川芎嗪對膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶通路的影響

梁錦峰，劉文華，鄢 宏，鄧少杰

(1. 深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院骨科中心，深圳 518100；2. 深圳市第二人民醫(yī)院骨關(guān)節(jié)外科，深圳518000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種自身免疫性骨關(guān)節(jié)炎，主要病理改變?yōu)殛P(guān)節(jié)滑膜腔炎性浸潤以及患者運動功能受損，臨床癥狀表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫痛、關(guān)節(jié)畸形和行動不便。目前，臨床上治療RA的主要方向是減輕患者關(guān)節(jié)炎癥、改善患者骨侵蝕程度，這需要通過抑制滑膜細胞增殖、血管翳形成而實現(xiàn)[1]。RA發(fā)病機制尚未完全明確，但已有研究[2]證實一些炎性因子如白細胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等在RA發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）作為參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通路之一，具有促進細胞增殖分化以及參與機體炎性反應(yīng)功能。研究[3]證實，ERK通路也參與了RA的發(fā)生和發(fā)展過程，RA的關(guān)節(jié)炎性浸潤病理改變與ERK通路存在緊密聯(lián)系，因此ERK通路在RA中的作用逐漸引起高度重視。川芎嗪（tetramethylpyrazine）是目前臨床中醫(yī)治療RA的一種常用藥物，臨床試驗證實其具有抗炎、消腫和鎮(zhèn)痛之功效，可以有效緩解RA患者關(guān)節(jié)炎臨床癥狀。同時川芎嗪還具有抑制血管內(nèi)皮細胞增殖和新生血管生成的作用[4]，但川芎嗪治療RA是否通過干預(yù)ERK通路起效仍需要進一步研究證實。本研究通過建立膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠模型，觀察川芎嗪對關(guān)節(jié)炎模型大鼠病理學(xué)變化和體內(nèi)炎性因子水平的影響，探討和分析川芎嗪治療RA的起效機制以及對ERK通路的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器

30只SPF級雄性SD大鼠，（10.23±2.15）周齡，體質(zhì)量300~350 g，購自深圳康泰生物制品股份有限公司[SCXK（粵）2018-0193]。動物飼養(yǎng)于康美華大基因技術(shù)有限公司[SYXK（粵）2019-0 2 0 5]，動物實驗倫理審批文號：醫(yī)科倫審-2018017。TNF-α、血管生成素1（Ang-1）、IL-1β和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）抗體試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；磷酸川芎嗪片購自廣州康和藥業(yè)有限公司（規(guī)格50 mg，國藥準(zhǔn)字H 4 4 0 2 4 2 7 2）；酶聯(lián)免疫吸附測定（E LI S A）試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和總RNA提取試劑盒購自美國賽默飛公司。

熒光定量PCR儀（型號 ABI 7500，美國賽默飛公司）；高速冷凍離心機（型號Mikro220R，德國Hettich公司）；電泳儀和電泳槽（型號分別為DYCZ、DYCP，中國北京六一儀器廠）；分光光度計（型號UV-2000, 美國安捷倫科技公司）；酶標(biāo)儀（型號E L3 0，美國B i o-T e k公司）；ELISA分析軟件（ReaderFit，中國杭州艾米綠公司）；96孔酶標(biāo)板（美國Costar公司）。

1.2 方法

將30只大鼠隨機分為對照組、模型組和川芎嗪組，每組各10只，采用文獻報道的膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎造模方法[5-6]：將20 mg雞Ⅱ型膠原充分溶解于10 mL濃度為0.1 mol/L的乙酸中，得到質(zhì)量濃度為2 g/L的雞Ⅱ型膠原，然后將等體積弗氏完全佐劑與該溶液混合并乳化完全得到乳化劑。造模成功后，川芎嗪組每日給予川芎嗪（0.1 g/kg）（其中磷酸川芎嗪片使用適量生理鹽水溶解，配制成灌胃混懸液），連續(xù)灌胃給藥28 d；模型組、正常組給予相同體積生理鹽水。每周測量3組大鼠后足體積變化情況，采取HE染色法觀察各組大鼠炎性細胞浸潤情況，采用ELISA法測定各組大鼠滑膜組織及血清中TNF-α、Ang-1、IL-1β、VEGF水平，另外采用蛋白質(zhì)印跡法檢測各組大鼠ERK1/2蛋白及磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）蛋白的表達水平。

