石油污染土壤多酚氧化酶的動力學及熱力學特征

羅 慧, 馮程程, 趙境怡, 岳中輝

哈爾濱師范大學生命科學與技術(shù)學院, 黑龍江省普通高等學校植物生物學重點實驗室, 黑龍江 哈爾濱 150025

土壤多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)是土壤中一類重要的氧化還原酶，能參與芳香族類化合物的分解轉(zhuǎn)化過程，將土壤中芳香族化合物氧化成醌[1]，因其對土壤環(huán)境的變化較為敏感，學者們常將其作為土壤環(huán)境生態(tài)恢復(fù)的監(jiān)測指標[2-4]. 石油污染后土壤酶活性變化的研究發(fā)現(xiàn)，土壤酶能夠迅速反映出污染程度[5-6]，且利用植物對石油污染進行修復(fù)時，土壤酶也隨之發(fā)生相應(yīng)變化[7]. 石油污染后土壤多酚氧化酶的變化主要受石油污染物的濃度和持續(xù)時間以及修復(fù)植被或修復(fù)微生物種類的影響，如王金成等[8]研究表明，石油污泥原位修復(fù)25～80 d時，土壤多酚氧化酶活性呈下降趨勢；李政等[9-10]研究認為，施用微生物菌劑修復(fù)石油污染會增加土壤多酚氧化酶活性；而陳凱麗等[11]研究發(fā)現(xiàn)，微生物修復(fù)后土壤多酚氧化酶活性在第2周達到最大，之后降低；朱凡等[12]研究了不同樹種修復(fù)PAHs(多環(huán)芳烴)污染土壤后多酚氧化酶活性的變化，結(jié)果表明酶活性在處理9個月時升高隨后又降低，PAHs含量為10 gkg時會促進酶活性，而當其含量達到50 gkg時，表現(xiàn)為隨時間延長，酶活性被抑制，不同樹木種類對酶活性的影響沒有差異；而王洪等[13]研究認為，植物(黑麥草、苜蓿)修復(fù)、微生物修復(fù)及二者聯(lián)合修復(fù)均促進了土壤多酚氧化酶活性，其促進程度表現(xiàn)為植物+微生物菌劑>植物>菌劑；王嬌嬌等[14]發(fā)現(xiàn)，甜菜與牧草間作修復(fù)PAHs污染土壤后，土壤多酚氧化酶活性提高；還有研究[13,15-16]表明，多酚氧化酶活性與石油降解率之間存在一定的相關(guān)關(guān)系. 以上研究從不同角度分析了石油污染對土壤多酚氧化酶活性的影響，但大多僅關(guān)注了酶活變化的結(jié)果，對土壤多酚氧化酶在石油污染土壤中的反應(yīng)過程機制還較少涉及[17]. 土壤酶促反應(yīng)的動力學和熱力學特征是土壤酶學研究中的重要領(lǐng)域，對探討土壤酶促反應(yīng)機制有著重要意義[18-20]，研究土壤多酚氧化酶活性的動力學和熱力學特征能夠判斷酶促反應(yīng)進行的可能性、方向和限度，有利于進一步研究多酚氧化酶在石油污染土壤中的酶促反應(yīng)速度、過程和能量變化.

鑒于此，該文在已有石油污染對土壤多酚氧化酶影響研究[21-22]的基礎(chǔ)上，以距油田工作區(qū)中心不同距離的區(qū)域代表不同石油污染程度，研究不同溫度下各區(qū)域內(nèi)裸地和羊草(Leymuschinensis)修復(fù)地的土壤多酚氧化酶活性變化，進而分析土壤多酚氧化酶的動力學和熱力學特征，探究其在石油污染土壤中的酶促反應(yīng)機制及行為特征，揭示其在石油污染土壤中的作用，以期為松嫩草地石油污染退化土壤的生物修復(fù)提供科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

大慶油田位于松嫩平原西部(121°36′E～126°36′E、44°00′N～48°35′N)，該區(qū)屬溫帶大陸性季風氣候，年均氣溫4.2 ℃，春季干燥，夏季炎熱，秋季涼爽，冬季嚴寒；年均無霜期143 d左右，年均降水量427.5 mm，蒸發(fā)量 1 635 mm；土壤類型為蘇打鹽堿土，pH在8.5以上，鹽土和堿土呈斑狀分布.

