蛋白質(zhì)酶解物預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化研究進(jìn)展

劉慧，李博

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京，100083)

據(jù)2017年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，全球每年有1770萬人死于心血管疾病，約占全球死亡總數(shù)的31.5%[1]，《中國(guó)心血管病報(bào)告2018》指出，我國(guó)心血管病患病率處于持續(xù)上升階段，占城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位，推算心血管疾病患病人數(shù)約2.9億，其中冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病1 100萬[2]。動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種慢性血管炎癥疾病，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的多因素、多細(xì)胞參與的過程，涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、單核細(xì)胞浸潤(rùn)、血管炎癥、泡沫細(xì)胞形成、血管平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cell，SMC)增殖和遷移及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成[3]。AS是引起血栓、周圍血管疾病、冠心病、中風(fēng)、腦梗死等心血管疾病的主要原因[4]，因而在AS階段的預(yù)防干預(yù)顯得尤為重要。目前，阿司匹林和他汀類藥物等被視作預(yù)防AS的有效方法。但是已有臨床報(bào)告顯示，對(duì)于尚未出現(xiàn)心血管疾病的人來說，長(zhǎng)期服用上述藥物對(duì)疾病的抑制作用不足以抵消其帶來的副作用，如大出血、肌痛等[5-6]。因此，亟需更安全有效、可長(zhǎng)期服用的天然功能活性物質(zhì)應(yīng)用于AS的一級(jí)或二級(jí)預(yù)防。本文就近年來發(fā)現(xiàn)的多種天然蛋白質(zhì)酶解物預(yù)防AS的體內(nèi)外研究進(jìn)行綜述，并提出了現(xiàn)有研究中仍待解決的問題，以期為蛋白質(zhì)酶解物的進(jìn)一步研究及其作為膳食補(bǔ)充劑促進(jìn)健康、減少心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)提供有益借鑒。

1 AS的發(fā)病機(jī)制

AS是一種慢性血管炎癥疾病，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、單核巨噬細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞、SMC增殖和遷移、脂質(zhì)斑塊破裂等一系列生理過程[3]。到目前為止，AS的發(fā)病機(jī)制仍未完全清楚，涉及多種危險(xiǎn)因素，存在多種病理學(xué)說，其中常見的學(xué)說有脂質(zhì)代謝紊亂學(xué)說、氧化損傷學(xué)說、內(nèi)皮損傷學(xué)說、炎癥反應(yīng)學(xué)說、血栓形成學(xué)說等。高脂血癥是AS的重要危險(xiǎn)因素，總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)和低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)濃度過高會(huì)使血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，血管內(nèi)膜下聚集沉淀脂質(zhì)，是導(dǎo)致AS的主要誘因之一。而活性氧(reacti e oxygen species，ROS)的異常增加導(dǎo)致氧化型低密度脂蛋白(oxidized LDL，ox-LDL)的產(chǎn)生，ox-LDL也會(huì)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷并誘發(fā)巨噬細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，同時(shí)經(jīng)清道夫受體不斷進(jìn)入巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致泡沫細(xì)胞形成；促進(jìn)血管SMC不斷增殖并向外遷移，在血管內(nèi)壁形成斑塊[7]?？梢钥闯?，內(nèi)皮功能受損也是AS發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。內(nèi)皮損傷學(xué)說認(rèn)為多種有害刺激引起內(nèi)皮損傷，使之分泌趨化因子，如血管細(xì)胞黏附分子-1( ascular cell adhesion molecule-1， CAM-1)、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)等，并吸引單核細(xì)胞黏附于內(nèi)皮[8]。單核細(xì)胞遷入內(nèi)皮下間隙，隨后分化為巨噬細(xì)胞，攝取脂質(zhì)，形成脂質(zhì)條紋。同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡與脫落促使血液中血小板大量黏附與聚集[9]。功能紊亂的內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和血小板分泌產(chǎn)生大量生長(zhǎng)因子和多種血管活性物質(zhì)，刺激中膜SMC不斷增生并進(jìn)入內(nèi)膜，使血管損傷處血管壁增厚。這種損傷應(yīng)答本身也是一種炎癥反應(yīng)，近年來炎癥反應(yīng)學(xué)說被越來越多的學(xué)者重視和認(rèn)同，炎癥反應(yīng)貫穿AS的起始、發(fā)展以至動(dòng)脈斑塊的破裂，是多種AS致病機(jī)制的共同環(huán)節(jié)或通路。內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、SMC等均會(huì)產(chǎn)生炎癥因子，如白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，這些炎癥因子又會(huì)進(jìn)一步刺激細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)、蛋白酶的釋放以及T細(xì)胞的活化增殖，加快AS的病變進(jìn)展[8-9]。SMC還產(chǎn)生間質(zhì)膠原和彈性蛋白等，并形成覆蓋斑塊的纖維帽。纖維帽使脂質(zhì)池穩(wěn)定，但由于一系列蛋白酶的活性表達(dá)及炎癥因子的作用，如基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)的釋放，細(xì)胞外基質(zhì)過度降解，導(dǎo)致斑塊破裂[8]，增加發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化血栓的風(fēng)險(xiǎn)。

