miR-7敲減CD4+ T細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)輸對(duì)小鼠急性肝損傷模型的影響*

岳東旭， 趙娟娟， 陳慧子， 丁 濤， 胡 琳， 潘飛飛， 郭萌萌， 陳 超， 徐 林

(遵義醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室暨貴州省生物治療人才基地, 貴州省基因檢測(cè)與治療特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 遵義 563099)

急性肝損傷(acute liver injury, ALI)通常導(dǎo)致肝臟細(xì)胞在極短的時(shí)間內(nèi)發(fā)生損傷和凋亡，引起肝臟組織正常功能明顯降低，嚴(yán)重甚至可導(dǎo)致肝臟功能完全喪失，常伴有凝血功能障礙和黃疸等癥狀，嚴(yán)重者可發(fā)展成為肝性腦病[1]。大量研究報(bào)道，CD4+T細(xì)胞作為機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其功能變化在急性肝損傷的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，然而其功能調(diào)控機(jī)制仍有待闡明[2-3]。微小RNA-7(microRNA-7，miR-7)作為微小RNAs(mi-RNAs)家族成員，與機(jī)體免疫細(xì)胞發(fā)育、免疫應(yīng)答以及免疫相關(guān)臨床疾病的發(fā)生過(guò)程密切相關(guān)[4]。新近，我們發(fā)現(xiàn)敲減(knock down，KD)miR-7的表達(dá)可明顯加重小鼠的肝臟急性損傷，且伴隨肝臟組織中CD4+T細(xì)胞的比例及其細(xì)胞因子干擾素γ(interfe-ron-γ, IFN-γ)分泌水平的明顯上調(diào)，推測(cè)miR-7可能與CD4+T細(xì)胞的活化功能調(diào)控有關(guān)[5-6]?；诖?，本實(shí)驗(yàn)利用過(guò)繼轉(zhuǎn)輸實(shí)驗(yàn)技術(shù)，觀(guān)察敲減miR-7的CD4+T細(xì)胞對(duì)小鼠急性肝損傷模型的影響，并分析過(guò)繼轉(zhuǎn)輸?shù)腃D4+T細(xì)胞在體內(nèi)的活化和功能的可能變化，以期為后續(xù)深入探討miR-7對(duì)CD4+T細(xì)胞活化功能的調(diào)控作用、急性肝損傷的發(fā)生機(jī)制和治療新策略開(kāi)發(fā)提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無(wú)特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)8～12周齡的FVB/N背景野生型(wild-type，WT)小鼠和FVB/N背景非條件性miR-7基因敲減小鼠[7-9]均飼養(yǎng)于遵義醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中得到遵義醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用委員會(huì)的批準(zhǔn)和倫理指導(dǎo)(2013016)。

2 主要試劑和儀器

4%多聚甲醛(重慶川東化工公司)；HE染色液(泰康醫(yī)療)；Mouse CD4+CD62L+T Cell Isolation Kit II (Miltenyi Biotec)； IC Fixation Buffer、Permeabilization Buffer以及抗小鼠CD4、IFN-γ、CD62L和白細(xì)胞介素(interleukin-4, IL-4)流式抗體(eBioscience)；RPMI-1640培養(yǎng)基(HyClone)；羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE；上海浩然生物技術(shù)有限公司)。SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠(chǎng))；IX-51倒置顯微鏡和IX-71倒置熒光顯微鏡(Olympus)；低溫高速離心機(jī)(Thermo)；流式細(xì)胞分析儀(Beckman Coulter)。

3 主要方法

3.1脾臟單細(xì)胞懸液的制備 斷頸法處死伴刀豆球蛋白A(concanavalin A, ConA)誘導(dǎo)的WT和miR-7KD的ALI模型小鼠，75%的乙醇內(nèi)浸泡5 min，超凈臺(tái)中取出脾臟組織后置于加有10 mL PBS緩沖液的平皿中，然后于200目無(wú)菌細(xì)胞篩上研磨組織，分別過(guò)濾2次；將獲得的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中， 300×g離心10 min；棄上清，彈勻剩余液體和細(xì)胞，加入3 mL紅細(xì)胞裂解液，置于冰上15 min；然后再加入10 mL PBS緩沖液重懸細(xì)胞，1 200 r/min，10 min，棄上清，彈勻剩余液體和細(xì)胞后，然后加入PBS緩沖液于200目篩網(wǎng)再次過(guò)濾，重復(fù)洗滌2次，將細(xì)胞液收集于新的15 mL離心管中，即得到脾臟組織單細(xì)胞懸液。