1.2 土壤樣品采集與處理

對大慶油田工作區(qū)進行踏查，發(fā)現(xiàn)油田采油、貯存、運輸及其他生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量落地石油，由于土壤對石油類有機污染物具有較強的吸附截留能力，導(dǎo)致大部分污染物被截留在土壤表層，因此土壤表面逐漸形成不同深淺程度的石油污斑. 油田作業(yè)區(qū)有關(guān)部門已選取有代表性的草地，通過選用抗旱、耐鹽堿的羊草對鹽堿草地土壤石油污染進行了治理改良. 根據(jù)踏查情況，將石油工作區(qū)作為中心，分別在直徑為1、5、15 km的同心圓上確定采樣區(qū)域，采樣區(qū)域中包括自然草地和羊草修復(fù)草地. 于2016年10月在不同距離的裸地(自然草地中)和羊草修復(fù)草地中進行6個樣地的土壤樣品采集工作. 6個樣地均利用S型取樣法，每個樣地隨機選取5個樣點，各樣點隨機選取3個“亞樣點”，再混合成一個“復(fù)合樣點”，共30個“復(fù)合樣點”，除去土壤表層植被，取0～15 cm土層土樣，帶回實驗室剔除根系等雜物后，自然風干后過2 mm篩，用于土壤理化性質(zhì)及土壤酶活性測定. 研究樣地基本性質(zhì)見表1.

1.3 土壤酶活性測定方法

土壤多酚氧化酶活采用鄰苯三酚比色法測定[23]，最適底物濃度為80 mmolL，最適溫度為30 ℃. 設(shè)置濃度梯度為20、40、80、160 mmolL，設(shè)置溫度梯度為10、20、30、40 ℃.

1.4 土壤酶動力學和熱力學參數(shù)的計算方法

1.4.1土壤多酚氧化酶動力學參數(shù)計算

酶促反應(yīng)可用Michaelis-Menten方程[24]來描述：

(1)

表1 研究樣地土壤基本理化性質(zhì)

式中：υ0為酶反應(yīng)初速度，mg(g·h)；S為底物濃度，mmolL；Vmax為酶促反應(yīng)最大速度，mg(g·h)；Km為米氏常數(shù)，mmolL.

采用Eadie-Hofstee法將Michaelis-Menten方程中分子、分母同時除以S，得到式(2)，以υ0S為橫坐標、υ0為縱坐標，做圖得到的斜率和截距即分別對應(yīng)Km和Vmax.

(2)

1.4.2土壤多酚氧化酶熱力學參數(shù)計算

活化能Ea(kJmol)、溫度系數(shù)Q10、活化自由能ΔG(kJmol)、活化焓ΔH(kJmol)、活化熵ΔS〔J(mol·K)〕的計算方法如式(3)～(7)所示.

活化能(Ea)由Arrhenius速度方程的積分式求得，以1T為橫坐標、lnk(k為酶促反應(yīng)速度常數(shù))為縱坐標，做圖得到斜率為-EaR，求得Ea.

(3)

Q10=e10EaRT(T+10)

(4)

(5)

ΔH=Ea-RT

(6)

(7)

式中：k為酶促反應(yīng)速度常數(shù)；A為指前因子；T為熱力學溫度，K；R為氣體常數(shù)，8.314 J(mol·K)；N為阿伏加德羅常數(shù)，6.023×1023個mol；h為普朗克常數(shù)，6.626×10-34Js[24].

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)整理，采用SAS 9.2軟件進行單因素方差分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤多酚氧化酶活性的變化

距石油污染地不同距離的裸地和羊草修復(fù)地土壤多酚氧化酶活性變化情況如表2所示. 由表2可見，隨著溫度的升高和底物濃度的增加，各樣地土壤多酚氧化酶活性逐漸增加(P<0.05)，在30 ℃或40 ℃、底物濃度為80 mmolL或160 mmolL時達到最大值. 同一溫度下，裸地土壤多酚氧化酶活性高于羊草修復(fù)地(P<0.05)，其中以距油田工作區(qū)5 km處裸地(BMP)的酶活性最大；羊草修復(fù)地在10 ℃和20 ℃時，表現(xiàn)為距油田工作區(qū)15 km處(LRP)的酶活性最大，30 ℃和40 ℃時表現(xiàn)為距油田工作區(qū)1 km處(LVP)的酶活性最大.

