老年SD大鼠自發(fā)性腫瘤的病理學(xué)觀察

周曉麗，張 倩，高 崢，錢(qián)智勇

（天津市疾病預(yù)防控制中心毒理科，天津 300011）

新藥致癌性研究是藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容，通過(guò)考察藥物在動(dòng)物體內(nèi)的潛在致癌作用，評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)可能對(duì)人體造成的危害，并以風(fēng)險(xiǎn)控制計(jì)劃、說(shuō)明書(shū)、臨床監(jiān)察、上市后監(jiān)測(cè)等手段進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)控制[1]。由于致癌試驗(yàn)需要6個(gè)月以上甚至更長(zhǎng)（國(guó)際上致癌試驗(yàn)一般周期為24個(gè)月）的動(dòng)物給藥時(shí)間，對(duì)動(dòng)物質(zhì)量（高質(zhì)量的動(dòng)物可避免自發(fā)疾病對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響）、動(dòng)物房環(huán)境、動(dòng)物福利以及操作人員的技術(shù)要求（比如避免連續(xù)24個(gè)月經(jīng)口給藥時(shí)發(fā)生操作失誤）比較高。在致癌試驗(yàn)動(dòng)物（尤其是大鼠的品系）選擇中，針對(duì)不同藥物可以更好更合理挑選動(dòng)物品種、品系和性別（如果需要）。在組織病理分析和診斷中，更準(zhǔn)確判斷腫瘤和藥物的關(guān)系，綜合評(píng)價(jià)藥物對(duì)動(dòng)物的致癌影響[2]。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室最近開(kāi)展的一項(xiàng)SD大鼠致癌試驗(yàn)，本文分析該試驗(yàn)中對(duì)照組120只SD大鼠喂飼2年后的各種腫瘤發(fā)生率，并進(jìn)行病理學(xué)觀察。由于對(duì)照組未經(jīng)染毒和任何人為干擾，可以認(rèn)為其發(fā)生的腫瘤病變及其發(fā)生率的高低在進(jìn)行致癌試驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)時(shí)具有重要的參照價(jià)值。另外，不同品系及不同批次大鼠的自發(fā)腫瘤及其發(fā)生率可存在一定的差異，本文進(jìn)一步豐富了現(xiàn)有SD大鼠自發(fā)腫瘤病變及其發(fā)生率的資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)環(huán)境

致癌試驗(yàn)中正常對(duì)照組SPF級(jí)SD大鼠120只，雌雄各半，體質(zhì)量40～60 g，4周齡，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK（京）2012-0001]。所有大鼠飼養(yǎng)于天津市疾病預(yù)防控制中心屏障設(shè)施內(nèi)[SYXK（津）2014-0001]，室溫控制在20～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，12 h照明，12 h黑暗。動(dòng)物按不同性別分籠飼養(yǎng)，對(duì)照組食用常規(guī)動(dòng)物飼料，自由飲水，每周更換1次鼠盒及墊料。所有動(dòng)物檢疫觀察1周，即觀察動(dòng)物的活動(dòng)、飲食等表現(xiàn)。動(dòng)物在使用前，經(jīng)獸醫(yī)檢查合格后進(jìn)行致癌試驗(yàn)。

1.2 儀器與試劑

全自動(dòng)Thermo染色機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo Electron公司，ASP3000全自動(dòng)封閉脫水機(jī)和EG1150H石蠟包埋機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司，BX51顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司，CP323S天平購(gòu)自德國(guó)Sartorius公司，蘇木精和伊紅染色液購(gòu)自哈爾濱格林標(biāo)本技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 大體病理學(xué)檢查

致癌試驗(yàn)周期為104周，試驗(yàn)結(jié)束后用戊巴比妥鈉（50 mg/kg，腹腔注射）麻醉動(dòng)物，通過(guò)腹主動(dòng)脈取血法將動(dòng)物安樂(lè)死。常規(guī)檢查動(dòng)物體質(zhì)、發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)狀況，檢查口、鼻、外耳、肛門(mén)和外生殖器等有無(wú)異常。系統(tǒng)剖檢包括臟器的位置、大小、色澤和質(zhì)地是否正常，有無(wú)粘連、腫瘤等，胸腔、心包、腹腔及顱腔有無(wú)積液或出血。著重檢查皮膚、皮下及各臟器有無(wú)包塊，注意包塊的色澤、硬度和大小等。試驗(yàn)期間每日進(jìn)行臨床觀察，將自然死亡與瀕死的動(dòng)物及時(shí)進(jìn)行剖檢。

