center，CZRC）、依托于北京大學和清華大學的國家斑馬魚模式動物北方中心，以及南方醫(yī)科大學腫瘤研究所-香港科技大學人類疾病斑馬魚模型研究聯(lián)合實驗室等。

斑馬魚有25條染色體，多為中間著絲粒或端著絲粒。斑馬魚的全基因組約有1.5×109bp，堿基數(shù)量約為人類基因組的一半[7]。在英國Sanger研究所主持下，2001年開始了斑馬魚基因組測序，現(xiàn)轉(zhuǎn)由Genome Reference Consortium（GRC）主持。GRC在2014年9月發(fā)布了斑馬魚基因組最新版本 Zv10（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000002035.5/），且會不斷更新?；蜃⑨層媱澨崾?，斑馬魚約有26 000個蛋白編碼基因[9]。人類70%的蛋白編碼基因在斑馬魚中有同源基因。但斑馬魚基因組也有一些與脊椎動物不同的特性，如假基因較少、重復序列較多等[7]。由于在輻鰭魚進化歷程中發(fā)生了硬骨魚類特異的全基因組復制事件（teleost-specific genome duplication，TSD），斑馬魚的蛋白編碼基因與人類蛋白編碼基因并不是一對一的關系，大多數(shù)人的基因在斑馬基因組中有兩個或多個拷貝[10]。例如，在人類基因組中，SRY 相關 HMG盒轉(zhuǎn)錄因子11（SRY-related HMG-box transcription factor 11，SOX11）基因僅存在一個拷貝，而在斑馬魚基因組中則存在兩個拷貝：SOX11a和SOX11b[11]。因此，為了更好地利用斑馬魚這種模式生物，需要高質(zhì)量的斑馬魚基因組學信息，并且將其與人類基因組進行差異分析。

2 斑馬魚的眼睛發(fā)育、結構及功能

斑馬魚的發(fā)育非常迅速。根據(jù)斑馬魚在受精后3 d內(nèi)的發(fā)育形態(tài)學變化，可以將其發(fā)育過程分為8個大的時期，即受精卵期、分裂期、囊胚期、原腸胚期、體節(jié)期、咽裂期及孵化期和幼魚階段[12]。脊椎動物的眼睛發(fā)育具有嚴格保守性。眼睛發(fā)育大致來源于3種胚胎組織。其中，視網(wǎng)膜、色素上皮、視柄及睫狀緣來源于神經(jīng)外胚層；晶狀體和角膜來源于皮膚外胚層；鞏膜和角膜的連接組織主要來源于神經(jīng)嵴起源的頭部間質(zhì)[13]。斑馬魚的眼睛發(fā)育順序也類似于大多數(shù)脊椎動物。

斑馬魚眼睛發(fā)育的基本過程見圖1。約在10 hpf （hours post fertilization，受精后小時數(shù)）左右，受精卵第一個體節(jié)形成，胚胎發(fā)育進入體節(jié)期。此時期的胚胎中，包括視原基在內(nèi)的各個器官原基相繼形成；該期持續(xù)到24 hpf，大部分器官基本成型，但尚未有功能[12]。視原基起源于前腦的神經(jīng)龍骨突，于神經(jīng)龍骨前部延長形成“wing-like”結構，“wing-like”結構通過視柄與前腦相連。約15 hpf時，神經(jīng)視網(wǎng)膜與色素上皮開始出現(xiàn)；約16 hpf時，晶狀體基板開始形成；約24 hpf時，“wing-like”結構旋轉(zhuǎn)并內(nèi)陷形成視杯，玻璃體動脈通過成形的脈絡膜裂進入視杯。在30 hpf時，角膜上皮形成于外胚層表面，并覆蓋晶體[14]；36 hpf時，視杯嵌入腦部，脈絡膜裂開始閉合，基質(zhì)細胞和韌帶覆蓋脈絡膜；48 hpf時，脈絡膜裂完全閉合，視神經(jīng)延伸至視頂蓋；50 hpf時，內(nèi)核層的無長突細胞和水平細胞開始出現(xiàn)；55 hpf時，外核層視桿和視錐細胞外節(jié)形成；60 hpf時，雙極細胞出現(xiàn)[15]；約72 hpf時，斑馬魚幼魚具有視覺功能，同時眼周圍的肌肉發(fā)育成熟并具有功能，這是斑馬魚具有視動功能的先決條件[16]。