2.2 土壤多酚氧化酶動力學特征的變化

2.2.1土壤多酚氧化酶酶促反應(yīng)的Km

Km為米氏常數(shù)，是反映酶與底物結(jié)合能力的指標，其值越小，表明酶與底物的親和力越高，酶與底物越容易結(jié)合. 由圖1(a)可知，隨溫度升高，距油田工作區(qū)5 km處(BMP)、15 km處裸地(BRP)的Km逐漸降低，而距油田工作區(qū)1 km處裸地(BVP)的Km先降低(20 ℃時)后升高；距油田工作區(qū)不同距離羊草修復(fù)地的Km均隨溫度升高呈先升高后降低的趨勢，在30 ℃時達到最大值. 在10 ℃時，羊草修復(fù)地Km小于同距離裸地，而在20、30、40 ℃時,同距離樣地間Km的變化沒有規(guī)律.

2.2.2土壤多酚氧化酶酶促反應(yīng)的Vmax

Vmax為酶促反應(yīng)最大速度，用來表征酶-底物復(fù)合體分解為產(chǎn)物和酶分子的能力，同時也能反映酶的總量，其值越大，表明酶促反應(yīng)速度越快. 由圖1(b)可知，隨溫度升高，土壤多酚氧化酶的Vmax逐漸增大(P<0.05)，在30 ℃或40 ℃時達到最大值；各溫度下，土壤多酚氧化酶的Vmax均表現(xiàn)為距油田工作區(qū)5 km 處裸地(BMP)最大、距油田工作區(qū)5 km處羊草修復(fù)地(LMP)最小(P<0.05).

2.2.3土壤多酚氧化酶酶促反應(yīng)的VmaxKm

VmaxKm用于表征酶的催化性能，反映酶催化反應(yīng)的速率，其值越大，表明酶促反應(yīng)速度越快. 由圖1(c)可知，隨溫度升高，土壤多酚氧化酶的VmaxKm呈逐漸增加趨勢(P<0.05)，在40 ℃時達到最大值，但距油田工作區(qū)1 km處裸地(BVP)土壤多酚氧化酶的VmaxKm先增后降，在20 ℃時達到最大值. 在10 ℃和20 ℃時，距油田工作區(qū)1 km處(LVP)、15 km處羊草修復(fù)地(LRP)和裸地(BVP、BRP)的VmaxKm高于5 km 處的樣地(LMP、BMP)(P<0.05)；在30 ℃和40 ℃時，距油田工作區(qū)5 km處裸地(BMP)的VmaxKm最大，顯著大于其他樣地(P<0.05).

表2 不同溫度、不同底物濃度下土壤多酚氧化酶活性的變化情況

注： 不同大寫字母表示同一溫度不同樣地間土壤多酚氧化酶的Km、Vmax、VmaxKm差異顯著(P<0.05)；不同小寫字母表示同一樣地不同溫度間土壤多酚氧化酶的Km、Vmax、VmaxKm差異顯著(P<0.05).

2.3 土壤多酚氧化酶熱力學特征的變化

2.3.1土壤多酚氧化酶酶促反應(yīng)的Ea和Q10

Ea是土壤酶促反應(yīng)活化能，用來表征酶促反應(yīng)進行所需要的反應(yīng)能障，Ea越大，表明發(fā)生反應(yīng)所需的能障越大，反應(yīng)速度越慢；Q10為溫度每變化10 ℃時酶活性的變化值. 由表3可知，土壤多酚氧化酶的Q10在距油田工作區(qū)1 km處裸地(BVP)、1 km處羊草修復(fù)地(LVP)隨溫度升高而逐漸降低(P<0.05)，而在其他樣地隨溫度變化的差異不顯著. 在不同距離裸地和羊草修復(fù)地下，Q10和Ea均表現(xiàn)為距石油工作區(qū)1 km處裸地(BVP)最高，5 km處(BMP)、15 km處(BRP)較1km處(BVP)降低(P<0.05)，而距石油工作區(qū)1 km處羊草修復(fù)地最低(LVP)，5 km處(LMP)、15 km處(LRP)羊草修復(fù)地較1 km處(LVP)增加(P<0.05).

表3 不同溫度下各樣地土壤多酚氧化酶熱力學參數(shù)

2.3.2土壤多酚氧化酶酶促反應(yīng)的ΔG、ΔH、ΔS

ΔG是酶促反應(yīng)活化自由能，用來反映反應(yīng)物達到過渡態(tài)時所需要的自由能；ΔH是酶促反應(yīng)活化焓，通常用以表征使酶的活性部位與反應(yīng)物發(fā)生互補時需要從外界所獲取的能量；ΔS是酶促反應(yīng)活化熵，能反映體系無序性量度復(fù)合物形成過程中的結(jié)構(gòu)變化特征及程度. 土壤多酚氧化酶的ΔG、ΔH、ΔS如表3所示，由表3可知，隨溫度升高，土壤多酚氧化酶的ΔG逐漸增大(P<0.05)，而ΔH、ΔS隨溫度變化沒有顯著差異. 同一溫度下，ΔG在各樣地間的變化沒有規(guī)律性；ΔH、ΔS與Q10和Ea的變化規(guī)律相一致.

