生熟大黃藥對(duì)對(duì)順鉑所致腎損傷小鼠的影響

琚皇進(jìn)，楊 柱，唐東昕，羅 莉，龍奉璽，王鏡輝，郭 斌

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550002；3.德江縣民族中醫(yī)院，貴州 銅仁 565200)

順鉑(DDP)作為惡性腫瘤臨床常用的化療藥物，由于具有嚴(yán)重的腎毒性，使得臨床研究一度停滯。目前大多數(shù)腫瘤的治療首選藥物仍為順鉑，如膀胱癌、卵巢癌等[1]。我國(guó)由于順鉑導(dǎo)致的肝腎毒性、骨髓移植、神經(jīng)毒性、胃腸道反應(yīng)等，同樣困擾著廣大臨床醫(yī)生和患者。由于順鉑嚴(yán)重的腎毒性導(dǎo)致患者生活質(zhì)量嚴(yán)重下降，迫使一些患者中斷化療而導(dǎo)致病情進(jìn)一步惡化。順鉑在腎臟中的代謝特點(diǎn)具有高聚集性，故其劑量越高腎臟毒性越強(qiáng)，迫使臨床使用不得不嚴(yán)格控制劑量，但劑量的控制又使得療效得不到提高，嚴(yán)重影響臨床療效。

生熟大黃藥對(duì)為國(guó)醫(yī)大師劉尚義教授臨床針對(duì)腎損傷的常用藥對(duì)，在前期的臨床研究中發(fā)現(xiàn)生熟大黃對(duì)鉑類(lèi)藥物所致腎損傷的病人具有一定的改善作用。因此本研究希望通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明生熟大黃具有改善順鉑所致腎損傷的作用，初步了解其作用機(jī)制，并為臨床運(yùn)用提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

采用6～8周齡雄性清潔級(jí)BALB/c近交系小鼠40只，體質(zhì)量(18±2)g，由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(湘)2018-014。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為生熟大黃高、中、低劑量組及模型對(duì)照組、空白對(duì)照組，每組8只。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥

生熟大黃水煎液：由生大黃6 g、熟大黃6 g組成。由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科安全用藥規(guī)定(折合成小鼠劑量)熬制成60 mg生藥/mL、120 mg生藥/mL及240 mg生藥/mL 3種濃度的藥汁，100 mL真空包裝，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩ｍ樸K由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院西藥房提供，規(guī)格為10 mg/瓶，齊魯制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20073652，批號(hào)：AA1A8036A。

1.3 模型制備及給藥

分別給模型對(duì)照組，生熟大黃高、中、低劑量組，每組每只小鼠以順鉑4 mg/kg單次腹腔注射制作腎損傷模型[2]，空白對(duì)照組不予處理，給藥5天(前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)順鉑給藥5天后小鼠出現(xiàn)尿素、肌酐及胱抑素C的升高，且腎小管多灶狀萎縮伴部分腎小管代償肥大，提示腎損傷模型造模成功)。生熟大黃高、中、低劑量組分別給予240 mg/mL、120 mg/mL及60 mg/mL濃度的生熟大黃水煎液灌胃，模型對(duì)照組給予0.13 mL/10 g/d蒸餾水灌胃；空白組不作任何處理；隔日稱(chēng)體重1次，并根據(jù)體重變化調(diào)整灌胃劑量[2]。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 小鼠血清BUN、SCR、胱抑素C的含量 生熟大黃水煎液灌胃2周后，禁食24 h后稱(chēng)體重，摘眼球法取血[2]，用離心管迅速接血，常溫靜置1 h后，離心，ELISA檢測(cè)小鼠血清尿素氮、肌酐及胱抑素C的含量。

1.4.2 小鼠腎臟系數(shù)及腎臟病理切片 取出雙側(cè)腎臟稱(chēng)重并計(jì)算腎臟系數(shù)；將其中一側(cè)腎固定于4%多聚甲醛中[2]，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片及HE染色，染色成功后于400倍光學(xué)顯微鏡下觀察腎小管上皮細(xì)胞、集合管上皮細(xì)胞及周?chē)仔约?xì)胞浸潤(rùn)情況和形態(tài)變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.1 各組小鼠腎臟系數(shù)比較

