香葉木素對胎糞誘導(dǎo)的新生大鼠急性肺損傷的作用及其機(jī)制探討

郝莉霞，盧 蓉，馬霞霞，樊書娟

(1. 延安大學(xué)附屬醫(yī)院新生兒科，延安716000；2. 延安大學(xué)附屬醫(yī)院兒科一病區(qū)，延安716000；3. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院新生兒科，西安 710061)

胎糞吸入性肺炎（meconium aspiration pneumonia）又稱胎糞吸入綜合征，是引起新生兒呼吸窘迫綜合征的原因之一，尤其在足月或過期妊娠嬰兒中發(fā)病率和死亡率極高[1]。在分娩過程中，胎糞沿著呼吸道進(jìn)入肺泡引起機(jī)械性阻塞和化學(xué)炎性反應(yīng)，同時引起其他器官損傷[2]。胎糞吸入性肺炎占所有呼吸衰竭病例的10%左右，在發(fā)展中國家的死亡率約為39%，早期診斷和早期治療對改善患者預(yù)后很重要[3]。目前尚無有效的藥物干預(yù)措施用于降低胎糞吸入性肺炎死亡率，因此迫切需要開發(fā)新的有效的預(yù)防和治療方法。

香木葉素是一種從橄欖葉和豆科植物中分離出來的黃酮類化合物，具有抗炎、抗雌激素、抗氧化劑、抗微生物和抗腫瘤等藥理作用[4]。已有研究報道，香木葉素可通過激活核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）通路和抑制含pyrin結(jié)構(gòu)域的NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor with pyrin domain 3，NLRP3）炎癥小體，減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷[5]，說明香木葉素對肺損傷有治療作用。然而目前尚未見有相關(guān)文獻(xiàn)報道香葉木素對胎糞吸入性肺炎的作用機(jī)制。本研究用胎糞誘導(dǎo)建立大鼠急性肺損傷模型，探討香葉木素對胎糞誘導(dǎo)的新生大鼠急性肺損傷的作用及其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物和主要試劑

香葉木素（批號111788-200801）購自中國食品藥品檢定研究院，化學(xué)式為C16H12O6，相對分子質(zhì)量為300.3，純度≥95.7%；甲強(qiáng)龍（CAS號2375-03-3）購自美國TargetMol公司；HE染色試劑盒（貨號C0105）購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（ab6671）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）（ab100704）、IL-6（ab100712）、NLRP3（ab214185）、剪切型半胱天冬酶1（cleaved caspase-1，c-caspase-1）（ab138483）和GAPDH單克隆抗體（ab9485）均購自英國Abcam公司。

1.2 動物模型的建立與分組

50只1日齡SPF級雄性SD大鼠購自空軍軍醫(yī)大學(xué)（原第四軍醫(yī)大學(xué)）實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK（陜）2014-002]，飼養(yǎng)于陜西省食品藥品檢驗(yàn)研究院[SYXK（陜）2018-002]，室溫23～25 ℃，光照/黑暗時間12 h/12 h，自由進(jìn)食飼料和水。用氯胺酮（20 mg/kg）和甲苯噻嗪（5 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，行氣管切開術(shù)。取48只大鼠隨機(jī)分為4組，每組12只，按下述方法操作[6]。手術(shù)對照組：將大鼠置于機(jī)械通氣機(jī)上，氣管中插入氣管導(dǎo)管，呼吸機(jī)通氣30 min，緩慢注入0.9%氯化鈉溶液即生理鹽水（1.5 mL/kg），呼吸機(jī)通氣15 min，確保生理鹽水均勻進(jìn)入支氣管及肺泡，縫合切口。模型組：將大鼠置于機(jī)械通氣機(jī)上，氣管中插入氣管導(dǎo)管，呼吸機(jī)通氣30 min，緩慢注入胎糞（1.5 mL/kg），呼吸機(jī)通氣15 min，確保胎糞均勻進(jìn)入支氣管及肺泡，縫合切口。甲強(qiáng)龍組：操作同模型組，模型建立后尾靜脈注射甲強(qiáng)龍（2 mg/kg），作為陽性對照。香葉木素組：操作同模型組，模型建立后腹腔注射香葉木素（20 mg/kg）。造模過程中，對照組大鼠死亡1只，模型組大鼠死亡4只，甲強(qiáng)龍組和香葉木素組大鼠各死亡2只。模型組補(bǔ)充2只大鼠，以同樣實(shí)驗(yàn)方法造模并成功，最終各組大鼠均取10只用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

