不同低氧脅迫方式構(gòu)建SD大鼠高原肺水腫模型的比較研究

林 雪，雷有芳，蒲小燕

（青海大學醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學部，西寧 810016）

高原肺水腫（high altitude pulmomary edema，HAPE）是指機體快速（24～72 h內(nèi)）暴露于高原低氧環(huán)境后，急性缺氧導致肺毛細血管內(nèi)皮細胞和肺泡上皮細胞受損，通透性增加，進而產(chǎn)生以肺間質(zhì)或肺泡水腫為基本病理特征的急性高原疾病，臨床表現(xiàn)為心慌、胸悶、咳嗽、呼吸困難、咳粉紅色泡沫痰、肺部濕啰音和發(fā)紺等，該病危害性大，嚴重時可危及生命[1-2]。由于HAPE的發(fā)病機制復雜，目前其發(fā)病原因仍不清楚[3-4]，可能與海拔高度、環(huán)境溫度、運動強度及機體的適應與重塑有關(guān)[5-6]，但至今仍無一種制作HAPE模型的標準方法。因此，本課題組通過不同的低氧脅迫方式構(gòu)建重現(xiàn)性較高的HAPE大鼠模型，為后期的疾病研究創(chuàng)造基礎(chǔ)條件。

1 材料與方法

1.1 實驗分組及模型構(gòu)建

SPF級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量200±2 0 g，購自西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心[SCXK（陜）2019-0001]。所有大鼠隨機分為3組：（1）對照組，飼養(yǎng)于四川大學華西醫(yī)院科技園區(qū)科研基地動物實驗樓（海拔4 0 0 m）[SYXK（川）2018-119]；（2）低壓氧艙組，于青海大學醫(yī)學院高原醫(yī)學研究中心低壓氧艙室，先模擬海拔6 000 m低氧脅迫48 h后，立即降至3 500 m進行動物實驗；（3）實地低氧組，于青海省瑪多縣人民醫(yī)院（海拔4 200 m）低氧脅迫28 d后，立即進行動物實驗。每組20只。實驗期間，3組動物的飼養(yǎng)環(huán)境均達到如下要求：SPF環(huán)境飼養(yǎng)，溫度為20～26 ℃，相對濕度為40%～70%，自由進食飲水（飲水瓶的瓶口加鋼珠）。所有大鼠用45 mg/kg戊巴比妥鈉進行腹腔麻醉，取仰臥位固定于實驗臺，手術(shù)部位備皮消毒，待大鼠無角膜反射及收縮反應后，進行下述實驗操作。實驗中所涉及處理動物的操作均按照國家相關(guān)法規(guī)要求執(zhí)行。

1.2 血氣及血管組織病理檢測

切開大鼠腹部皮膚及肌肉層，暴露腹腔背側(cè)面，分離腹主動脈，用PresetBM動脈采血器（美國BD公司產(chǎn)品）抽取全血1 mL，通過Sysmex全自動血氣分析儀分析腹主動脈血氧分壓及氧飽和度；分離右頸外靜脈，結(jié)扎遠心端，用動脈夾夾住近心端，挑起頸外靜脈，氣管插管行機械通氣后，使用PowerLab生理記錄儀觀察壓力波形的變化。將導管緩慢插入上腔靜脈到右心房，可見小的壓力波形，繼續(xù)將導管插入右心室，記錄右心室壓力曲線。再將導管在右心室血流的作用下送入肺動脈，通過壓力傳感器采集肺動脈壓力，并記錄數(shù)據(jù)。

1.3 肺組織含水量測定

以斷頸法迅速處死大鼠后，取左肺上葉，用吸水紙吸去組織表面水分，電子天平稱濕重，記為W1；恒溫烘干箱55 ℃烤72 h至恒重，稱干重，記為W2。根據(jù)Elliot公式計算肺組織含水量＝（W1－W2）/W1×100%。

