濃縮生長(zhǎng)因子對(duì)缺血再灌注誘導(dǎo)的小鼠骨樣細(xì)胞凋亡的作用研究

李石巖， 馬志紅， 李燕波， 曹 雷， 郝旭峰， 何志良， 張 晗， 王承陽

(河北省承德市中心醫(yī)院， 河北 承德 067000)

與許多其他器官不同的是，由于外傷或其他原因?qū)е碌娜梭w骨骼受損會(huì)自發(fā)愈合。關(guān)于骨修復(fù)，其利用骨本身內(nèi)源性再生的潛能，通過增加骨體積，繼而恢復(fù)原始骨結(jié)構(gòu)的過程?？偟膩碚f，骨修復(fù)的過程快速且高效。但在一些病理狀態(tài)下，骨修復(fù)過程可能會(huì)受到阻礙。具體講，大約有10%的骨折患者并發(fā)骨延遲愈合或骨不連，同時(shí)可能出現(xiàn)骨缺損[1]。另外，在某些骨修復(fù)的過程，比如存在骨缺損的植骨、顱面的重建，有一部分患者重建失敗，可能原因包括但不拘泥于血液供應(yīng)較差、骨膜受損嚴(yán)重、老年或并發(fā)骨質(zhì)疏松誘導(dǎo)的骨祖細(xì)胞數(shù)量降低、手術(shù)固定欠佳和損傷部位發(fā)生感染，其中骨細(xì)胞凋亡發(fā)揮重要作用。骨損傷后的骨細(xì)胞凋亡由兩種途徑介導(dǎo)不同的過程：血管生成或從已有血管和血管生成中獲得的新毛細(xì)血管，它們通過重建骨內(nèi)血管和血液供應(yīng)促進(jìn)骨修復(fù)，有助于髓腔的修復(fù)，改善骨愈合過程中的生物力學(xué)性能[2]。富含血小板的血漿首先被認(rèn)為是人類牙科和口腔頜面外科領(lǐng)域骨和組織修復(fù)的有效藥物，其次是整形外科領(lǐng)域皮膚移植傷口愈合的改善證據(jù)。濃縮生長(zhǎng)因子(Concentrated growth factor，CGF)是新一代血小板濃縮物，許多臨床研究表明，CGF可以作為一種骨移植材料，研究還表明，CGF可以增加骨形成和細(xì)胞分化，以及促進(jìn)細(xì)胞增殖和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌[3,4]。然而，CGF對(duì)骨細(xì)胞凋亡的影響尚不清楚。本研究選擇復(fù)制體外小鼠骨樣細(xì)胞(MLO-Y4細(xì)胞)缺血再灌注(ischemic/reperfusion，I/R)模型，進(jìn)一步觀察CGF對(duì)缺血再灌注誘導(dǎo)的MLO-Y4細(xì)胞凋亡的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料:試劑:蛋白定量BCA試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；RIPA裂解液購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；PMSF購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所；caspase-3活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)的BioVision公司；青霉素/鏈霉素購(gòu)自美國(guó)的Sigma公司；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基和PBS購(gòu)自美國(guó)的Coring公司；平臺(tái)離心機(jī)購(gòu)自購(gòu)自意大利的Medifuge公司；平臺(tái)倒置顯微鏡購(gòu)自日本的Nikon公司；細(xì)胞總RNA提取試劑盒、一步法實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)試劑盒購(gòu)自日本的TaKaRa公司。

1.2MLO-Y4細(xì)胞的培養(yǎng):MLO-Y4細(xì)胞購(gòu)自ATCC(美國(guó))，MLO-Y4細(xì)胞培養(yǎng)于含5%小牛血清、5%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、2mM L-谷氨酰胺、72mg/L的青霉素、100mg/mL的鏈霉素的a-MEM培養(yǎng)基中，并置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱。每3d傳代一次。在6孔板中以2×106細(xì)胞/皿的密度接種MLO-Y4細(xì)胞，培養(yǎng)24h。MLO-Y4細(xì)胞I/R模型制備:正常培養(yǎng)MLO-Y4細(xì)胞72h后，給予“缺血緩沖液”刺激，建立缺血模型[5]，缺血緩沖液包含下述物質(zhì)(mmoL/L):118 NaCl、24NaHCO3、1.0 NaH2PO4、2.5 CaCl2-2H2O、1.2 MgCl2、20 乳酸鈉、16 KCl 和 10 脫氧葡萄糖。實(shí)驗(yàn)組分別加入含1%、5%、10%CGFe的完全培養(yǎng)基，37℃、5%CO2孵育10min，然后用1xPBS清洗細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組分別加入含有1%、5%、10%CGFe的缺血緩沖液，處理后的細(xì)胞放置溫度為37℃，CO2濃度為5%細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，處理2h，將缺血緩沖液換為含有1%、5%、10%CGFe無血清培養(yǎng)基，再灌注時(shí)間為24h。對(duì)照組細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基處理2h，完全培養(yǎng)基處理24h。