圖 1 斑馬魚眼睛發(fā)育過程示意圖Figure 1 Schematic diagram of eye development in zebrafish

與哺乳動物不同的是，在某種程度上可以說，斑馬魚的視網(wǎng)膜從不會停止發(fā)育，成熟斑馬魚的視網(wǎng)膜仍然在增殖。所有類型的視網(wǎng)膜細胞都不斷地從睫狀緣的周圍生發(fā)中心產(chǎn)生。另外，視錐細胞也不斷地由視錐祖細胞生成。位于內(nèi)核層的Müller神經(jīng)膠質(zhì)細胞可以在視網(wǎng)膜受損傷時，修復產(chǎn)生所有類型的視網(wǎng)膜細胞[17]。另外，嚙齒類動物體內(nèi)存在抑制性因子，而缺乏促生長因子，其視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞軸突不可再生；與之不同的是，斑馬魚體內(nèi)存在大量促生長因子，其神經(jīng)節(jié)細胞軸突可再生，從而恢復視功能[18]。

斑馬魚眼睛結構與人類有很大相似性，但也有一定區(qū)別（表1，圖2），在應用斑馬魚復制人類眼睛疾病時應注意二者的差異。首先，人和斑馬魚的眼睛形狀與位置不同。人眼睛為圓形，而斑馬魚眼睛為橢圓形，因而斑馬魚的玻璃體較少。人眼睛位于頭面部前方，雙眼視覺高度交叉；而斑馬魚眼睛位于頭兩側，雙眼視覺交叉甚小[19]。其次，人和斑馬魚的視網(wǎng)膜各層厚度不一樣。斑馬魚視網(wǎng)膜由6種神經(jīng)元細胞和Müller神經(jīng)膠質(zhì)細胞組成。與人類視網(wǎng)膜相似，斑馬魚視網(wǎng)膜由內(nèi)向外分為5層（圖2A和2B）：神經(jīng)節(jié)細胞層、內(nèi)叢狀層（包含雙極細胞、無長突細胞和神經(jīng)節(jié)細胞的突觸連接[20]）、內(nèi)核層（包含雙極細胞、無長突神經(jīng)細胞、水平細胞胞體和Müller神經(jīng)膠質(zhì)細胞胞質(zhì)[20]）、外叢狀層（包含感光細胞與雙極細胞、水平細胞的突觸連接）和外核層（包含感光細胞：視錐和視桿細胞）[14,16,20]。

表 1 人類眼睛和斑馬魚眼睛的差異Table 1 Differences between human eyes and zebrafish eyes

另外，斑馬魚神經(jīng)節(jié)細胞都是有髓鞘的，而人類神經(jīng)節(jié)細胞視網(wǎng)膜部分的突觸是脫髓鞘的，只有視神經(jīng)部分有髓鞘。視網(wǎng)膜在視覺形成過程中發(fā)揮著重要作用。外界光線投射到眼球表面，經(jīng)過屈光介質(zhì)到達視網(wǎng)膜，并被視網(wǎng)膜上感光細胞捕獲，將光信號轉(zhuǎn)化為化學信號，再通過雙極細胞傳遞至視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞，最后經(jīng)視神經(jīng)通路投射到大腦皮層（感光細胞—雙極細胞—神經(jīng)節(jié)細胞）。除此之外，該轉(zhuǎn)化后的化學信號還可以通過間接途徑，由雙極細胞傳遞給神經(jīng)節(jié)細胞（感光細胞—水平細胞—雙極細胞—無突觸細胞—神經(jīng)節(jié)細胞）（圖2C）[21]。外核層外面有視網(wǎng)膜色素細胞上皮（r e t i n a l p i g m e n t e d epithelium，RPE）層包裹。RPE主要功能是為視網(wǎng)膜提供營養(yǎng)物質(zhì)、氧化應激調(diào)控和維持感光細胞外節(jié)的代謝。在發(fā)育過程中，RPE的缺陷可導致眼缺損、小眼畸形及無眼等眼睛疾病[13]。