3.2磁珠分選小鼠脾臟CD4+CD62L+T細(xì)胞 取方法3.1中獲得的小鼠脾臟組織單細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，按照10 μL/107cells 的比例，避光加入CD4+T cell biotin-antibody cocktail II，混勻，放置4 ℃冰箱，15 min；然后加入30 μL PBE(PBS+1%胎牛血清)，按照20 μL/107cells的比例，避光加入anti-biotin MicroBeads，混勻，放置4 ℃冰箱，20 min；加入PBE至15 mL，放置離心機(jī)中， 300×g離心10 min，棄上清，彈勻剩余液體和細(xì)胞，加入2 mL PBE液；準(zhǔn)備LS柱置于磁珠分選架上，加入1 mL PBE提前濕潤(rùn)磁珠，將帶有抗體的細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至LS柱，用PBE液沖洗離心管2次，每次2 mL，均轉(zhuǎn)移至LS柱，將液體收集于新的15 mL離心管，既得到CD4+T細(xì)胞懸液；進(jìn)行計(jì)數(shù)，1 200 r/min離心10 min，緩慢棄上清，彈勻剩余液體和細(xì)胞，加入800 μL PBE重懸細(xì)胞，按照20 μL/107cell 的比例，避光加入CD62L (L-selectin) MicroBeads，混勻，4 ℃，20 min；加入PBE液至15 mL，于離心機(jī)中300×g離心10 min，緩慢棄上清，彈勻剩余液體和細(xì)胞，加入2 mL PBE液；準(zhǔn)備LD柱置于磁珠分選架上，加入1 mL PBE提前濕潤(rùn)磁珠，將帶有抗體的細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至LD柱，用PBE液沖洗離心管2次，每次2 mL，均轉(zhuǎn)移至LD柱，將液體收集于15 mL離心管，既得到CD4+CD62L+T細(xì)胞懸液；將LD柱置于新的15 mL離心管上，加入2 mL PBE液，輕柔緩慢的推動(dòng)柱芯，將CD4+CD62L+T細(xì)胞沖洗下來(lái)，重復(fù)2次。

3.3過(guò)繼轉(zhuǎn)輸模型的建立 取磁珠分選獲得的WT和miR-7KD小鼠脾臟組織中的CD4+CD62L+T細(xì)胞，使細(xì)胞重懸于PBS緩沖液中，配制單細(xì)胞懸液濃度為1×109/L，每1 mL細(xì)胞懸液中加入2 μL CFSE，37 ℃孵育10 min后，加入5倍體積的含2%胎牛血清的PBS，輕輕吹勻細(xì)胞，終止染色；經(jīng)不含血清的PBS洗滌3遍。分別按照每只小鼠2×106個(gè)細(xì)胞經(jīng)尾部靜脈注射給同10周齡WT小鼠(n=6)，12 h 后，建立急性肝損傷小鼠模型，48 h后收取相應(yīng)的結(jié)果。

3.4觀(guān)察小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)的變化 斷頸法處死方法3.3中造模48 h后的WT和miR-7KD小鼠，分別取小鼠的肝臟組織，觀(guān)察肝臟形態(tài)學(xué)變化、測(cè)量肝臟重量并計(jì)算重量指數(shù)[10], 重量指數(shù)=小鼠臟器/小鼠重量。

3.5HE染色檢測(cè)小鼠肝臟組織的病理變化 斷頸法處死方法3.3中造模48 h后的WT和miR-7KD小鼠，分別取所要觀(guān)察小鼠的肝臟組織，4%甲醛固定24 h后，石蠟包埋，切片成5 μm厚度，HE染色，顯微鏡下觀(guān)察其組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)變化。

3.6流式細(xì)胞術(shù) 取制備好的待測(cè)肝臟單細(xì)胞懸液(1×106～1×107個(gè))，用100 μL PBS緩沖液重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至專(zhuān)用流式管中，分別加入流式抗體CD4-Percp-Cy5.5和CD62L-PE 1 μL，混勻，置于冰上避光孵育30 min，然后用PBS液洗滌2遍，1 200 r/min離心10 min；棄上清，彈勻細(xì)胞后，用100 μL PBS緩沖液重懸細(xì)胞，加入100 μL IC Fixation Buffer冰上孵育15 min，在加入200 μL Permeabilization Buffer 冰上孵育40 min，1 200 r/min離心10 min，棄上清。分別加入IL-4-APC和IFN-γ-PC5.5各1 μL，混勻冰上孵育40 min，然后用PBS洗滌2遍， 300×g離心10 min，棄去上清，用PBS補(bǔ)至500 μL，混勻，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