1.3濃縮生長(zhǎng)因子對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用

1.3.1濃縮生長(zhǎng)因子提取液(concentrate growth factor extracts，CGFe)的制備:本實(shí)驗(yàn)已得到承德市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，志愿者對(duì)過程均知情并同意。篩選現(xiàn)場(chǎng)，確定志愿者不吸煙，進(jìn)行血常規(guī)檢查顯示血小板計(jì)數(shù)位于正常范圍，篩選出的健康男性志愿者年齡35～45歲，共4名，獲得每位志愿者的CGFe，混勻。不同濃度的CGFe均含有10%FBS。

1.3.2caspase-3活性的檢測(cè):檢測(cè)caspase-3的活性所用的方法為熒光法。將細(xì)胞用1×lysis buffer裂解，4℃,14000rpm/min,離心10min，分別取出上清液，將上清液及試劑盒熒光底物同時(shí)加入96孔板，在最佳波長(zhǎng)為405 nm測(cè)定數(shù)值，作為基礎(chǔ)值，將96孔板放置37℃孵箱，避光孵育1.5 h，上機(jī)測(cè)定數(shù)值。應(yīng)用BCA法測(cè)定細(xì)胞的蛋白濃度，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，即2次讀取的吸光度值的差值除以對(duì)應(yīng)細(xì)胞的蛋白濃度即為caspase-3活性。

1.3.3Real-time PCR分析

1.3.3.1mRNA提取、反轉(zhuǎn)及分析:每個(gè)孔中加入1mL Trizol，13500rpm，離心5min，分別加入氯仿、異丙醇、75%乙醇、13500rpm10min4℃，干燥10min，加入DEPC水溶解。將溶于DEPC水中的mRNA吸取1-2μL于Nano-drop上，測(cè)定mRNA濃度及純度(260/280)。根據(jù)定量結(jié)果，計(jì)算反轉(zhuǎn)mRNA的量，一般反轉(zhuǎn)2μg mRNA/管。

反轉(zhuǎn)流程如下：①mRNA(2μg)+random primer 1μL+DEPC ddH2O=10μL 混勻后，72℃ 10 min，冰浴10min。②上述體系分別加入各個(gè)需要反轉(zhuǎn)mRNA的RNase-free的EP管中，置于72℃，10min，再置于冰上，10min。③cDNA合成：上述各管中加入以下試劑：4μL 5×反轉(zhuǎn)錄buffer+2μL 2.5mM dNTP+1μL 逆轉(zhuǎn)錄酶+0.5μL 逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑+1.5μL DEPC水=10μL,使每管的總體系為20μL。④將上述20ul體系混勻，離心后放入PCR儀中，42℃ 1h，95 ℃ 5min，0℃ forever。⑤將制備好的cDNA，保存在-20℃。

1.3.3.2Realtime PCR分析如下：①準(zhǔn)備引物：將引物稀釋為工作液(10μM)；實(shí)驗(yàn)中所用到的引物包括：見表1。②打開Realtime-PCR儀，設(shè)置反應(yīng)條件：反應(yīng)溫度為：95℃ 5min，95℃ 15s，60℃ 45s(45 個(gè)循環(huán))；熔解曲線：55℃，95℃(每個(gè)循環(huán)增加0.5℃，81個(gè)循環(huán))。③每個(gè)反應(yīng)體系按以下混勻：1μL cDNA+1μL 靶基因/內(nèi)參的上游引物+1μL 靶基因/內(nèi)參的下游引物+10μL SYBR Green PCR master mix(2×)+ 7μL ddH2O。④將八聯(lián)排放入PCR儀中，填寫板子的布局。⑤點(diǎn)擊“run”之后確認(rèn)方法正確，再次點(diǎn)擊“run”，彈出“保存”對(duì)話框，保存文件。⑥結(jié)束之后，導(dǎo)出數(shù)據(jù)，分析。⑦結(jié)果分析：靶基因相對(duì)mRNA 水平=2(CT內(nèi)參-CT靶基因)。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用到的引物

2 結(jié) 果

2.1CGFe對(duì)H/R狀態(tài)下MLO-Y4細(xì)胞的caspase-3活性的影響:與對(duì)照(Control,Con)組相比較，缺血再灌注(hypoxia/Reperfusion,H/R)組caspase-3活性明顯升高了119%(2.19%±0.1% vs.1.00%±0.0%, P<0.05)。與H/R組相比，H/R+1%CGFe組caspase-3活性明顯從2.19%±0.1%降低至1.70%±0.1% (P<0.05)；與H/R+1%CGFe組相比，H/R+5%CGFe組caspase-3活性明顯從1.70%±0.1%降低至1.47%±0.0% (P<0.05)；與H/R+5%CGFe組相比，H/R+10%CGFe組caspase-3活性明顯從1.47%±0.0%降低至1.18%±0.0%(P<0.05)(圖1)。