各組處理24 h后麻醉，開胸，心臟放血法處死大鼠。解剖后，取各組大鼠肺組織，稱重，然后用體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醛溶液固定，行石蠟包埋切片。

1.3 動脈氧合指數(shù)

建模后24 h，處死前取各組大鼠動脈血，加入全自動血?dú)夥治鰞x，檢測動脈血氧分壓（arterial partial pressure of oxygen，PaO2）和吸入氧分?jǐn)?shù)（fraction of inspired oxygen，F(xiàn)iO2），根據(jù)公式計算動脈氧合指數(shù)：氧合指數(shù)＝ PaO2/FiO2。

1.4 HE染色

采用HE染色方法進(jìn)行肺組織病理學(xué)檢測。將石蠟切片脫蠟，蒸餾水潤濕組織，蘇木精染色細(xì)胞核5 min，水洗5 s，伊紅染色細(xì)胞質(zhì)30 s，水洗后，濾紙吸干，無水乙醇脫水2次后封固，在熒光顯微鏡下觀測染色結(jié)果。參考Turhan等[7]的方法，計算肺損傷病理評分。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測IL-6、IL-1β和TNF-α含量

模型建立24 h后，采用支氣管肺泡灌洗術(shù)[8]收集肺泡表面液體，在4 ℃下用50 mmol/L碳酸鹽包被緩沖液溶解抗原后，以100 μL/孔的量接種到96孔酶標(biāo)板。按照試劑盒說明進(jìn)行IL-6、IL-1β和TNF-α含量檢測，用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品中I L-6、IL-1β和TNF-α含量

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測NLR P3、IL-1β和c-caspase-1蛋白表達(dá)

將肺組織置于玻璃勻漿器內(nèi)，在冰上溶解25 min。以12 000 r/min的速度離心10 min，加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液進(jìn)行總蛋白提取，用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。取等量的蛋白質(zhì)樣品（20 mg），在100℃條件下變性5 min。然后采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白，電泳結(jié)束后將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，在4 ℃條件下加入兔抗NLRP3、IL-1β和c-caspase-1單克隆抗體（工作液稀釋比例均為1∶1 000），并孵育過夜，三羥甲基氨基甲烷緩沖液清洗，然后在4 ℃下加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶20 000）并孵育2 h，最后加入電化學(xué)發(fā)光染色液，曝光處理。應(yīng)用Image J軟件統(tǒng)計各條帶灰度值，以分析目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件對各實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量數(shù)據(jù)用x-±s表示，組間比較采用多因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 香葉木素降低動脈氧合指數(shù)

與對照組比較，胎糞誘導(dǎo)的新生大鼠急性肺損傷模型組平均動脈氧合指數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。而與模型組相比，甲強(qiáng)龍組（即陽性藥物對照）的平均動脈氧合指數(shù)明顯降低（P＜0.01），香葉木素組的平均動脈氧合指數(shù)也低于模型組（P＜0.05），但比甲強(qiáng)龍組有所回升（6.10±0.96vs19.60±2.04）（圖1）。

圖 1 香葉木素對胎糞誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠動脈氧合指數(shù)的影響Figure 1 Effect of diosmetin on the arterial oxygenation index in rats with meconium-induced acute lung injury

2.2 香葉木素下調(diào)炎性因子IL-6、IL-1β和TNFα水平

與對照組相比，胎糞誘導(dǎo)的新生大鼠急性肺損傷模型組大鼠的IL-6水平明顯升高（P＜0.01），而甲強(qiáng)龍組和香葉木素組的IL-6水平均明顯低于模型組（均P＜0.01）；模型組的IL-1β水平明顯高于對照組（P＜0.01），而甲強(qiáng)龍組和香葉木素組的IL-1β水平明顯低于模型組（均P＜0.01）；與對照組相比，模型組的TNF-β水平也明顯升高（P＜0.01），而甲強(qiáng)龍組和香葉木素組的TNF-α水平也明顯低于模型組（均P＜0.01）（圖2）。