模型對(duì)照組腎臟系數(shù)顯著上升，與空白對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；生熟大黃各劑量組與模型對(duì)照組比較腎臟系數(shù)均降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而各生熟大黃干預(yù)組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組小鼠腎臟系數(shù)比較

2.2 各組小鼠血清尿素氮、肌酐、血清胱抑素C含量變化

模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，其BUN、SCR和胱抑素C均明顯升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；生熟大黃各劑量組與空白對(duì)照組比較，其BUN、SCR和胱抑素C均有不同程度升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，生熟大黃各劑量組與模型對(duì)照組比較，其BUN、SCR和胱抑素C均有不同程度下降，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組小鼠血清尿素氮、肌酐、血清胱抑素C比較

2.3 各組小鼠腎臟HE染色病理切片情況

空白組：腎組織結(jié)構(gòu)正常，腎小管形態(tài)正常，且各結(jié)構(gòu)間界限清晰。模型對(duì)照組：腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大小不等的空泡伴上皮細(xì)胞脫落、壞死，基底膜不規(guī)則，見(jiàn)不均勻的皺縮及增厚現(xiàn)象，間質(zhì)中有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，小管內(nèi)可見(jiàn)蛋白管型。3組生熟大黃治療組：腎小管上皮細(xì)胞空泡減少，基底膜增厚及皺縮情況得以改善，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 腎組織病理特征(HE，×400)

3 討論

順鉑引起腎損傷，其主要表現(xiàn)為血中尿素氮、肌酐升高以及尿中出現(xiàn)透明管型等現(xiàn)象。順鉑所致腎損傷其作用靶位主要在腎小管，對(duì)近曲小管和集合小管的損傷尤為突出，其在病理表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞急性變性、壞死，間質(zhì)水腫，小管擴(kuò)張等。順鉑的腎損傷早期一般都是可逆的，但隨著藥物劑量的蓄積，亦可導(dǎo)致腎臟不可逆性損傷，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致患者腎衰竭或者死亡。

隨著中醫(yī)藥的不斷發(fā)展，現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)者對(duì)中藥干預(yù)順鉑所致腎損傷的研究方面取得重大進(jìn)展，中醫(yī)藥在腫瘤患者化療中的增效減毒功效日益顯著。如有些中醫(yī)學(xué)者根據(jù)中醫(yī)理論：腎為先天之本，脾為后天之本，以“滲水利濕，溫陽(yáng)化氣”為法則選用排毒利尿的五苓散治療順鉑所致的腎損傷取得了一定療效[3]。有學(xué)者以“清熱滋陰”為法，選用加味黃連阿膠湯干預(yù)順鉑所致的腎損傷，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)其療效[4]。另有學(xué)者采用益腎排毒之法進(jìn)行干預(yù)，同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)證明其療效[5]。還有大量的中醫(yī)運(yùn)用于此，諸如健脾養(yǎng)正消癥[6]、益腎養(yǎng)肝[7]、補(bǔ)腎滋陰[8]等，均取得很好的臨床療效。除復(fù)方研究外，現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)者對(duì)單藥也做了諸多研究，如利用黃芪[9-13]的提取物進(jìn)行了大量的體外實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了其療效。除黃芪以外，靈芝[14]、冬蟲(chóng)夏草[15-16]等對(duì)順鉑所致腎損傷的保護(hù)作用也都得到證實(shí)。

現(xiàn)代中醫(yī)將“化療藥-順鉑”歸屬于“外邪”，外來(lái)之“藥毒”“邪毒”，雖治療惡性腫瘤，但加重了熱毒內(nèi)蘊(yùn)的癥狀，從而導(dǎo)致瘀毒互結(jié)?！扒鍩峤舛净觥蹦水?dāng)務(wù)之急，選用生熟大黃水煎液清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀。且現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)生熟大黃水煎液有效成分的藥理作用研究主要集中在蒽醌類(lèi)化合物，包括大黃酸、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚等[17]，其對(duì)胃腸道、肝腎及心肌均具有保護(hù)作用，同時(shí)具有改善循環(huán)、抗腫瘤等作用。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生熟大黃水煎液能降低小鼠腎臟系數(shù)及小鼠體內(nèi)血尿素氮、血肌酐及胱抑素C的含量，同時(shí)改善小鼠腎小管損傷，提示生熟大黃水煎液對(duì)小鼠順鉑所致的腎損傷具有一定的改善作用，但其具體分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。