1.4 肺組織HE染色后顯微結(jié)構(gòu)檢測

以斷頸法處死大鼠后，取右肺下葉組織，大小5 mm×5 mm×5 mm，漂洗后用4%多聚甲醛溶液（編號BL539A，日本TaKaRa公司產(chǎn)品）固定。常規(guī)石蠟包埋，制成5 μm厚的石蠟切片后，用HE染色試劑盒染色（編號G1120，日本TaKaRa公司產(chǎn)品），光學顯微鏡（型號CX-21，日本Olympus公司產(chǎn)品）放大400倍后觀察各組大鼠肺組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.5 肺組織超微結(jié)構(gòu)檢測

取右下肺尖處肺組織，切成1 mm3小塊，固定于2.5%戊二醛溶液即Gluta固定液（編號P1126，日本TaKaRa公司產(chǎn)品）中，按常規(guī)制作電鏡超薄切片，用透射電鏡（型號JEM-1400PLUS，日本電子株式會社產(chǎn)品）觀察各組大鼠肺組織的超微結(jié)構(gòu)改變。

1.6 肺組織氧化應激相關(guān)蛋白檢測

取左肺下葉肺組織，加入一定量的PBS手動勻漿，取勻漿液于低溫離心機中3000 r/min離心20 min。取上清液，嚴格按照ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司產(chǎn)品）操作說明，檢測谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，G S H-P x）、超氧化物歧化酶（s u p e r o x i d e dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，用酶標儀檢測各孔吸光度，最后計算出目的蛋白濃度。

1.7 實時熒光定量PCR檢測關(guān)鍵基因表達

使用TRIzol（編號N0.9769，日本TaKaRa公司產(chǎn)品）提取左肺下葉肺組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后采用實時熒光定量PCR法檢測組織中水通道蛋白1（aquaporin-1，AQP-1）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達情況。按照Real-time Quality PCR試劑盒說明書進行操作，用實時熒光定量儀（美國ThermoFisher公司產(chǎn)品）對樣品進行檢測。引物序列見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以β-actin作內(nèi)參，采用2-△△Ct方法計算目的基因的相對表達值。各個基因的表達值測量均重復3次。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測關(guān)鍵蛋白表達

細胞總蛋白提?。河美涞腜BS洗肺組織3

表 1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequence

次，濾紙吸去水分，置于液氮中研磨至粉末狀，加入RIPA裂解液，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，上清液即為細胞總蛋白。根據(jù)所測定蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度（μg/μL），計算所要上樣的體積（μL），將樣品加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，100 ℃加熱變性，上樣后進行SDS-PAGE（80 V 30 min，120 V 60 min）。電泳結(jié)束后，切下需要的凝膠條帶，加入事先預冷的2×Transfer Buffer，冰盒內(nèi)電轉(zhuǎn)膜（200 mA 90 min）。用含5% BSA的封閉液進行封閉，加入1∶500稀釋的兔抗人VEGF多克隆抗體（編號SP0810，廣州深達生物有限公司產(chǎn)品）和兔抗人AQP-1多克隆抗體（編號P4788Rb-h，上海萬疆生物有限公司產(chǎn)品），4℃孵育過夜；隨后加入1∶10 000稀釋的熒光標記的羊抗兔IgG（編號BA1054，武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品），室溫避光孵育1 h，用Licor Odyssey紅外成像系統(tǒng)掃描實驗結(jié)果，最后運用Quantity One軟件分析目的條帶與β-actin蛋白條帶的灰度值之比。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差同質(zhì)性采用Kolmogoroe-Simirnov和Levene檢驗，符合正態(tài)分布并具有同質(zhì)性的數(shù)據(jù)均以x-±s表示。3組比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺動脈壓及血氧值分析

與對照組相比，低壓氧艙組和實地低氧組大鼠的肺動脈壓顯著升高（均P＜0.01），而氧分壓及氧飽和度均顯著下降（均P＜0.01）；此外，肺動脈壓、氧分壓及氧飽和度在低壓氧艙組和實地低氧組之間比較，均顯示無明顯差異（P＞0.0 5），見圖1。

