范姝瓊 , 鄭 莉
[1. 迪哲(上海)醫(yī)藥有限公司,上海 201203;2. 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200433]
原癌基因編碼蛋白人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)作為表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)家族成員之一,當(dāng)基因擴(kuò)增或過表達(dá)時(shí)會(huì)形成同源二聚體,或與EGFR家族其他成員形成異源二聚體,激活下游細(xì)胞通路,影響細(xì)胞的生長與增殖等功能[1-2]。腫瘤分子標(biāo)志物存在于腫瘤組織中,當(dāng)機(jī)體發(fā)生癌變時(shí),與之相對(duì)應(yīng)的癌因子會(huì)發(fā)生功能性的改變。因此,通過對(duì)腫瘤分子標(biāo)志物的檢測(cè)可以及早發(fā)現(xiàn)腫瘤患者,并監(jiān)測(cè)其臨床治療效果以及評(píng)估預(yù)后。腫瘤分子標(biāo)志物在細(xì)胞中的精準(zhǔn)定位及表達(dá)水平與分子靶向藥物的治療效果密切相關(guān)[3]。在早期藥物研發(fā)階段,通過腫瘤分子標(biāo)志物檢測(cè)和判讀,可以直接驗(yàn)證靶向化合物的作用機(jī)制,分析化合物在動(dòng)物模型中達(dá)到的藥效動(dòng)力學(xué),幫助了解藥效動(dòng)力學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)的相關(guān)性。磷酸化HER2(phospho-HER2,p-HER2)作為HER2抑制劑的直接作用靶點(diǎn),是最直接最理想的藥效驗(yàn)證靶向蛋白[4]。從技術(shù)手段角度來說,免疫組織化學(xué)方法方便、快捷、易于操作,醫(yī)院病理科以及中心實(shí)驗(yàn)室都具備比較成熟的免疫組織化學(xué)檢測(cè)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)條件,易于推廣。
在實(shí)際科研和病理診斷工作中,冷凍切片在操作上相較于石蠟切片更快速,常用于短時(shí)限內(nèi)病理診斷與生物標(biāo)志物的檢測(cè)。但冷凍切片的組織形態(tài)與抗原穩(wěn)定性容易受外部因素的影響,例如切片溫度、不同的組織固定液和切片存儲(chǔ)條件等[5-6]。 相較于石蠟切片,多次制片更容易對(duì)冷凍組織造成不可逆的損失和損傷。本文通過對(duì)比不同的固定條件和存儲(chǔ)時(shí)間,觀察免疫組織化學(xué)染色過程中p-HER2的信號(hào)變化,探討針對(duì)p-HER2檢測(cè)過程中冷凍組織切片的最佳固定與保存條件。
6~8周齡雌性BALB/c-nu/nu小鼠10只,體質(zhì)量為20~25 g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(京)2016-0011],飼養(yǎng)于迪哲(上海)醫(yī)藥有限公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[SYXK(滬)2018-0015]。實(shí)驗(yàn)正式開始前,需將動(dòng)物在新環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。選取p-HER2高表達(dá)的人源性乳腺癌細(xì)胞株BT474,通過腹部皮下注射的方法建立小鼠皮下移植瘤模型,建模成功率為60%(6/10)。本實(shí)驗(yàn)符合迪哲(上海)醫(yī)藥有限公司動(dòng)物倫理委員制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)(IACUC:
1804-ONM-02)。
抗p-HER2(6B12)抗體購自美國Cell Signaling Technology公司,免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒購自瑞士Ventana Roche公司,冷凍包埋劑OCT購自美國Thermo公司,蘇木精購自美國Sigma公司,甲醛、無水乙醇和乙酸均購自國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司。乙醇-乙酸-甲醛(AAF)混合固定液的配制:冰醋酸5 mL,37%甲醛溶液10 mL,無水乙醇85 mL。
冷凍切片機(jī)Leica CM3050S Motorized Cryostat和病理切片病理數(shù)字掃描系統(tǒng)Aperio ScanScope均購自德國Leica公司,全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色儀Ventana Discovery XT購自瑞士Ventana Roche公司。