1.3 觀察指標(biāo)及評價標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度測定及比較 造模成功后，使用記號筆在大鼠足部踝骨關(guān)節(jié)突出位置作標(biāo)記，每周使用排水法[7]測量并記錄各組大鼠后足的體積大小，每只大鼠每次測定3次，取平均值。

1.3.2 各組大鼠組織病理學(xué)變化比較 于實驗28 d脊椎脫臼法處死大鼠后，使用體積分?jǐn)?shù)10%的多聚甲醛溶液浸泡大鼠雙后肢膝關(guān)節(jié)1 d，然后使用體積分?jǐn)?shù)5%的硝酸溶液浸泡膝關(guān)節(jié)組織2周，浸泡至組織脫鈣完全且能夠順暢切斷骨質(zhì)后，重新使用體積分?jǐn)?shù)10%的多聚甲醛溶液浸泡，然后進行石蠟包埋、切片以及HE染色。

1.3.3 各組大鼠滑膜組織及血清中炎性因子水平測定 于實驗28 d脊椎脫臼法處死大鼠前采集大鼠動脈血4 mL，離心后分離得到上層血清。另外，手術(shù)切取大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，用ELISA試劑盒檢測所有樣本中TNF-α、IL-1β、Ang-1以及VEGF水平。嚴(yán)格按試劑盒操作說明檢測，使用酶標(biāo)儀進行樣品檢測。

1.3.4 滑膜組織各炎性因子mRNA表達測定 分別取各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織，用總RNA提取試劑盒提取組織中總RNA，使用紫外分光光度計測定總RNA濃度，樣品吸光度比值A(chǔ)260/A280≥1.80視為合格。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，分別得到模板單鏈cDNA，然后使用PCR試劑盒對cDNA進行PCR。 PCR反應(yīng)條件為95 ℃30 s，退火60 ℃ 40 s，延伸72 ℃ 30 s；連續(xù)循環(huán)30次。然后采用2－△△Ct計算血清mRNA相對表達量[8]。

1.3.5 蛋白質(zhì)印跡法測定ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達水平 剪取各組小鼠滑膜組織并加入裂解緩沖液，當(dāng)組織得到充分勻漿后將其靜置一段時間，然后放入離心機以12 000 r/min離心20 min，取出上清液后采用BCA法對ERK1/2、p-ERK1/2蛋白進行定量測定。使用10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳對蛋白樣品進行分離后，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，使用封閉液將樣品于室溫下封閉2 h。將膜轉(zhuǎn)入封閉液稀釋的一抗，4 ℃過夜后使用PBST沖洗液進行洗滌，加二抗后繼續(xù)于室溫下孵育1 h，洗滌后采用電化學(xué)發(fā)光法檢測并進行印跡成像。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析不同組別各項指標(biāo)間差異，多組間采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠關(guān)節(jié)腫脹度

從第2周開始，模型組大鼠后足開始發(fā)生明顯腫脹，后足體積顯著大于川芎嗪組和對照組（P<0.0 5）（表1）。

2.2 大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)觀察

對照組大鼠關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)完整且關(guān)節(jié)面光滑，關(guān)節(jié)間隙大小正常，未顯示存在炎性浸潤和滑膜組織增生，關(guān)節(jié)兩端未發(fā)生骨侵蝕（圖1A）；模型組大鼠關(guān)節(jié)腔間隙比對照組顯著變大，且間隙中填充有滑膜增生組織，存在炎性浸潤和骨侵蝕現(xiàn)象，關(guān)節(jié)面和關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)被破壞（圖1B）。川芎嗪組大鼠關(guān)節(jié)病理切片情況相比模型組有明顯好轉(zhuǎn)，關(guān)節(jié)面較清晰，關(guān)節(jié)間隙輕微增大，存在輕微炎性浸潤情況，但未發(fā)生明顯骨侵蝕，骨關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)比較完整（圖1 C）。