斑馬魚的感光細胞即視錐細胞和視桿細胞的形態(tài)學特點與人類相似，由胞體和頂端域構成。頂端域由一個近端內(nèi)節(jié)和一個遠端外節(jié)構成。其中，外節(jié)由膜盤堆積而成，包含能捕獲光量子的視蛋白。外節(jié)可脫落并更新，脫落的頂端被相鄰的RPE吞噬[13,22]。斑馬魚和人類均是晝行性動物，其白天視力主要由視錐細胞控制。與夜行性嚙齒類動物如小鼠和大鼠等不同，斑馬魚的視力幾乎全部由視錐細胞控制[23]。斑馬魚的視錐細胞分為4種，分別是短單（紫外線敏感）、長單（藍光敏感）、長雙（紅光敏感）和短雙（綠光敏感）（圖2 D）[20]。這4種視錐細胞以“馬賽克（mosaic）”模式排列，即成排分布的雙錐細胞和單錐細胞交替排列[24]。由于斑馬魚具有4種視錐細胞，所以可產(chǎn)生四色視覺；而人類缺乏紫外線-敏感視錐細胞，只有三色視覺[25-26]。斑馬魚的視桿細胞只有1種，并且以視紫紅質(zhì)為發(fā)色團。另外，需要說明的是，雖然斑馬魚的視網(wǎng)膜在5 dpf時形態(tài)學發(fā)育上已經(jīng)完善，但至少在15 dpf時才能發(fā)揮功能[23]。

眼前段結構（角膜、晶體、虹膜、睫狀體和角膜虹膜角）是光線進入眼睛到視網(wǎng)膜的途徑，對調(diào)節(jié)眼內(nèi)壓有重要作用。斑馬魚的眼前段結構與高級脊椎動物相似，但亦存在差異。斑馬魚的虹膜基質(zhì)缺乏肌細胞，不具有收縮能力，無環(huán)狀肌。與虹膜前部相連的部位被稱為睫狀區(qū)，而非睫狀“體”。睫狀上皮功能具有背腹差異，背側睫狀上皮主要是產(chǎn)生房水，而腹側則是房水排出通路[27]。斑馬魚的房水回流機制與人類亦存在差異。另外，斑馬魚的小梁網(wǎng)基質(zhì)組成及超微結構也和人類有區(qū)別[28]。因此，在利用斑馬魚研究人類眼睛疾病時應注意以上差異。

3 斑馬魚作為眼睛疾病模型的優(yōu)勢

3.1 斑馬魚作為模式生物的一般優(yōu)勢

自從遺傳學家George Streisinger將斑馬魚用于人工雌核的發(fā)育研究[3]后，斑馬魚作為模式生物逐漸引起了人們的極大關注。斑馬魚作為模式生物具有以下優(yōu)點：（1）體型小且價廉，適于大規(guī)模養(yǎng)殖；（2）產(chǎn)卵量大，發(fā)育快，生長周期短，3～5個月性成熟即進入繁殖期；（3）胚胎透明，體外受精和發(fā)育，易于觀察和操作；（4）斑馬魚基因組與人類基因組相似度很高，且其基因表達序列標簽（expressed sequence tags，ESTs）足夠多，已有約7萬個ESTs被鑒定（http://danio.mgh.harvard.edu/chrMarkers/zfssr.html）；（5）斑馬魚可用于大規(guī)模藥物或化學分子的高通量篩選；（6）品系資源豐富；（7）精子可以冷凍保存[29]。