根據(jù)AS的不同病理學(xué)說，研究者分別從降膽固醇、抗氧化、防止內(nèi)皮細(xì)胞損傷、抗炎以及抑制SMC增殖遷移等方面研發(fā)延緩AS的膳食補(bǔ)充劑。近年來，科研人員從蛋白質(zhì)酶解物中分離、鑒定了抗氧化肽、抗炎肽、降膽固醇肽、抗血小板肽等多種活性肽，這些活性肽均能在AS的不同進(jìn)展階段起到抑制效果[10]，因此與其他食源性成分相比，蛋白質(zhì)酶解物在預(yù)防AS方面可能具有更大的優(yōu)勢(shì)。許多研究者基于細(xì)胞和動(dòng)物模型，進(jìn)行了蛋白質(zhì)酶解物預(yù)防AS的研究,研究方向如圖1所示。

2 基于不同細(xì)胞模型的研究

2.1 抗氧化及抑制泡沫細(xì)胞形成

在AS的初發(fā)階段，ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激是AS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵影響因素，涉及LDL氧化對(duì)巨噬細(xì)胞的一系列病變及血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷。ox-LDL不受控制的被巨噬細(xì)胞攝取，過量的膽固醇酯化和膽固醇外排減少導(dǎo)致胞內(nèi)膽固醇酯(cholesteryl ester，CE)積累隨后引發(fā)泡沫細(xì)胞的形成[7]，這也是早期AS病變的主要標(biāo)志。因此，研究常用ox-LDL誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞源泡沫細(xì)胞評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)酶解物調(diào)節(jié)細(xì)胞膽固醇代謝、抑制泡沫細(xì)胞形成的功效[7,11]，還通過檢測(cè)巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中氧化應(yīng)激相關(guān)生物標(biāo)志物的表達(dá)，如ROS、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)等，來判斷蛋白質(zhì)酶解的抗氧化作用。

圖1 蛋白質(zhì)酶解物預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化研究方向圖Fig.1 The research direction of protein hydrolysate to pre ent atherosclerosis

研究除以油紅O染色觀察巨噬細(xì)胞泡沫化形態(tài)學(xué)變化外，還以CE/TC>50%定量判斷細(xì)胞泡沫化。劉東澤[11]以80 μg/mL ox-LDL誘導(dǎo)了泡沫細(xì)胞(胞內(nèi)CE/TC為62.12%)，通過胰蛋白酶和胃蛋白酶酶解制備水蛭酶解物，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)給藥濃度為150 μg/mL時(shí)，胞內(nèi)CE/TC降至42.86%，并表現(xiàn)出劑量依賴性，由此可知水蛭酶解物具有抑制泡沫細(xì)胞形成的作用，但其在藥效強(qiáng)度方面不如陽性對(duì)照辛伐他汀(胞內(nèi)CE/TC降至29.63%)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，水蛭酶解物正向反饋調(diào)節(jié)胞內(nèi)膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶A1(cholesterol acyltransferase A1，ACAT1)上調(diào)，其抑制泡沫細(xì)胞形成的機(jī)制是依賴于自噬過程，與促進(jìn)膽固醇外排作用無關(guān)。同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)水蛭酶解物可以減弱ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞核內(nèi)DNA氧化斷裂，具有一定的抗氧化作用[11]。類似的，中國(guó)林蛙皮膚抗菌肽F DLKKIANIINSIFGK及其衍生肽F KLKKIANIINSIFKK、F KLKKILNIINSIFKK也被證實(shí)可以降低100 μg/mL ox-LDL誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞中TC、CE含量，作用機(jī)制是通過抑制巨噬細(xì)胞攝入膽固醇的主要受體CD36，從而抑制巨噬細(xì)胞的泡沫化，也與促進(jìn)膽固醇外排作用無關(guān)[7]。