2.3 大鼠血清和滑膜組織中炎性因子水平

模型組和川芎嗪組大鼠血清和滑膜組織中炎性因子TNF-α、Ang-1、IL-1β表達水平比對照組大鼠均顯著升高（P＜0.05），同時川芎嗪組大鼠血清和滑膜組織中各炎性因子水平比模型組均降低（P＜0.05）。各組大鼠血清中均未檢測到VEGF，但模型組和川芎嗪組大鼠滑膜組織中VEGF水平均升高（P＜0.05），且川芎嗪組明顯低于模型組（P＜0.0 5）（表2）。

2.4 大鼠滑膜組織各炎性因子mRNA表達

與對照組相比，模型組和川芎嗪組大鼠滑膜組織中各炎性因子mRNA表達水平均顯著升高（P＜0.05）；川芎嗪組大鼠各炎性因子mRNA水平與模型組相比均顯著降低（P＜0.05）（表3）。

表 1 各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度測定Table 1 Results of joints welling test in rats (-x± s)

圖 1 大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)觀察 （HE染色）Figure 1 Pathological observation on joint tissues in rats (HE staining)

2.5 大鼠滑膜組織ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達

與對照組比較，模型組和川芎嗪組大鼠滑膜組織p-ERK1/2蛋白表達水平均升高（P＜0.05），但川芎嗪組表達水平低于模型組（P＜0.05）；模型組和川芎嗪組大鼠ERK1/2蛋白表達水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表4）。

表 2 大鼠滑膜組織和血清中炎性因子水平Table 2 The levels of inflammatory factor levels in synovial tissue and serum of rats (-x ± s)

表 3 大鼠滑膜組織各炎性因子mRNA表達Table 3 The mRNA expressions of inflammatory factors in synovial tissues of rats (-x ± s)

表 4 大鼠滑膜組織ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達水平Table 4 The expressions of ERK1/2 and p-ERK1/2 proteins in synovial tissues of rats (-x ± s)

3 討論

膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠模型是一種慢性免疫炎性動物模型，已被學(xué)術(shù)界認(rèn)可作為研究RA發(fā)病機制的理想動物模型[9]。ERK作為與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和炎性反應(yīng)密切相關(guān)的信號通路，與RA的新生血管生成、細胞增殖分化、炎性浸潤以及蛋白酶表達等過程密切關(guān)聯(lián)，在RA整個發(fā)生和發(fā)展過程中活躍度很高[10]。TNF-α、IL-1β是促炎性Th1細胞分泌的一些重要炎性因子，其中IL-1β屬于炎性始動因子，高IL-1β水平會刺激軟骨細胞過度合成膠原酶以及致炎致痛物質(zhì)前列腺素E2，同時促進嗜中性粒細胞、巨噬細胞聚集于關(guān)節(jié)滑膜，從而產(chǎn)生關(guān)節(jié)滑膜炎性反應(yīng)，導(dǎo)致軟骨基質(zhì)發(fā)生降解[11]。TNF-α不僅可以誘導(dǎo)炎性反應(yīng)，還能促進成纖維細胞增生，以及導(dǎo)致軟骨受損[12]。在RA患者體內(nèi)Thl和Th2細胞處于失衡狀態(tài)，其中Th1細胞及其分泌的促炎細胞因子占據(jù)絕對優(yōu)勢。本研究發(fā)現(xiàn)RA模型大鼠血清中TNF-α、IL-1β等Th1促炎因子相比正常組大鼠明顯升高（P＜0.05）。有研究表明，VEGF、基質(zhì)金屬蛋白酶等一些與血管新生相關(guān)的細胞因子在RA患者血清和關(guān)節(jié)滑膜組織中也呈現(xiàn)明顯高表達，且與患者RA疾病嚴(yán)重程度存在顯著正相關(guān)性[13]。以上研究結(jié)果說明上述細胞因子共同參與了RA疾病的進展，促進新生血管生成、炎性浸潤以及骨侵蝕過程。