圖 2 香葉木素對胎糞誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠中炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影響Figure 2 Effects of diosmetin on the levels of inflammatory cytokines IL-6, IL-1β, and TNF-α in rats with meconium-induced acute lung injury

2.3 香葉木素減輕肺組織病理損傷程度

HE染色檢測各組大鼠肺組織病理損傷情況，結(jié)果如圖3A所示。對照組肺泡擴(kuò)張良好，支氣管黏膜正常。與對照組相比，胎糞誘導(dǎo)的新生大鼠急性肺損傷模型組表現(xiàn)出明顯的病理損傷，肺泡壁明顯水腫，肺實(shí)質(zhì)明顯實(shí)變，管腔狹窄，可見大量炎性細(xì)胞浸潤，肺損傷評分明顯升高（P＜0.05）。與模型組相比，甲強(qiáng)龍組的肺泡壁仍水腫、增厚，但炎性細(xì)胞浸潤減少，肺組織評分明顯降低（P＜0.05）。香葉木素組較模型組的肺組織病理損傷程度明顯降低，肺泡壁輕微水腫，中度出血及炎性細(xì)胞浸潤，肺組織評分明顯降低（P＜0.0 5，圖3 B）。

模型建立12 h后稱肺組織質(zhì)量，結(jié)果如圖3C所示：模型組的肺質(zhì)量明顯高于對照組（P＜0.01），而甲強(qiáng)龍組和香葉木素組的肺質(zhì)量明顯低于模型組（均P＜0.0 1）。

2.4 香葉木素下調(diào)NLRP3、c-caspase-1和IL-1β蛋白表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡法檢測各組大鼠肺組織中NLRP3、IL-1β和c-caspase-1蛋白水平，結(jié)果如圖4所示。與對照組相比，胎糞誘導(dǎo)的新生大鼠急性肺損傷模型組的NLRP3蛋白水平明顯升高（P＜0.01），而甲強(qiáng)龍組和香葉木素組的NLRP3蛋白水平均明顯低于模型組（均P＜0.01）；模型組的c-caspase-1蛋白水平也明顯高于對照組，甲強(qiáng)龍組和香葉木素組的c-caspase-1蛋白水平也明顯低于模型組（均P＜0.01）；模型組的IL-1β蛋白水平明顯高于對照組、甲強(qiáng)龍組和香葉木素組（均P＜0.01）。

圖 3 香葉木素對胎糞誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠的肺組織病理損傷程度的影響Figure 3 Effect of diosmetin on the pathological degree of lung tissues in rats with meconium-induced acute lung injury

圖 4 香葉木素對胎糞誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠中NLRP3、c-caspase-1和IL-1β蛋白水平的影響Figure 4 Effects of diosmetin on NLRP3, c-caspase-1 and IL-1β levels in rats with meconium-induced acute lung injury

3 討論

胎糞吸入性肺炎是一種胎糞引起的新生兒呼吸功能障礙，能導(dǎo)致嚴(yán)重的肺功能衰竭。臨床上，胎兒窘迫或子宮內(nèi)抽吸導(dǎo)致胎糞吸入，從而發(fā)生炎性反應(yīng)、氣道阻塞、肺表面活性物質(zhì)失活及細(xì)胞凋亡，從而破壞肺發(fā)育[9-10]。目前，胎糞吸入性肺炎的確切機(jī)制在很大程度上仍不清楚，治療僅局限于機(jī)械通氣、表面活性劑治療和氣道清潔[11]。因此，治療胎糞吸入性肺炎想要取得良好的效果，需要探索新的有效藥物。

香葉木素天然存在于豆科植物金合歡和橄欖葉的葉子中。已經(jīng)證實(shí)香葉木素具有多種藥性，包括抗菌、抗癌、抗炎和抗氧化活性[12]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)植物成分作為胎糞吸入性肺炎的預(yù)防和治療藥物正越來越受到人們的關(guān)注[13]。組織病理學(xué)變化是胎糞吸入性肺炎的可視化反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)通過HE染色觀察發(fā)現(xiàn)香葉木素改善了胎糞誘導(dǎo)的肺組織病理學(xué)癥狀，如炎性細(xì)胞浸潤和肺泡充血均減輕，肺損傷評分降低。此外，香葉木素明顯減輕了胎糞誘導(dǎo)的新生大鼠肺組織質(zhì)量。