3.7RNA的提取 先將細(xì)胞加入1 mL RNAisoTMPlus，反復(fù)吹打，室溫放置5 min，然后在標(biāo)本中加入200 μL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置3 min，然后2～8 ℃、10 000×g離心15min，離心后樣品分為3層，去水相中液體，轉(zhuǎn)移到新的離心管，按照1 mL TRIzol的比例加入500 μL異丙醇，室溫放置10 min，然后2～8 ℃、10 000×g離心10 min，棄去上清，加入1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，然后2～8 ℃、7 500×g離心5 min，棄去上清，放置室溫干燥5 min，加入25～200 μL無(wú)RNsae的水，混勻，放置于-80 ℃。

3.8Real-time PCR檢測(cè)凋亡分子的相對(duì)表達(dá)水平 將提取的RNA利用TaKaRa的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)利用Oligo dT Primer和Random 6-mers引物，使用反轉(zhuǎn)錄通用體系，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件為： 50 ℃ 15 min, 85 ℃ 5 s, 4 ℃保存。Bax的上游引物序列為5’-ATGCGTCCACCAAGAAGC-3’，下游引物序列為5’-CAGTTGAAGTTGCCATCAGC-3’；P53 的上游引物序列為5’-CGTAAACGCTTCGAGATGTTC-3’，下游引物序列為GACTGGCCCTTCTTGGTCTT-3’。Real-time PCR的條件是: 95 ℃ 10 min; 95 ℃ 30 s, 60 ℃ 6 s，共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5軟件分析，組間比較采用兩獨(dú)立樣本資料的t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 過(guò)繼轉(zhuǎn)輸模型小鼠肝臟組織的形態(tài)學(xué)變化

與WT小鼠CD4+CD62L+T細(xì)胞轉(zhuǎn)輸對(duì)照組(WT組)相比，miR-7敲減CD4+CD62L+T細(xì)胞轉(zhuǎn)輸組(miR-7KD組)小鼠的肝臟組織顏色變淺，肝臟重量明顯減輕(P<0.01)，但肝臟的重量指數(shù)顯著增加(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1. The morphological changes of the liver from WT and miR-7KD mice with acute liver injury. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsWT group.

圖1小鼠肝臟組織形態(tài)、重量和重量指數(shù)的變化

2 過(guò)繼轉(zhuǎn)輸模型小鼠肝臟組織病理學(xué)變化

HE染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-7KD轉(zhuǎn)輸組小鼠損傷的肝臟細(xì)胞明顯增加，見(jiàn)圖2。

Figure 2. The pathological changes of the liver tissues observed by HE staining. The red arrowheads indicated the areas of the degenerating cells.

圖2過(guò)繼轉(zhuǎn)輸CD4+T細(xì)胞后小鼠肝臟組織病理學(xué)變化

3 ALI模型小鼠肝臟組織凋亡分子表達(dá)的變化

Real-time PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比,miR-7KD轉(zhuǎn)輸組小鼠肝臟組織中促凋亡蛋白分子Bax和P53的mRNA水平均明顯升高(P<0.05,P<0.01)，見(jiàn)圖3。

Figure 3. The mRNA expression levels of Bax and P53 in the li-ver from acute liver injury model mice. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsWT group.

圖3過(guò)繼轉(zhuǎn)輸小鼠模型肝臟組織中凋亡蛋白分子的表達(dá)變化

4 ALI模型小鼠肝臟組織中CD4+ T細(xì)胞活化水平變化

流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在miR-7KD轉(zhuǎn)輸組小鼠的肝臟組織中，轉(zhuǎn)輸CD4+T細(xì)胞活化膜分子CD62L的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

5 過(guò)繼轉(zhuǎn)輸?shù)腃D4+ T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平變化

流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在miR-7KD轉(zhuǎn)輸組小鼠的肝臟組織中，CFSE+CD4+T細(xì)胞分泌的IFN-γ水平明顯升高(P<0.05)，而IL-4的表達(dá)水平則顯著下降(P<0.01)，見(jiàn)圖5。

Figure 4. The levels of CD62L in the CD4+T cells from acute liver injury model mice. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsWT group.