川芎嗪是從中藥材川芎中提取出來的一種活性成分，其藥理作用如抗新生血管生成、抑制細胞分化增殖和抑制炎性反應(yīng)等均已得到充分證實，且大量臨床研究和基礎(chǔ)研究證實川芎嗪可以緩解RA患者臨床癥狀[14]。本研究結(jié)果顯示，造模后第2周開始，模型組大鼠后足體積以及炎性因子TNF-α、Ang-1、IL-1β水平顯著大于或者高于對照組和川芎嗪組（P＜0.05）；且病理觀察顯示，模型組大鼠關(guān)節(jié)腔間隙存在炎性浸潤、滑膜增生組織和骨侵蝕現(xiàn)象，關(guān)節(jié)面和關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)被破壞，而川芎嗪組大鼠關(guān)節(jié)間隙炎性損傷程度明顯低于模型組大鼠，未發(fā)生明顯骨侵蝕，骨關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)相對較完整，表明川芎嗪可降低炎性反應(yīng)，減輕后足炎性損傷。謝平金等[15]研究發(fā)現(xiàn)，使用川芎嗪對模型大鼠進行干預(yù)后，大鼠血清IL-1β、TNF-α表達水平相對于模型組顯著降低（P＜0.05），證實川芎嗪在治療RA中發(fā)揮顯著抗炎作用。另外，本研究結(jié)果表明，模型組和川芎嗪組大鼠p-ERK1/2蛋白表達水平相比對照組均顯著升高（P＜0.05），但川芎嗪組相比模型組顯著降低（P＜0.05），說明模型大鼠中p-ERK1/2蛋白存在過度表達，而川芎嗪可以通過抑制ERK信號通路促進ERK1/2磷酸化即增加p-ERK1/2蛋白表達水平。李巍等[16]研究表明，川芎嗪可以通過抑制滑膜組織ERK通路活化，有效降低膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎模型動物血清和滑膜組織中IL-1β、TNF-α和IL-12 炎性因子表達水平（P＜0.05），與本研究結(jié)果一致。王春亮等[17]研究發(fā)現(xiàn)，IL-l和TNF-α可以快速激活成纖維樣滑膜細胞中ERK、c-JUN氨基末端蛋白激酶和P38激酶活性，激活后的ERK和P38又會進一步誘導(dǎo)IL-l和TNF-α等細胞因子表達，進而導(dǎo)致RA的發(fā)生發(fā)展。白菁安等[18]報道，川芎嗪治療RA的起效機制可能與抑制ERK通路活化過程存在密切聯(lián)系。結(jié)合本次研究結(jié)果，筆者認(rèn)為川芎嗪治療RA的起效機制可能是由于川芎嗪顯著減少炎性因子分泌，抑制機體淋巴細胞增殖，從而抑制ERK通路，降低ERK相關(guān)蛋白表達水平，最終有效改善大鼠關(guān)節(jié)腫脹癥狀，緩解關(guān)節(jié)組織的病理情況。

本研究采用的是經(jīng)典RA大鼠造模方法，已有大量文獻報道驗證，故研究中僅對造模組血清和滑膜組織炎性反應(yīng)進行評估，就可以判斷造模成功。同時考慮到本研究主要目的是觀察川芎嗪對炎性因子和ERK通路相關(guān)蛋白表達的影響，因此著重關(guān)注川芎嗪組與模型組和空白對照組的比較，未設(shè)置陽性藥對照組，后續(xù)可進一步完善。

綜上所述，川芎嗪可能通過有效抑制ERK通路，調(diào)節(jié)膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠血清和滑膜組織中TNF-α、IL-1β等炎性因子水平，緩解關(guān)節(jié)腫脹癥狀。