1.4 組織病理學(xué)檢查

對(duì)致癌試驗(yàn)過(guò)程中死亡的動(dòng)物、因?yàn)l死而被處死的動(dòng)物、試驗(yàn)結(jié)束時(shí)所有存活動(dòng)物處死后均進(jìn)行全面的大體解剖，解剖時(shí)詳細(xì)記錄腫瘤的部位、形狀、大小、質(zhì)地、顏色和腫瘤個(gè)數(shù)等。將下列組織用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的甲醛溶液固定，供進(jìn)一步組織病理學(xué)觀察：病變及腫瘤組織、腦（包括大腦、小腦、腦干）、脊髓、心、肺、氣管、肝、脾、腎、胰、食管、胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸、膀胱、腎上腺、垂體、甲狀腺（包括甲狀旁腺）、胸腺、附睪、睪丸、前列腺、卵巢、子宮、肌肉、骨、淋巴結(jié)和眼球等臟器。取固定的組織和器官，經(jīng)脫水后石蠟包埋，切片（厚度為3～5μm），蘇木精-伊紅（H E）染色，光學(xué)顯微鏡檢查。診斷術(shù)語(yǔ)參照美國(guó)毒性病理學(xué)會(huì)（Society of Toxicology Pathology）指導(dǎo)文件Standardized System of Nomenclature and Diagnostic Criteria。天津市疾病預(yù)防控制中心毒理科負(fù)責(zé)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，并計(jì)算各種腫瘤病變的發(fā)生率。

1.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用x-±s表示，兩組均值間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，率的比較用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

對(duì)120只SD大鼠在不同時(shí)間段的死亡率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。由于試驗(yàn)過(guò)程中死亡7只，且發(fā)現(xiàn)時(shí)臟器已發(fā)生自溶，失去病理學(xué)觀察意義，因此僅對(duì)113只大鼠進(jìn)行了病理學(xué)檢查，其中雌性大鼠56只，雄性大鼠57只。試驗(yàn)期間觀察到這些大鼠的臨床主要表現(xiàn)為體表腫塊、脫毛、步態(tài)異常、活動(dòng)減少、消瘦、腹瀉、會(huì)陰污穢、眼有血性分泌物等，個(gè)別動(dòng)物出現(xiàn)下肢癱瘓和血尿。

2.2 死亡率

雌性大鼠最早死亡時(shí)間為試驗(yàn)第49周，雄性大鼠最早死亡時(shí)間為第62周。死亡動(dòng)物解剖時(shí)未發(fā)現(xiàn)異常，病理學(xué)觀察無(wú)器質(zhì)性病變。試驗(yàn)第27～52周時(shí)動(dòng)物死亡率為1.7%（2/120），雌性大鼠死亡率略高于雄性大鼠；隨著時(shí)間延長(zhǎng)，死亡率呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，第53～78周死亡率為16.7%（20/120），雌雄大鼠死亡率相當(dāng)；第79～104周死亡率為41.7%（50/120），雌性大鼠死亡率高于雄性（表1）。

表 1 20只SD大鼠不同時(shí)間段死亡率Table 1 Mortality of 120 SD rats in different time periods[n(%)]

2.3 腫瘤發(fā)生情況

總體腫瘤發(fā)生率為66.4%，單發(fā)和多發(fā)性腫瘤比例相似，詳見(jiàn)表2。

表 2 113只SD大鼠自發(fā)性腫瘤發(fā)生情況Table 2 Spontaneous tumorigenesis in 113 SD rats[n(%)]

2.4 良性腫瘤病理類(lèi)型

雄性大鼠以垂體腺瘤最多見(jiàn)（36.5%），其次是腎上腺髓質(zhì)腺瘤（7.0%）。垂體腺瘤在解剖時(shí)可見(jiàn)垂體腫大，大小約0.3 cm×0.4 cm×0.4 cm，可與周?chē)M織完全剝離，有些可見(jiàn)局部出血；主要表現(xiàn)為嗜酸性腺瘤、嗜堿性腺瘤、嫌色細(xì)胞腺瘤和混合細(xì)胞腺瘤，其中嗜酸性細(xì)胞腺瘤多見(jiàn)，嫌色細(xì)胞腺瘤少見(jiàn)。其他的良性腫瘤有腎上腺皮質(zhì)腺瘤、甲狀腺瘤、皮膚纖維瘤和脂肪瘤等。

雌性大鼠以垂體腺瘤（50.0%）、乳腺纖維腺瘤（12.5%）和乳腺腺瘤（12.5%）最多見(jiàn)。垂體腺瘤臨床表現(xiàn)和大體解剖所見(jiàn)與前述的雄性大鼠基本相同。乳腺良性腫瘤大體解剖可見(jiàn)乳腺部位皮下單個(gè)或多個(gè)腫塊，最大直徑可達(dá)11～16 cm，可與周?chē)M織剝離，灰白色或伴有紅色區(qū)域。雌性大鼠其他良性腫瘤病變有腎上腺髓質(zhì)腺瘤、皮膚纖維瘤、甲狀腺腺瘤、子宮內(nèi)膜息肉和子宮平滑肌瘤等（表3）。