2.2 肺組織含水量分析

與對照組相比，低壓氧艙組和實地低氧組大鼠的肺組織含水量均明顯升高（每組6只，肺組織含水量分別為0.720±0.007、0.799±0.004和0.7 92±0.0 09），差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；此外，肺組織含水量在低壓氧艙組和實地低氧組之間比較，均顯示無明顯差異（P＞0.05）。

圖 1 各組大鼠的肺動脈壓、腹主動脈血氧飽和度及動脈血氧分壓Figure 1 Pulmonary arterial pressure, abdominal aortic oxygen saturation and arterial partial pressure of oxygen of rats in each group

2.3 肺組織形態(tài)學變化

HE染色后，對照組大鼠的肺組織形態(tài)在光鏡和電鏡下均顯示結(jié)構(gòu)正常：光鏡下，肺泡腔結(jié)構(gòu)清晰，肺泡間隔無大量紅細胞，并未出現(xiàn)水腫現(xiàn)象；電鏡下，肺泡結(jié)構(gòu)完整，未出現(xiàn)間質(zhì)水腫。低壓氧艙組和實地低氧組大鼠的肺組織水腫十分嚴重：光鏡下，兩組肺組織均可見肺泡間隔明顯增寬，大量紅細胞和炎性細胞溢出；電鏡下，兩組大鼠均出現(xiàn)肺泡間隔明顯水腫，見圖2。

2.4 肺氧化應激水平分析

ELISA檢測結(jié)果顯示，與正常對照組相比，低壓氧艙組及實地低氧組大鼠肺組織中SOD活力和GSH-Px含量均明顯降低，MDA濃度明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。此外，SOD、MDA和GSH-Px在低壓氧艙組和實地低氧組之間比較，均顯示無明顯差異（P＞0.0 5），見表2。

圖 2 各組大鼠肺組織的光鏡和電鏡觀察結(jié)果Figure 2 Light and electron microscopic results of rat lung tissues in each group

表 2 各組大鼠肺組織氧化應激水平Table 2 Oxidative stress levels in lung tissues of rats in each group(± s)

表 2 各組大鼠肺組織氧化應激水平Table 2 Oxidative stress levels in lung tissues of rats in each group(± s)

注：與對照組相比，**P<0.0 1。

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2.5 肺組織中VEGF及AQP-1表達

實時熒光定量PCR（圖3A）和蛋白質(zhì)印跡法（圖3 B）檢測結(jié)果顯示，低壓氧艙組和實地低氧組大鼠肺組織中AQP-1 mRNA和蛋白表達水平均較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），而VEGF mRNA和蛋白表達水平均較對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。

圖 3 各組大鼠肺組織中VEGF和AQP-1 mRNA（A）及蛋白（B）的表達量分析Figure 3 The expressions of vascular endothelial growth factor (VEGF) and aquaporin-1 (AQP-1) at the levels of mRNA (A)and protein (B)

3 討論

HAPE作為一種非心源性肺水腫，是由于機體快速進入高海拔地區(qū)后對低壓低氧環(huán)境不適應而產(chǎn)生的一種高原地區(qū)特發(fā)性疾病[7]。國內(nèi)外多采用模擬高原低氧環(huán)境復制HAPE大鼠模型，通過觀察大鼠行為活動、疾病的發(fā)生過程及相應病理變化，以確定高原艙模擬的HAPE大鼠模型成功建立。由于高原艙模擬的HAPE大鼠模型的成功建立需要達到相應的評判標準，并受到海拔高度、減壓速度及持續(xù)時間、艙內(nèi)環(huán)境和機體情況等多種因素影響，所以理想的動物模型建立除了能夠復制疾病的發(fā)生、發(fā)展過程及相應病理變化外，還應該滿足操作簡便、因地制宜、人力及物力消耗少等條件[8]。本實驗在既往HAPE動物模型復制（低壓氧艙環(huán)境模擬海拔6 000 m）的研究基礎(chǔ)上，還在實地低氧環(huán)境（青海省瑪多縣海拔4 200 m）下構(gòu)建了HAPE動物模型，然后比較兩組HAPE大鼠模型肺組織的干濕比、顯微結(jié)構(gòu)、超微結(jié)構(gòu)、部分血氧值、肺動脈壓力、關(guān)鍵基因（AQP-1及VEG F）表達及氧化應激對應指標的差異，證明了兩種造模方法均能成功構(gòu)建HAPE模型。