接種后第5日起,每隔3 d用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤體的長徑(L)、短徑(W)1次,取平均值,按公式V=1/2(L×W2)計(jì)算移植瘤平均體積。待裸小鼠BT474細(xì)胞皮下腫瘤生長至約300 mm3時(shí)處死小鼠,剝離腫瘤組織,用液氮速凍[7],連續(xù)冰凍切片(厚度為5μm)。然后進(jìn)行最佳固定與保存條件的探索。
實(shí)驗(yàn)分3部分。(1)探索不同固定液對(duì)p-HER2免疫組織化學(xué)染色信號(hào)的影響:制作2組冷凍組織切片,分別用體積分?jǐn)?shù)10%的中性甲醛固定液和AAF固定液處理5 min,然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。(2)探索冷凍切片后不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行甲醛溶液固定對(duì)p-HER2免疫組織化學(xué)染色信號(hào)的影響:冷凍制片后1、5、20和30 min后,用10%中性甲醛溶液固定5 min,然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。(3)探索冷凍切片固定后在超低溫保存條件下的抗原穩(wěn)定性:采用逆向計(jì)算實(shí)驗(yàn)時(shí)間的方法,在不同時(shí)間制備冷凍組織切片;未染色的切片經(jīng)過固定后,置于-20 ℃冰箱內(nèi)存儲(chǔ);切片分別經(jīng)過1周、4周和12周后,與新鮮制備的冷凍切片一同進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,并將所有切片的染色結(jié)果與新鮮切片染色結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。
用全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色儀進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。在制作好的切片上滴加質(zhì)量濃度為3.4 μg/mL的兔抗人p-HER2(Tyr1221/1222)單克隆抗體,孵育20 min后,洗去一抗;再滴加即用型Ultra Map過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗試劑,孵育16 min,再用ChromoMap DAB進(jìn)行顯色。顯色完成的切片滴加蘇木精染液,再滴加藍(lán)化試劑進(jìn)行返藍(lán),完成組織細(xì)胞核的對(duì)比染色程序。染色完成的切片在無水乙醇中清洗,然后置于自動(dòng)封片機(jī)上封固。
免疫組織化學(xué)染色切片經(jīng)Aperio成像系統(tǒng)掃描歸檔,染色結(jié)果由病理醫(yī)師進(jìn)行觀察、對(duì)比,并截圖拍照。
用10%中性甲醛固定液處理后,切片組織結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)清晰,p-HER2的免疫組織化學(xué)染色信號(hào)清晰可判讀(圖1A)。用AAF固定液處理后,雖然切片組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,但p-HER2的免疫組織化學(xué)染色信號(hào)強(qiáng)度相對(duì)較弱(圖1B)。
BT474移植瘤組織在冷凍制片后5~20 min進(jìn)行甲醛溶液固定,組織黏附性好,染色過程中不易掉片,光學(xué)顯微鏡下顯示組織結(jié)構(gòu)與細(xì)胞形態(tài)清晰,p-HER2染色信號(hào)穩(wěn)定無差異(圖1C~E)。冷凍制片30 min后再行甲醛溶液固定的切片中,p-HER2染色信號(hào)開始下降。 冷凍組織制片后立即進(jìn)行甲醛溶液固定的切片在光學(xué)顯微鏡下顯示組織黏附性較差,在染色沖洗過程中容易掉片,細(xì)胞結(jié)構(gòu)不夠清晰,p-HER2免疫組織化學(xué)信號(hào)彌散(圖1F)。
圖 1 冷凍組織切片中p-HER2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(DAB顯色)Figure 1 Immunohistochemistry staining result of phospho-human epidermal growth factor receptor 2 (p-HER2) in frozen sections (DAB coloring)
利用全自動(dòng)染色儀對(duì)新鮮及經(jīng)過長時(shí)間保存的冷凍組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示,未經(jīng)染色的冷凍組織切片經(jīng)過12周的存儲(chǔ)后,組織黏附性好,染色過程中沒有發(fā)生組織脫落的現(xiàn)象,且組織與細(xì)胞形態(tài)完整清晰;p-HER2免疫組織化學(xué)染色信號(hào)清晰,其信號(hào)強(qiáng)度與固定完當(dāng)日即行免疫組織化學(xué)染色的切片相比沒有明顯差異(圖2)。