表 3 SD大鼠良性腫瘤病變類(lèi)型及發(fā)生率Table 3 Histological types and incidences of benign neoplastic lesions in SD rats[n(%)]

2.5 惡性腫瘤病理類(lèi)型及其發(fā)生率

從表4可見(jiàn)，雄性大鼠惡性腫瘤主要有甲狀腺癌（1.8%）和皮膚纖維肉瘤（1.8%），雌性大鼠惡性腫瘤主要有乳腺癌（25.0%）、皮膚纖維肉瘤（3.6%）、膀胱移形上皮細(xì)胞癌（1.8%）和肝癌（1.8%）等。有的動(dòng)物腮部出現(xiàn)腫瘤，剛發(fā)現(xiàn)時(shí)多為直徑約1 cm的輕微隆起，長(zhǎng)到直徑約3～5 cm時(shí)呈球形隆起，后期腫瘤表面潰破，內(nèi)部壞死，腫瘤壓迫一側(cè)眼睛和耳朵，也影響口腔攝食，解剖時(shí)與周?chē)M織界限不清，經(jīng)病理檢查其為腺癌。發(fā)生于內(nèi)臟器官的惡性腫瘤多數(shù)在動(dòng)物死亡后才發(fā)現(xiàn)，可見(jiàn)惡性腫瘤病變已擴(kuò)散到周?chē)M織，與周?chē)M織粘連在一起，或擴(kuò)散至全身器官。此外，生長(zhǎng)在皮下的球形惡性腫瘤病變與皮下良性細(xì)胞球形腫瘤的臨床和大體解剖情況類(lèi)似，但生長(zhǎng)較快，瘤體較大，腫瘤中心部位可見(jiàn)壞死，病理類(lèi)型為纖維肉瘤，一般并發(fā)脾臟腫大，光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)脾臟髓外造血增加。典型腫瘤組織經(jīng)HE染色后病理學(xué)觀察結(jié)果見(jiàn)圖1。

表 4 SD大鼠惡性腫瘤病變類(lèi)型及發(fā)生率Table 4 Histological types of malignant neoplastic lesions in SD rats and their incidences[n(%)]

圖 1 大鼠自發(fā)性腫瘤病理組織學(xué)觀察（HE染色）Figure 1 Pathological observation of spontaneous tumors in rats (HE staining)

3 討論

自發(fā)腫瘤是大鼠生物學(xué)特征的重要表現(xiàn)形式之一。自1979年開(kāi)始，有報(bào)道顯示裸小鼠可自發(fā)腫瘤，隨后國(guó)外陸續(xù)有SPF級(jí)大鼠自發(fā)腫瘤的報(bào)道[3-4]。本文通過(guò)對(duì)新藥致癌試驗(yàn)期為104周的正常對(duì)照組113只SD大鼠自發(fā)腫瘤的組織病理學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行詳細(xì)分析，總結(jié)了雄性和雌性SD大鼠各種自發(fā)良性和惡性腫瘤病變及其發(fā)生率；結(jié)果顯示，雄性大鼠以垂體腺瘤和腎上腺髓質(zhì)腺瘤高發(fā)，雌性大鼠以垂體腺瘤、乳腺纖維腺瘤和乳腺腺瘤高發(fā)，這些高發(fā)的腫瘤均為良性腫瘤。肖成榮等[5]對(duì)喂養(yǎng)2年的Wistar大鼠生存、體質(zhì)量及進(jìn)食量進(jìn)行觀察與分析，發(fā)現(xiàn)雄性大鼠死亡率、死亡動(dòng)物平均活存時(shí)間具有高于雌性大鼠的趨勢(shì)，雌性大鼠的自發(fā)性腫瘤發(fā)生率較雄性大鼠略高，并且存在同一只大鼠多器官發(fā)生腫瘤的現(xiàn)象。