3 討論

3.1 石油污染對土壤多酚氧化酶動力學及熱力學特征的影響

土壤多酚氧化酶活性對石油污染的響應(yīng)大多表現(xiàn)為激活效應(yīng)[25-26]，該研究發(fā)現(xiàn)，石油污染裸地土壤多酚氧化酶活性高于羊草修復(fù)地，說明石油污染在一定程度上促進了土壤多酚氧化酶活性，同時在裸地中距油田工作區(qū)5 km處(BMP)酶活性最大，即隨石油污染程度的降低，酶活性表現(xiàn)為先升高后降低，這與以往研究結(jié)果[26]基本一致. 究其原因：由于距油田工作區(qū)5 km處裸地(BMP)多酚氧化酶的Vmax、VmaxKm大于1 km(BVP)和15 km處裸地(BRP)，Vmax、VmaxKm增加，土壤多酚氧化酶與底物結(jié)合能力較強，酶含量增多，酶催化反應(yīng)中酶-底物復(fù)合體的分解比形成更容易進行，酶促反應(yīng)的潛勢較高，酶促反應(yīng)速度加快，酶催化性能較好，酶與石油污染物充分反應(yīng)，從而加快石油的降解過程，石油降解后的物質(zhì)又被土壤微生物利用，作為微生物繁殖的營養(yǎng)來源和多酚氧化酶反應(yīng)的基質(zhì)，提高多酚氧化酶總量[9,17]，進一步增強了酶活性. 但當靠近石油工作區(qū)(石油烴含量為5.3%～7.5%)[27]時，石油污染加重，表現(xiàn)為距石油區(qū)1 km處(BVP)的多酚氧化酶活性、Vmax、VmaxKm降低，這是因為石油中的有毒物質(zhì)抑制了微生物的合成與分泌，土壤多酚氧化酶與底物結(jié)合能力下降，酶催化反應(yīng)中酶-底物復(fù)合體的形成強度較大，酶促反應(yīng)的潛勢較低，酶促反應(yīng)速度減慢，從而降低了酶的活性[28]. 因此通過動力學特征的變化(酶促反應(yīng)作用機制)研究可以解釋土壤多酚氧化酶在中度石油污染土壤(石油烴含量為5%左右)中的變化規(guī)律[27].

該研究還發(fā)現(xiàn)，熱力學參數(shù)Q10、Ea、ΔH、ΔS的最大值均出現(xiàn)在距石油工作區(qū)1 km處裸地(BVP)，5 km 處(BMP)、15 km處(BRP)降低，說明隨石油污染程度的降低，土壤中多酚氧化酶酶促反應(yīng)發(fā)生的能障較低，所需吸收外界能量較小，反應(yīng)進行的方向性和強度較大，酶底物復(fù)合物形成過程中的有序性較高，能夠促進土壤多酚氧化酶與底物復(fù)合體的快速合成，增加土壤多酚氧化酶量，加速裸地中土壤多酚氧化酶酶促反應(yīng)速度及催化效率，從而使酶活性增大，這也從酶促反應(yīng)過程中能量變化的角度解釋了石油污染對土壤多酚氧化酶的影響. 綜合來看，石油污染后，鹽堿土壤多酚氧化酶活性的增加是通過動力學和熱力學特征的變化來調(diào)控的，但其調(diào)控與石油污染濃度的關(guān)系有待做進一步深入探討.