本實驗通過肺組織的HE染色發(fā)現(xiàn)，相較于正常對照組，低壓氧艙組和實地低氧組大鼠均表現(xiàn)出嚴重的肺組織水腫現(xiàn)象，兩組肺組織肺泡間隔明顯增寬，大量紅細胞和炎性細胞溢出，且出現(xiàn)肺泡間隔的明顯水腫，這一結(jié)果說明在低氧刺激下，肺毛細血管通透性增加，大量液體通過靠近阻力血管的動脈壁漏出、轉(zhuǎn)移并潴留，引起肺間質(zhì)和肺泡水腫，推測兩組SD大鼠HAPE模型構(gòu)建成功。此外，在本實驗中，低壓氧艙組和實地低氧組均表現(xiàn)為顯著的肺動脈高壓，而腹主動脈血氧分壓及氧飽和度均明顯下降，這是由于大鼠進入急性低氧環(huán)境后，對環(huán)境的習服適應機制尚未建立，從而產(chǎn)生一系列應激反應，持續(xù)的應激反應使肺血管直接或間接收縮、阻力增大，導致肺動脈壓力升高，從而引起血氧分壓及氧飽和度下降[9]。

國內(nèi)外大量研究表明，肺臟干濕重比的測定是評估肺水腫動物模型效果的最佳方法[10]。本實驗采用該方法評價低氧脅迫方式構(gòu)建的大鼠HAPE模型，結(jié)果顯示，兩組模型中（W1－W2）/W1比值升高，符合肺水腫后肺組織的病變特征。有研究表明，VEGF與其特異性受體結(jié)合后能夠提高血管通透性，且AQP-1與水和蛋白的漏出密切相關(guān)[11]。因此，本實驗通過實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測了肺組織中VEGF及AQP-1的表達，發(fā)現(xiàn)低壓氧艙組和實地低氧組肺組織內(nèi)VEGF表達水平均異常升高，超出機體的代償能力，而兩個模型組大鼠肺組織中AQP-1表達水平均顯著下降。結(jié)合以往文獻推測，VEGF使肺毛細血管通透性增加，導致大量血漿蛋白漏出血管外[12]；而AQP-1使肺泡主動轉(zhuǎn)運液體功能及細胞膜水通透功能異常，出現(xiàn)了水抑制[13]，進而出現(xiàn)了肺水腫現(xiàn)象?，F(xiàn)在的研究認為，SOD是機體內(nèi)主要的抗氧化酶[14]；而MDA作為脂質(zhì)過氧化反應的最終產(chǎn)物，是機體內(nèi)反映氧化損傷程度最經(jīng)典、最有效的指標之一[15]。此外，GSH是一種能夠直接清除ROS、保護細胞免受自由基損害的內(nèi)源性抗氧化劑。本實驗結(jié)果顯示，低壓氧艙組和實地低氧組大鼠肺組織中SOD和GSH-Px含量均顯著低于對照組，說明低氧脅迫后大鼠抗氧化能力下降，機體受到氧化應激損傷；此外這兩組大鼠肺組織中MDA濃度明顯高于對照組，說明HAPE啟動了脂質(zhì)過氧化反應，提高了脂質(zhì)過氧化物含量，從而加重了肺損傷。

綜上所述，本研究對比了兩種造模方法，發(fā)現(xiàn)不同低氧脅迫方式均能構(gòu)建SD大鼠HAPE模型，且可安全、便捷地觀察其病理變化過程。另外，本實驗初次在實地低氧環(huán)境中建立適合高海拔地區(qū)的、簡單有效且可復制的大鼠H A P E實驗模型，為在高原地區(qū)進一步研究HAPE發(fā)病機制并預防和診治該疾病提供了動物實驗基礎(chǔ)，具有重要意義。