腫瘤的發(fā)生與性別相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，雌性大鼠惡性腫瘤發(fā)生率高于雄性大鼠。動(dòng)物腫瘤生態(tài)學(xué)研究[6]結(jié)果表明，在1 077例腫瘤中，雌性動(dòng)物的腫瘤發(fā)生率高于雄性和去勢(shì)動(dòng)物，雌性占48.7%，雄性占40%，去勢(shì)動(dòng)物占11.3%。性別差異也因腫瘤良惡性不同有所區(qū)別。良性腫瘤中，雄性動(dòng)物的檢出例數(shù)多于雌性和去勢(shì)動(dòng)物；惡性腫瘤則相反，雌性動(dòng)物的檢出例數(shù)明顯多于雄性和去勢(shì)動(dòng)物。雌性大鼠惡性腫瘤發(fā)生率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于雄性大鼠的原因可能是，檢出率高的好發(fā)惡性腫瘤如乳腺癌等多發(fā)生于雌性大鼠。本文還詳細(xì)介紹了與腫瘤病變相關(guān)的臨床表現(xiàn)和大體解剖所見(jiàn)，可為相關(guān)技術(shù)人員特別是初次開(kāi)展SD大鼠致癌試驗(yàn)的人員提供一些參考和借鑒。

根據(jù)腫瘤發(fā)生率進(jìn)行評(píng)定時(shí)，主要通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性檢驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)，如果染毒組的腫瘤發(fā)生率高于對(duì)照組且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（最好具有劑量-反應(yīng)關(guān)系），則認(rèn)為致癌試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性[7]。有研究[8]表明，當(dāng)對(duì)照組腫瘤自發(fā)率分別為1%、5%、10%、20%和30%，染毒組腫瘤發(fā)生率相應(yīng)為20%、30%、40%、50%和60%時(shí)，才有90%的把握度獲得陽(yáng)性結(jié)果。動(dòng)物數(shù)不變的情況下，如果對(duì)照組動(dòng)物自發(fā)性腫瘤發(fā)生率很高，則可降低統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性檢驗(yàn)的效率，掩蓋受試物所引起的腫瘤病變發(fā)生率的增高，干擾對(duì)研究結(jié)果的準(zhǔn)確評(píng)價(jià)[7]。

不同實(shí)驗(yàn)室、不同品系大鼠、不同批次大鼠以及不同時(shí)間開(kāi)展的致癌試驗(yàn)中，動(dòng)物自發(fā)性腫瘤類(lèi)型及其發(fā)生率可存在一定的差異。對(duì)于同一種屬、同一品系、同一實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)的大鼠，其自發(fā)腫瘤的發(fā)生率隨著動(dòng)物生命周期的延長(zhǎng)而增加[9]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。有文獻(xiàn)報(bào)道[10]，176只SD大鼠中雄性大鼠良惡性腫瘤發(fā)生率分別為35.6%和16.1%，雌性大鼠良惡性腫瘤發(fā)生率分別為61.8%和15.7%；本研究中雄性大鼠良惡性腫瘤發(fā)生率分別為50.9%和3.5%，雌性大鼠良惡性腫瘤發(fā)生率分別為51.8%和32.1%。文獻(xiàn)[10]報(bào)道中雄性大鼠惡性腫瘤發(fā)生率高于本研究結(jié)果，這種現(xiàn)象可能與SD大鼠來(lái)源、樣本數(shù)量和飼養(yǎng)條件等因素有關(guān)。Son[11]統(tǒng)計(jì)了1 284只雄性SD大鼠和1 264只雌性SD大鼠的自發(fā)腫瘤情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SD大鼠最常發(fā)生的腫瘤為垂體腺瘤，其次為乳腺纖維腺瘤和乳腺癌；在50周致癌實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)安樂(lè)死的動(dòng)物中，垂體腺瘤的發(fā)生率分別為雄性37%和雌性79.5%。本研究中腫瘤發(fā)生率最高的類(lèi)型分別是雄性大鼠的垂體腺瘤和腎上腺髓質(zhì)腺瘤，雌性大鼠的垂體腺瘤、乳腺纖維腺瘤和乳腺腺瘤，其中垂體腺瘤的發(fā)生率分別為雄性36.8%和雌性50.0%，且雌性發(fā)生率高于雄性，這與Son的結(jié)果一致。

SD大鼠、F344大鼠和TR1及TR2系大鼠自發(fā)腫瘤發(fā)生率的資料表明，這些品系大鼠的自發(fā)腫瘤也以垂體腺瘤和乳腺瘤最高發(fā)[12-15]。這些品系大鼠中以 SD大鼠的自發(fā)腺瘤發(fā)生率最高，可達(dá)70%；本研究中113只SD大鼠自發(fā)腫瘤總體發(fā)生率為66.4%，與該結(jié)論接近。本文報(bào)告的SD大鼠自發(fā)腫瘤及其發(fā)生率進(jìn)一步豐富了現(xiàn)有SPF級(jí)SD大鼠自發(fā)性腫瘤的數(shù)據(jù)資料，可為我國(guó)毒性致癌試驗(yàn)的安全性評(píng)價(jià)提供一定的參考和借鑒。