3.2 斑馬魚作為眼睛疾病模型的獨特優(yōu)勢

斑馬魚在眼睛疾病研究中具有獨特的優(yōu)勢。例如，其體型相對較小，但眼睛比較大，易于觀察和操作；眼睛發(fā)育快，72 hpf已具有功能。斑馬魚作為模式生物越來越多地用于眼睛和視力相關疾病的遺傳篩選和表型篩選。

傳統(tǒng)的遺傳篩選方法大致可分為正向遺傳學和反向遺傳學。正向遺傳學一般是通過生物體的自發(fā)突變或人工誘變，尋找表型遺傳的突變個體，從而找到對應的突變基因，并揭示其功能。通過該方法往往可以找到新基因。目前，利用該技術已經(jīng)篩選并鑒定了影響眼睛和視力的相關疾病的大量基因[30]。人工誘變的方法有放射線導致基因缺失或突變，以及各種化學誘變劑誘導基因發(fā)生點突變。常用的化學誘變劑有乙基亞硝基脲（ethylnitrosourca，ENU）。ENU通過對DNA堿基烷基化，誘導DNA復制時發(fā)生錯配或堿基置換，產(chǎn)生單個核苷酸突變；其突變效率高，突變具有隨機性，無傾向性[31]。另外，用于正向遺傳篩選的策略包括反轉(zhuǎn)錄病毒或基因誘捕技術介導的大規(guī)模插入突變，這種策略也被相繼應用到斑馬魚的基因突變研究中。Goss等[32]利用反轉(zhuǎn)錄病毒介導的插入突變技術篩選到了40個與視覺系統(tǒng)發(fā)育和功能有關的基因，如Cyclin A2、MCM2和NRR-1等。

反向遺傳學，即通過基因敲除或轉(zhuǎn)基因技術改變某個特定基因的功能，尋找有關的表型變化。用于斑馬魚反向遺傳學研究的有定向誘導基因組突變技術（targeting induced local lesions in g e n o m e s，T I L L I N G）、R N A干擾（R N A interference，RNA i）技術、反義寡核苷酸（morpholino，MO）、鋅指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFN）技術、類轉(zhuǎn)錄激活樣效應因子核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）和成簇的規(guī)律間隔短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及其相關蛋白9（CRISPR-associated protein 9，Cas9）技術[30]。Lee等[33]利用MO技術敲低Bcl6a基因表達，引起斑馬魚眼睛缺損。CRISPR/Cas9作為新興的基因編輯技術，在反向遺傳學及基因治療方面也具有重大價值；目前該技術的應用已擴展到先天性白內(nèi)障、先天性青光眼、視網(wǎng)膜色素變性等遺傳性眼睛疾病的基因治療[34]。

事實上，目前有多個實驗室和機構在開展斑馬魚模式生物相關的基因突變研究工作（表2），如Sanger研究所資助的ZMP計劃（Zebrafish Mutation Project）、歐盟資助的ZF-HEALTH計劃（Zebrafish Regulomics for Human Health）、國際斑馬魚誘捕協(xié)會的多家實驗室通過插入誘變獲得的突變庫（即zifishbook插入突變數(shù)據(jù)庫）等。另外，有一些網(wǎng)絡在線免費工具可以用來搜尋和設計特定基因突變斑馬魚所需要的靶點，如ZIFIT（Zinc Finger Targeter，http://zifit.partners.org/ZiFiT/）可以用來搜尋和設計ZFN、TALEN和CRISPER等基因編輯技術所需的靶點序列，Mojo Hand（http://talendesign.com/mojohand.main.php）可以用來搜尋和設計TALEN所需的靶點序列。

表 2 斑馬魚基因突變研究計劃常用的突變技術和數(shù)據(jù)庫及網(wǎng)站鏈接Table 2 Mutation technologies, databases and website links of zebrafish gene mutation research programs