不同蛋白質(zhì)酶解物之間的抗氧化或抑制泡沫細(xì)胞形成作用存在差異。如霍艷姣[12]建立了巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)LDL氧化模型，發(fā)現(xiàn)不同電荷性質(zhì)的酪蛋白抗氧化肽組分均可減少細(xì)胞中MDA的生成量，抑制LDL氧化，但堿性組分比酸性組分表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制效果。巨噬細(xì)胞從開始吞噬脂質(zhì)到形成泡沫細(xì)胞之前，通常認(rèn)為是荷脂細(xì)胞，酪蛋白抗氧化肽組分還能顯著減少ox-LDL誘導(dǎo)的荷脂細(xì)胞內(nèi)TC、TG、游離膽固醇(free cholesterol，F(xiàn)C)含量，并且隨著正電荷的增加，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制泡沫細(xì)胞形成作用[12]。還有研究表明，多肽的抗氧化活性取決于其分子量，1～3 kDa的多肽具有最高的抗氧化活性[13-14]；同時(shí)，不同蛋白水解酶的酶解作用會(huì)導(dǎo)致不同肽序列的形成，影響蛋白質(zhì)酶解物的抗氧化活性[15]。

另外，據(jù)報(bào)道，內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)在保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮重要作用，血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)的上調(diào)就是其中一種內(nèi)在防御機(jī)制，目前此類研究也較少。多肽Lunasin是一種大豆來源的含43個(gè)氨基酸的肽，GU等[16]首次發(fā)現(xiàn)Lunasin可通過激活PI3K/Akt/Nrf2/ARE途徑來刺激HO-1的表達(dá)，從而減少H2O2誘導(dǎo)的EA.hy 926內(nèi)皮細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生，減輕內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷。

2.2 防止內(nèi)皮細(xì)胞損傷

內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能障礙是AS病變過程中的一個(gè)重要特征，主要特征表現(xiàn)為NO釋放量和生物利用度降低，黏附因子和趨化因子的表達(dá)增加等[17]。目前，內(nèi)皮損傷模型的細(xì)胞常用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical ein endothelial cells,HU ECs)及其細(xì)胞株EA.hy926[17-19]，也有研究直接提取培養(yǎng)了SD大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞[20]。在內(nèi)皮細(xì)胞中TNF-α?xí)せ頝F-αB信號(hào)通路，引起NO表達(dá)量減少， CAM-1和ICAM-1的表達(dá)量增加[21]，因此，常以TNF-α為誘導(dǎo)因子，建立內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型。趙欣[17]通過胰蛋白酶酶解制備了水蛭酶解物，發(fā)現(xiàn)其在200 μg/mL時(shí)對(duì)10 ng/mL TNF-α誘導(dǎo)的EA.hy926具有保護(hù)作用，作用機(jī)制為通過抑制NF-κB信號(hào)通路，使細(xì)胞中內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS) mRNA表達(dá)上調(diào)，ICAM-1、MCP-1的蛋白和mRNA的表達(dá)下降。WANG等[22]也發(fā)現(xiàn)一種直接購買的水蛭酶解物可通過阻斷NF-κB亞基p65轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞中ICAM-1和MCP-1的表達(dá)。另外，由于單核細(xì)胞黏附內(nèi)皮細(xì)胞是必不可少的AS的發(fā)展過程，有研究利用THP-1和U 937兩個(gè)模型探究了蛋白質(zhì)酶解物對(duì)細(xì)胞間黏附的影響。LIANG等[18]發(fā)現(xiàn)玉米蛋白水解物可以抑制EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞中ICAM-1、 CAM-1的表達(dá)，并通過熒光染色法觀察到玉米蛋白水解物的添加顯著降低了U 937單核細(xì)胞對(duì)EA.hy926細(xì)胞的黏附力。類似的，水蛭酶解物也被證實(shí)可以抑制THP-1單核細(xì)胞對(duì)EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞遷移、黏附率[17,22]。