圖4過(guò)繼轉(zhuǎn)輸小鼠模型肝臟組織中CD4+T細(xì)胞的活化膜分子CD62L的水平

討 論

微小RNAs是一段內(nèi)源性非編碼RNA分子，對(duì)轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)起重要的負(fù)調(diào)控作用。新近研究顯示，微小RNAs在包括ALI在內(nèi)的多種肝臟疾病發(fā)生中起到了關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，改變特定miRNA的表達(dá)水平可影響肝臟組織損傷的發(fā)展進(jìn)程，如Xuan 等[11]利用腹腔注射CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)miR-652和miR-29a的表達(dá)水平升高，能通過(guò)調(diào)控β-arrestin 1的表達(dá)來(lái)抑制小鼠CD4+T細(xì)胞的活化，進(jìn)而減輕小鼠肝纖維化的發(fā)生。類(lèi)似的，Yang等[12]也報(bào)道了miR-15a/miR16-1基因敲除之后，CD4+T細(xì)胞能夠產(chǎn)生更多的IL-22，增強(qiáng)肝臟組織的修復(fù)能力。以上數(shù)據(jù)提示，深入探討特定miRNA分子在ALI等肝臟疾病發(fā)生過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用，不僅有助于對(duì)相關(guān)疾病發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)，且對(duì)后續(xù)臨床診斷治療新策略開(kāi)發(fā)均具有積極意義。miR-7作為miRNA家族成員，在包括肝臟等的多個(gè)組織、器官及細(xì)胞中存在表達(dá)，且與組織器官的發(fā)育、分化及損傷修復(fù)密切相關(guān)[13]。近來(lái)研究報(bào)道m(xù)iR-7與肝臟相關(guān)疾病的發(fā)生也密切相關(guān)[14]。新近，我們利用ConA誘導(dǎo)ALI小鼠模型，發(fā)現(xiàn)miR-7缺乏可明顯加重肝臟組織的炎癥損傷，同時(shí)肝臟組織中CD4+T細(xì)胞的活化水平及其細(xì)胞因子IFN-γ的分泌水平明顯上調(diào)[5]。該研究提示miR-7可能是ALI發(fā)生的新調(diào)控分子。然而，其具體調(diào)控機(jī)制仍有待闡明。

Figure 5. The levels of IL-4 and IFN-γ in the CD4+T cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsWT group.

圖5轉(zhuǎn)輸組小鼠肝臟組織中轉(zhuǎn)輸?shù)腃D4+T細(xì)胞IL-4和IFN-γ的表達(dá)情況

過(guò)繼細(xì)胞轉(zhuǎn)輸(adoptive cell transfer，ACT)是觀(guān)察特定細(xì)胞群體體內(nèi)功能改變和效應(yīng)的重要技術(shù)平臺(tái)[15-16]。我們課題組前期利用ACT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在小鼠自身免疫性腸炎中miR-126KD后，CD4+T細(xì)胞活化水平顯著升高，提示miR-126在CD4+T細(xì)胞體內(nèi)活化和功能具有重要調(diào)控作用[17]。此外，鄭晨宏等[18]在ConA誘導(dǎo)的小鼠ALI中，采用過(guò)繼轉(zhuǎn)輸技術(shù)觀(guān)察到CD24缺陷可降低肝細(xì)胞STAT1磷酸化來(lái)降低CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ，進(jìn)而減輕急性肝損傷的病理?yè)p傷。在本實(shí)驗(yàn)中，我們也利用過(guò)繼轉(zhuǎn)輸實(shí)驗(yàn)，首次觀(guān)察到過(guò)繼轉(zhuǎn)輸?shù)膍iR-7敲減小鼠來(lái)源CD4+T細(xì)胞可顯著增加急性肝損傷模型小鼠的肝臟組織損傷，包括肝組織重量明顯減輕，重量指數(shù)明顯增加；HE結(jié)果也顯示肝臟組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增多；同時(shí)，肝臟組織促凋亡分子Bax和P53的mRNA水平均顯著升高。這些結(jié)果表明，miR-7敲減的CD4+T細(xì)胞可顯著加重急性肝損傷模型小鼠的病理變化。更為重要的是，我們發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)輸組在miR-7KD之后CD4+T細(xì)胞活化相關(guān)分子CD62L的表達(dá)水平明顯降低，其細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá)水平明顯增高，IL-4的表達(dá)水平則明顯下降。與之一致的是，我們?cè)谇捌谙嗬^發(fā)現(xiàn)miR-7在活化的CD4+T細(xì)胞中明顯高表達(dá)[7]；并且，當(dāng)miR-7基因敲減后，小鼠脾細(xì)胞體外活化能力明顯增強(qiáng)，同時(shí)伴隨了CD4+T細(xì)胞比例及細(xì)胞因子分泌能力的改變。這些研究結(jié)果提示，miR-7可能是通過(guò)對(duì)CD4+T細(xì)胞活化和功能的調(diào)控，進(jìn)而參與急性肝損傷的發(fā)生過(guò)程。然而，miR-7調(diào)控CD4+T細(xì)胞活化功能的確切效應(yīng)和機(jī)制仍有待后續(xù)研究闡明。

總之，本研究中我們首次發(fā)現(xiàn)過(guò)繼轉(zhuǎn)輸miR-7敲減CD4+T細(xì)胞可加重急性肝損傷模型小鼠肝損傷，同時(shí)CD4+T細(xì)胞活化功能增強(qiáng)，為后續(xù)深入研究急性肝損傷發(fā)生機(jī)制和臨床診斷治療新靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)提供了重要前期實(shí)驗(yàn)依據(jù)。