2.2CGFe對(duì)H/R狀態(tài)下MLO-Y4細(xì)胞的Bax mRNA的影響:與Con組相比較，H/R組Bax的mRNA水平明顯升高(2.72±0.08 vs.1.00±0.03, P<0.05)。與H/R組相比，H/R+1%CGFe組Bax的mRNA水平明顯從2.72±0.08降低至2.28±0.07 (P<0.05)；與H/R+1%CGFe組相比，H/R+5%CGFe組Bax的mRNA水平明顯從2.28±0.07降低至1.89±0.05(P<0.05)；與H/R+5%CGFe組相比，H/R+10%CGFe組Bax的mRNA水平明顯從1.89±0.05降低至1.32±0.07(P<0.05)(P<0.05)(圖2)。

圖2 缺血再灌注MLO-Y4細(xì)胞的Bax 的mRNA水平檢測(cè)

2.3CGFe對(duì)H/R狀態(tài)下MLO-Y4細(xì)胞的Bcl-2 mRNA的影響:與Con組相比較，H/R組Bcl-2的mRNA水平明顯降低(0.53±0.00 vs.1.00±0.02, P<0.05)。與H/R組相比，H/R+1%CGFe組Bcl-2的mRNA水平明顯從0.53±0.00升高至0.67±0.01 (P<0.05)；與H/R+1%CGFe組相比，H/R+5%CGFe組Bcl-2的mRNA水平明顯從0.67±0.01升高至0.77±0.01(P<0.05)；與H/R+5%CGFe組相比，H/R+10%CGFe組Bcl-2的mRNA水平明顯從0.77±0.01升高至0.85±0.01(P<0.05)(P<0.05)(圖3)。

圖3 缺血再灌注MLO-Y4細(xì)胞的Bcl-2的 mRNA水平檢測(cè)

2.4CGFe對(duì)H/R狀態(tài)下MLO-Y4細(xì)胞的p53的mRNA的影響:與Con組相比較，H/R組p53的mRNA水平明顯升高(2.01±0.06 vs.1.00%±0.03, P<0.05)。與H/R組相比，H/R+1%CGFe組p53的mRNA水平明顯從2.01±0.06降低至1.55±0.04(P<0.05)；與H/R+1%CGFe組相比，H/R+5%CGFe組p53的mRNA水平明顯從1.55±0.04降低至1.26±0.03(P<0.05)；與H/R+5%CGFe組相比，H/R+10%CGFe組p53的mRNA水平明顯從1.26±0.03降低至1.09±0.02(P<0.05)(P<0.05)(圖4)。

圖4 缺血再灌注MLO-Y4細(xì)胞的p53的mRNA水平檢測(cè)

3 討 論

骨損傷導(dǎo)致血液供應(yīng)受損，影響骨修復(fù)及愈合。如何最大程度降低缺血缺氧導(dǎo)致的骨修復(fù)及骨愈合障礙是亟須解決的問題，其中骨細(xì)胞凋亡發(fā)揮重要作用。在本研究中，我們首次研究證實(shí)CGFe可抑制缺氧再灌注狀態(tài)下骨細(xì)胞的凋亡。

與富含血小板的纖維蛋白的生產(chǎn)類似，CGF的生產(chǎn)過程是完全自然的，無需添加任何生化制劑。因此，CGF避免了免疫反應(yīng)、毒性、交叉污染和倫理問題。此外，CGF由多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子組成，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子[6]，細(xì)胞增殖和成骨分化受多種生長(zhǎng)因子調(diào)控，包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、血小板生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子等。研究表明，CGF可以增加骨形成，但是CGF對(duì)骨損傷修復(fù)研究尚不明確，眾所周知，骨細(xì)胞凋亡與骨損傷修復(fù)障礙的發(fā)展有關(guān)[7]，本研究結(jié)果顯示，10%CGFe的抑制作用明顯比5%CGFe和1%CGFe更強(qiáng)，即在10%濃度以內(nèi)時(shí)CGFe抑制凋亡作用與濃度呈正相關(guān)，伴隨caepaes-3活性下降。本研究證明了體外條件下CGF可抑制缺氧再灌注誘導(dǎo)的骨細(xì)胞的凋亡，人顱頜面部損傷發(fā)生的機(jī)率較身體其他部位高，尤其是下頜骨處于顱頜面部前下端，更易受損。因此，對(duì)下頜骨撞擊傷的研究長(zhǎng)久以來都是創(chuàng)傷領(lǐng)域的重點(diǎn)。CGF在骨損傷修復(fù)中重要作用為下頜骨創(chuàng)傷修復(fù)提供了基礎(chǔ)依據(jù)，具有重要的研究意義。