胎糞吸入性肺炎患兒由于呼吸功能較差，肺部換氣及通氣功能受阻，導(dǎo)致機(jī)體氧供不足，引起血?dú)庵笜?biāo)發(fā)生相應(yīng)的異常變化[14]。血?dú)夥治瞿軌蚍从辰M織氧供及耗氧狀態(tài)。Chen等[2]研究發(fā)現(xiàn)，高頻振蕩通氣聯(lián)合肺表面活性物質(zhì)表達(dá)通過降低動脈氧合指數(shù)對胎糞吸入性肺炎具有顯著療效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，香葉木素降低了新生大鼠胎糞吸入性肺炎的動脈氧合指數(shù)，表明香葉木素通過改善血?dú)鉅顟B(tài)，對胎糞誘導(dǎo)新生大鼠的呼吸功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。

胎糞是水、上皮細(xì)胞、膽汁、黏液和羊水的復(fù)雜混合物，含有多種可能引起炎性反應(yīng)的危險因子[15]。炎性反應(yīng)已被證明在胎糞誘導(dǎo)的肺損傷中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[16]。胎糞是中性粒細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞的有效激活劑。在胎糞吸入性肺炎的早期階段，IL-1β是一種相當(dāng)活躍的細(xì)胞因子，可引起促炎介質(zhì)如IL-6和IL-8釋放，從這些介質(zhì)中獲取支持，募集炎性細(xì)胞，過度炎性反應(yīng)最終導(dǎo)致肺損傷[17]。香葉木素可以改善促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如TNF-α、IL-1β和IL-6[18]。Thomas等[19]研究發(fā)現(xiàn)，C5和CD14聯(lián)合抑制體內(nèi)胎糞誘導(dǎo)的炎性因子IL-6和IL-1β表達(dá)，從而治療胎糞吸入性肺炎。Zhang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，香葉木素顯著降低了細(xì)菌性腦膜炎大鼠模型的海馬組織中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，香葉木素極顯著地降低支氣管肺泡中炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α分泌水平，同時降低了肺組織中IL-1β蛋白表達(dá)水平，表明香葉木素通過調(diào)節(jié)炎性因子水平改善胎糞誘導(dǎo)的新生大鼠肺損傷。

NLRP3炎性小體作為固有免疫的重要組分，在機(jī)體免疫反應(yīng)和疾病發(fā)生過程中具有重要作用。NLRP3炎性小體由NOD樣受體蛋白家族成員凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白和caspase-1組成，可以通過各種刺激激活細(xì)菌、病毒、真菌和垂死細(xì)胞的重要成分[21]。蛋白酶caspase-1介導(dǎo)細(xì)胞因子IL-1β和IL-18，刺激促炎免疫應(yīng)答，并保護(hù)生物體免于病原體誘導(dǎo)的死亡[22]。已有研究表明，NLRP3炎性小體過度激活釋放炎性介質(zhì)，導(dǎo)致與肺部疾病相關(guān)的炎性反應(yīng)[23]。Liu等[5]研究發(fā)現(xiàn)，香葉木素通過激活Nrf2通路，抑制NLRP3炎性小體，減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷。Zhang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素通過抑制NLRP3和c-caspase-1蛋白表達(dá)治療急性肺損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，香葉木素下調(diào)胎糞誘導(dǎo)的急性肺損傷中NLRP3、c-caspase-1和IL-1β蛋白水平，提示NLRP3炎癥小體可能與胎糞誘導(dǎo)的新生大鼠急性肺損傷病情嚴(yán)重程度以及病程有關(guān)，可以作為評估其疾病進(jìn)程的一個指標(biāo)。

綜上所述，香葉木素改善新生大鼠炎性反應(yīng)、呼吸狀況及病理損傷的效果較好，可將香葉木素用于治療新生兒胎糞吸入性肺炎。本實(shí)驗(yàn)尚存在一定局限性，如納入樣本少，指標(biāo)單一，還需配合機(jī)械通氣治療，因此香葉木素治療胎糞吸入性肺炎的安全性和有效性仍需要進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)加以探究和證實(shí)。