目前，斑馬魚的表型篩選主要是通過形態(tài)學、視覺行為學、成像系統(tǒng)及基因表達進行的。從形態(tài)學觀察眼睛的大小、形狀與位置以及色素表達等是比較簡單和直接的方法。斑馬魚可以通過周圍光線情況調(diào)節(jié)其色素表達，若其視覺有問題而不能感受光線變化，則其色素表達量比正常多，利用這種特點可以進行視覺損傷的篩選。另外，目前國際斑馬魚資源中心有大量標記斑馬魚眼睛組織的抗體（http://zfin.org/action/antibody/search），可以用免疫組織化學法來進行相應抗原的檢測。斑馬魚行為學觀察是篩查其視力損害的有效方法，包括觀察視動和眼動行為學變化、驚恐反應、逃避反應、趨光反應和背光反應等[35]。但需要注意的是，行為學觀察法具有一定的局限性，例如肌肉損傷影響斑馬魚的運動功能時，可能會錯誤地認為是視覺損傷。因此，為了確保結果可靠性，可以應用另外的方法來確證，如可以應用視網(wǎng)膜電圖進行視網(wǎng)膜功能的檢測[36]。

4 斑馬魚模型在眼睛疾病研究中的應用

目前，斑馬魚已經(jīng)作為模式生物成功地應用于多種眼睛疾病的研究中。Neuhauss等[37]利用視動和眼動視覺行為觀察了450尾基因突變斑馬魚，并從色素形成和組織形態(tài)等方面鑒定其眼睛損害，最后發(fā)現(xiàn)了多種引起視力損害的基因突變，包括晶體異常基因（SANDY）、軸突生長異常基因（GRUMPY、SLEEPY、PINSCHER）和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞缺失基因（LAKRITZ）等。Gross等[32]對利用反轉(zhuǎn)錄病毒誘導插入突變的250尾斑馬魚進行了眼睛形態(tài)學及視覺行為學檢測，最后發(fā)現(xiàn)了40個引起眼睛發(fā)育異常和/或視覺功能損害的突變位點，如與早期眼睛發(fā)育形態(tài)有關的NDR2，與感光細胞損傷有關的NRF1、IXL和PWI。另外，截至目前，已經(jīng)利用基因突變成功建立了先天性白內(nèi)障、青光眼、糖尿病視網(wǎng)膜病、老年黃斑變性及先天性眼球震顫等眼睛疾病的斑馬魚動物模型[38]。例如，叉頭轉(zhuǎn)錄因子1基因主要表達在眼前段及眼周間質(zhì)細胞中，與眼前段的發(fā)育與形態(tài)維持有關，該基因的缺陷可以引起斑馬魚類似青光眼表型的病理改變，如虹膜、小梁網(wǎng)和角膜異常[39]。低密度脂蛋白受體相關蛋白2基因突變可引起斑馬魚眼睛變大、眼壓升高及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量逐漸減少等類似青光眼病變[40]。與人眼睛疾病相關的斑馬魚模型及基因突變和誘導方式總結見表3。

5 總結

視力損害是全球范圍內(nèi)廣受關注的公共衛(wèi)生問題之一，研究其病理機制及治療方法十分重要。由于斑馬魚的眼睛發(fā)育及形態(tài)結構等與人類有相似性，并具有易于繁殖、生長發(fā)育較快、眼睛較大、易于觀察等優(yōu)勢，斑馬魚成為了研究人類視力損傷的一種理想模式生物。同時也應該注意到其與人類眼睛的差異，比如斑馬魚是四色視覺，而人類是三色視覺，從而在利用斑馬魚模型進行人類眼睛疾病相關研究時設計實驗更科學，得出結論更嚴謹。

表 3 與常見眼睛疾病相關的斑馬魚模型Table 3 Zebrafish models related to common eye diseases