3.2 升溫和植物修復(fù)對土壤多酚氧化酶動力學及熱力學特征的影響

溫度對土壤酶活性具有直接作用，是影響土壤酶活性的重要環(huán)境因子. 一般而言，在一定溫度范圍內(nèi)土壤酶活性隨著溫度的升高而增加[29]，劉霜等[30]研究發(fā)現(xiàn)，隨溫度升高，長白山土壤中β-1,4-葡萄糖苷酶和β-1,4-N-乙酰葡糖氨糖苷酶的Km降低，VmaxKm增加；鼎湖山土壤中β-1,4-葡萄糖苷酶和β-1,4-N-乙酰葡糖氨糖苷酶的Vmax、VmaxKm增加. ZHANG等[31]發(fā)現(xiàn)，溫度升高會促進東北地區(qū)4種土壤中脲酶、磷酸酶、芳基硫酸酯酶的動力學特征，降低土壤酶熱力學特征. 該研究發(fā)現(xiàn)，隨溫度升高，石油污染土壤中多酚氧化酶的Km逐漸減小，Vmax、VmaxKm逐漸增大，ΔH、ΔS呈逐漸減小的變化趨勢，這與以往的研究結(jié)果[30-31]基本一致，說明溫度升高(30 ℃、40 ℃)能加快石油污染土壤中多酚氧化酶分子運動，促使酶與底物進一步結(jié)合，降低土壤多酚氧化酶酶促反應(yīng)在石油污染土壤中的反應(yīng)能量，增大酶活性，促進酶反應(yīng)的催化作用，提高酶-底物過渡態(tài)的有序性，利于向生成產(chǎn)物的方向轉(zhuǎn)化，使土壤多酚氧化酶在石油污染土壤中更容易與酚類物質(zhì)結(jié)合進行催化反應(yīng)及物質(zhì)循環(huán)過程. 另外，土壤多酚氧化酶的Q10在距油田工作區(qū)1 km 處裸地(BVP)和羊草修復(fù)地(LVP)隨溫度升高而逐漸降低，說明土壤多酚氧化酶酶促反應(yīng)在低溫時對溫度的敏感性較大，而隨溫度升高，酶促反應(yīng)速度對溫度的敏感性下降，升溫提供的熱量在酶的熱變性過程中消耗較少，酶活性相應(yīng)增加較多，這與German等[32]研究土壤β-酶葡萄糖苷酶活性的Q10與年均溫呈負相關(guān)的結(jié)果相互印證.

同時該研究還發(fā)現(xiàn)，從低溫(10 ℃和20 ℃)到最適溫度(30 ℃)或高溫(40 ℃)的變化過程中，羊草修復(fù)地土壤多酚氧化酶活性、Vmax、VmaxKm都有升高趨勢，Ea、ΔG呈降低趨勢，這可以認為是羊草修復(fù)后升溫加速了石油污染土壤中多酚氧化酶酶促反應(yīng)的進行，提高了多酚氧化酶的生物反應(yīng)速率，反應(yīng)所需的活化能和自由能降低，酶促反應(yīng)過程中的能障減小，反應(yīng)自發(fā)程度提高，促進了土壤多酚氧化酶在石油污染鹽堿草地中發(fā)揮其作用. 但羊草修復(fù)地土壤多酚氧化酶活性、Vmax、VmaxKm大都小于裸地，這可能是因為羊草有一定的吸附石油的作用，可以在一定程度上“補償”多酚氧化酶的作用；而羊草修復(fù)后的Ea、ΔG、ΔH、ΔS均在距石油工作區(qū)1 km處(LVP)最低，低于裸地，說明石油污染羊草修復(fù)后反應(yīng)發(fā)生的能障較低，反應(yīng)過程中分子構(gòu)型變化所需的力減少，易于構(gòu)型的改變，所需吸收外界能量較小，酶-底物復(fù)合體過渡態(tài)有序性較高，能夠促進土壤多酚氧化酶與底物復(fù)合體的快速合成，增加土壤多酚氧化酶量，加速裸地中土壤多酚氧化酶促反應(yīng)速度及催化效率，從而使酶活性增大，這對提高植物修復(fù)石油污染物的研究有一定積極意義[33].

4 結(jié)論

a) 不同含油量石油污染裸地和羊草修復(fù)地的土壤多酚氧化酶活性及動力學參數(shù)Vmax和VmaxKm在10～40 ℃溫度范圍內(nèi)隨溫度升高而逐漸增大，在30 ℃或40 ℃時達到最大；在同一溫度下，石油污染裸地土壤多酚氧化酶活性高于羊草修復(fù)地，且在含油量為5%左右的中等石油污染裸地土壤中酶活性最高，Km和VmaxKm在各樣地間無規(guī)律性變化，Vmax表現(xiàn)為距石油工作區(qū)5 km處裸地最大、羊草修復(fù)地最小.

b) 不同含油量石油污染裸地和羊草修復(fù)地多酚氧化酶的熱力學參數(shù)Q10、ΔH、ΔS在10～40 ℃溫度范圍內(nèi)隨溫度升高的差異不顯著，ΔG呈逐漸增加趨勢；在同一溫度下，Q10、Ea、ΔH、ΔS均表現(xiàn)為距石油工作區(qū)1 km處裸地最大、羊草修復(fù)地最小.