圖 2 未染色的冷凍組織切片經(jīng)過不同時(shí)間保存后p-HER2免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果(DAB顯色)Figure 2 Immunohistochemistry staining result of phospho-human epidermal growth factor receptor 2 (p-HER2) in frozen sections stored for different time (A, 0 day;B, 1 week; C, 4 weeks; D, 12 weeks) (DAB coloring)
免疫組織化學(xué)染色作為生物標(biāo)志物常用檢測(cè)方法,利用抗原抗體結(jié)合以及化學(xué)顯色反應(yīng),反映組織細(xì)胞中的蛋白含量及分布情況。由于其方法相對(duì)簡單,因此普及率相當(dāng)高,在醫(yī)院內(nèi)常用于輔助患者明確病理診斷,從而提供依據(jù)幫助選擇合適的靶向治療方案,以及用于判斷患者的預(yù)后情況。在新藥研發(fā)的過程中,免疫組織化學(xué)染色方法也常用于確定藥物的作用機(jī)制,并分析藥代動(dòng)力學(xué)與藥物效果的相關(guān)性。常規(guī)的免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)甲醛溶液固定的石蠟組織切片,其優(yōu)點(diǎn)是樣品易于保存,而缺點(diǎn)是從樣品采集、充分固定到石蠟切片制備完成所需要的時(shí)間較長,而且在實(shí)驗(yàn)過程中經(jīng)過固定的抗原需要先進(jìn)行抗原修復(fù)。而冷凍組織切片相較于石蠟組織切片而言,其制片非??焖?,抗原保存完好,而且切片染色可以滿足病理診斷的要求;冷凍組織切片由于當(dāng)天即可完成免疫組織化學(xué)染色,可以幫助醫(yī)生與科研人員在盡可能短的時(shí)間內(nèi)得出結(jié)論,因此該方法在醫(yī)院臨床實(shí)踐以及科研工作中都具有一定的優(yōu)勢(shì)。
本實(shí)驗(yàn)通過比較針對(duì)冷凍組織切片的不同固定條件與保存時(shí)長對(duì)免疫組織化學(xué)信號(hào)的影響,探索多組樣本量情況下冷凍組織制片操作與存儲(chǔ)中可靈活調(diào)整的時(shí)間段,優(yōu)化針對(duì)同一樣本多種生物標(biāo)志物檢測(cè)的制片規(guī)劃,減少多次制片引起的反復(fù)凍融而導(dǎo)致冷凍樣本遭受不可逆的形態(tài)損傷與抗原丟失問題。
醛類固定液會(huì)使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)[8],而乙醇通過沉淀蛋白發(fā)揮固定作用,同時(shí)兼有脫水作用[9],因此10%中性甲醛溶液與AAF混合溶液均是醫(yī)院與各科研院所廣泛使用的針對(duì)冰凍細(xì)胞與組織切片的固定試劑。經(jīng)過短時(shí)間的固定液處理,用10%中性甲醛溶液固定的冷凍切片中的細(xì)胞形態(tài)與免疫組織化學(xué)染色信號(hào)強(qiáng)度相比于用AAF混合溶液固定過的樣品更為清晰,更有利于研究者在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行判讀打分。
冷凍組織切片中未經(jīng)固定的磷酸化蛋白降解非常迅速。本實(shí)驗(yàn)對(duì)p-HER2抗原的穩(wěn)定性進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)在冷凍組織制片5~20 min采用10%中性甲醛溶液固定后,檢測(cè)到的p-HER2免疫組織化學(xué)染色信號(hào)強(qiáng)度與新鮮切片沒有明顯差異;而在冷凍制片經(jīng)過30 min后再進(jìn)行固定的切片中,檢測(cè)到的p-HER2免疫組織化學(xué)染色信號(hào)明顯減弱。本研究發(fā)現(xiàn)p-HER2在20 min內(nèi)擁有良好的抗原穩(wěn)定性,這為日常工作中大批量冷凍樣品制片提供了一定的靈活操作時(shí)間。
綜上所述,利用冰凍組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色的可操作性強(qiáng),需要染色時(shí)間短,在提高工作效率的同時(shí)不影響染色結(jié)果的判讀,可以考慮將其作為常規(guī)石蠟切片染色方法的補(bǔ)充或者替代。然而,冷凍組織切片未經(jīng)固定即暴露于外界,不僅組織形態(tài)容易遭受損傷,組織抗原信號(hào)也會(huì)降解甚至消失。本研究發(fā)現(xiàn),冷凍組織制片后5~20 min,經(jīng)過10%中性甲醛溶液充分固定后的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰,p-HER2蛋白穩(wěn)定性較好,而且-20 ℃條件下保存3個(gè)月之內(nèi)仍可以較好保存其抗原性,這一發(fā)現(xiàn)對(duì)實(shí)際檢測(cè)工作具有一定的價(jià)值。