黃芩水提物對腦缺血再灌注性腦損傷大鼠腦保護(hù)作用的機(jī)制研究

王志江 王瑜

山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校

黃芩為傳統(tǒng)大宗常用中藥材，味苦，性寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎的功效。研究表明，黃芩中主要活性成分黃芩苷對短暫性的和永久性的腦缺血再灌注性腦損傷都具有保護(hù)作用[1]。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠大腦中動脈腦缺血再灌注損傷模型，研究黃芩水提物對腦缺血再灌注后大鼠腦組織中一氧化氮合酶（NOS）、超氧化物歧化酶（SOD）活性及一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）含量的影響，探討可能的作用機(jī)制。

一、材料與方法

（一）藥物與試劑

NOS、SOD、NO、MDA測定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。其它試劑為分析純。

黃芩水提液制備采用本課題組建立的方法[2]，最終黃芩提取液濃縮至每1ml相當(dāng)于黃芩藥材1.0g，過0.22μ.濾膜后貯存。

（二）動物分組與給藥

成年雄性SD大鼠60只，體重220～240g，購自山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分成6組：正常對照組、假手術(shù)組、模型組、黃芩水提物低、中、高劑量組，每組10只。藥物組實(shí)驗(yàn)動物于缺血前0.5h和再灌注后12 h兩次腹腔注射黃芩提取液，以生藥/體重計(jì)算給藥量為低劑量組0.5g/kg，中劑量組1.0g/kg，高劑量組1.5g/kg；正常對照組、假手術(shù)組和模型組分別注射等量生理鹽水。

（三）腦缺血再灌注損傷模型建立

采用改良Longa線栓法復(fù)制大鼠大腦中動脈腦缺血再灌注損傷模型。

（四）生化指標(biāo)的測定

再灌注24h后，迅速將大鼠斷頭處死，取腦，制備10%腦組織勻漿，3500r/min離心10min，棄沉淀，取上清液貯存?zhèn)溆谩０丛噭┖蟹椒?，檢測NOS、SOD活性及NO、MDA含量。

（五）統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以SPSS17.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)算結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

各組大鼠NOS、SOD、NO、MDA檢測結(jié)果見表1。

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織SOD活性顯著下降，NOS活性和MDA、NO含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，黃芩提取物中、高劑量組SOD活性均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；NOS活性和MDA、NO含量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，黃芩提取物低劑量組SOD活性有升高趨勢，NOS活性和MDA、NO含量有下降趨勢，但差異不顯著。

表1 大鼠腦缺血再灌注后腦組織中相關(guān)生化指標(biāo)比較(±s)

表1 大鼠腦缺血再灌注后腦組織中相關(guān)生化指標(biāo)比較(±s)

注：與假手術(shù)組相比，＊P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05

組別 n NO (μmol/g） NOS(U/mg) SOD(U/mg) MDA(nmol/mg)正常對照組 10 33.15±1.53 119.31±10.45 34.04±1.67 4.24±0.22假手術(shù)組 10 34.08±2.32 120.66±14.02 33.88±2.05 4.09±0.17模型組 10 67.31±2.33＊ 190.25±12.27＊ 21.61±1.23＊ 10.05±0.31＊黃芩提取物低劑量組 10 62.10±2.07 180.10±11.16 22.09±1.37 8.78±0.09黃芩提取物中劑量組 10 53.01±1.96# 154.45±13.34# 24.40±1.36# 7.19±0.15#黃芩提取物高劑量組 10 47.68±2.20# 137.99±14.41# 27.11±1.01# 6.41±0.13#

三、討論

缺血性腦損傷有兩個重要生理表現(xiàn)，一個是腦局部血流供應(yīng)障礙導(dǎo)致腦缺血、缺氧的損傷，另一個是缺血后再灌注損傷。其病理生理機(jī)制復(fù)雜，其中重要的一個方面是氧化自由基損傷，即腦損傷過程中產(chǎn)生的大量超氧陰離子自由基及羥自由基。通過檢測腦組織中SOD和MDA的活力可以間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力及機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織SOD活性顯著下降，MDA含量顯著升高。模型組比較，黃芩提取物中、高劑量組大鼠腦組織SOD活性均顯著升高；MDA含量顯著下降。這表明腦缺血再灌注后大鼠腦組織中氧化產(chǎn)物顯著增加，自由基清除酶活性顯著下降，抗氧化能力降低。黃芩水提物可減少自由基產(chǎn)生，提升自由基清除酶活性，顯示良好的抗氧自由基氧化損傷進(jìn)而保護(hù)腦組織的作用。

NO是生物體內(nèi)的一種信使分子和效應(yīng)分子。研究表明，在缺血再灌注性腦損傷中，NO具有腦損傷和腦保護(hù)的雙重作用。在病程早期，少量NO具有神經(jīng)保護(hù)作用，后期隨著NO大量產(chǎn)生則具有神經(jīng)毒性作用。在體內(nèi)，NOS催化L-精氨酸氧化產(chǎn)生NO。NOS是合成NO的關(guān)鍵酶。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織NOS活性和NO含量顯著升高。與模型組比較，黃芩提取物中、高劑量組大鼠腦組織NOS活性和NO含量顯著下降。這表明在腦缺血再灌注損傷時，大鼠腦組織中NOS活性增強(qiáng)，產(chǎn)生的大量NO通過干擾細(xì)胞正常代謝等途徑產(chǎn)生神經(jīng)毒性，加劇腦損傷。黃芩水提物可減弱NOS活性，減少NO生成，進(jìn)而降低NO神經(jīng)毒性實(shí)現(xiàn)腦保護(hù)作用。同時，NO也是炎癥反應(yīng)中產(chǎn)生的重要物質(zhì)。研究表明，黃芩提取物同時具有抗炎作用[3]，因此黃芩提取物對腦缺血再灌注腦損傷的保護(hù)作用，也可能通過減輕炎癥反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。

黃芩水提物中主要為黃酮類成分，如黃芩苷、黃芩素等。黃芩苷也曾被報道對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，降低腦內(nèi) NO、NOS和 MDA的含量， 增加 SOD含量[4]。但與腦缺血再灌注性腦損傷的保護(hù)作用有關(guān)的確切成分，還有待通過譜效關(guān)系分析等手段進(jìn)一步研究。