2.3 抗炎

巨噬細(xì)胞是最早侵入AS病變的炎性細(xì)胞，它們也是AS斑塊的主要成分。由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，如IL-6、TNF-α等，可進(jìn)一步推動(dòng)AS病變；同時(shí)，巨噬細(xì)胞還分泌抗炎細(xì)胞因子，如IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等，可促進(jìn)AS晚期斑塊的穩(wěn)定性[8]。巨噬細(xì)胞對(duì)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激具有高度的敏感性，LPS會(huì)誘導(dǎo)炎癥基因表達(dá)和釋放一些與AS發(fā)展相關(guān)的生物標(biāo)志物[23]，因此，研究常用LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥模型探究蛋白質(zhì)酶解物的抗炎效果。常用的巨噬細(xì)胞有THP-1、U 937、RAW 264.7[24]，其中RAW 264.7來源廣泛、性質(zhì)穩(wěn)定、貼壁易養(yǎng)，廣泛應(yīng)用于炎癥研究中。

目前，關(guān)于蛋白質(zhì)酶解物抗炎作用的研究相對(duì)較多，不同的蛋白質(zhì)酶解物，甚至同一種蛋白質(zhì)不同處理方式得到的酶解物，其功效也有差異。蛋白酶的種類、多肽氨基酸組成、分子量大小以及極性等均會(huì)影響酶解物的功效。CHENG等[25]用堿性蛋白酶和風(fēng)味酶分別酶解煮熟的金槍魚湯汁，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶酶解物的抗炎效果更佳。陳月華[26]利用胰蛋白酶水解大米蛋白，對(duì)抗炎活性最高的RPHs-C組分再進(jìn)一步通過離子交換色譜，對(duì)比發(fā)現(xiàn)獲得的5個(gè)組分抗炎活性均有差異。KIM等[27]獲得了分子量分別為<1 kDa、1～5 kDa和>5 kDa的貽貝水解物肽段，通過LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)它們的NO抑制活性分別為72.66%、70.12%和92.35%，且抑制效果均比未處理的貽貝水解物好。用>5 kDa的組分進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其可使炎性巨噬細(xì)胞中前列腺素E2、TNF-α、IL-1β及IL-6水平降低，誘導(dǎo)型-氧化氮合酶(induced NOS,iNOS)、環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)蛋白和mRNA的表達(dá)下調(diào)，從而發(fā)揮抗炎作用。Lunasin[28]和小麥谷蛋白水解物[29]也被證實(shí)可以降低這些炎癥因子的表達(dá)，具有類似的抗炎功效。

當(dāng)前，大多數(shù)研究?jī)H證實(shí)了蛋白質(zhì)酶解物可調(diào)節(jié)下游信號(hào)通路中蛋白的表達(dá)而達(dá)到抗炎效果，如通過抑制了IκBα的降解、p65的核移位進(jìn)而抑制NF-κB，有效地降低巨噬細(xì)胞炎癥過程；或通過抑制了JNK、ERK、p38 MAPK的磷酸化，降低IL-6等炎癥因子的水平而發(fā)揮了抗炎功效[27-31]。但完整分子機(jī)制的研究仍處于初步探索階段，僅有少數(shù)研究明確了蛋白質(zhì)酶解物的具體活性成分，合成了活性肽，并進(jìn)一步研究了活性肽抗炎的分子信號(hào)通路。JONES等[32]從苦瓜種子中分離出的一種純肽BG-4，與LPS單獨(dú)處理組相比，用BG-4和LPS聯(lián)合處理THP-1巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-6等促炎細(xì)胞因子減少，胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生減少，p65的核易位被抑制，ERK1/2 MAPK和STAT3磷酸化降低，表明BG-4是通過STAT3/MAPK/NF-κB信號(hào)通路而發(fā)揮抗炎作用及其分子調(diào)控機(jī)制。LIANG等[33]通過CO-IP及Pulldown實(shí)驗(yàn)證實(shí)水稻八肽KHNRGDEF在HU EC的作用靶點(diǎn)為TLR4，通過改變TLR4的結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)下游TRIF和IKKβ的蛋白水平降低p65的磷酸化，抑制NF-κB活化，從而影響caspase-3的釋放，抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)HU EC免受H2O2引起的氧化損傷和炎癥反應(yīng)。

2.4 抑制SMC增殖

SMC主要參與AS后期病變中，常通過人、兔主動(dòng)脈SMC模型評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)酶解物對(duì)SMC增殖遷移的影響，總體上關(guān)于此方面的研究較少。水蛭素是從中藥水蛭中提取的活性多肽，有研究表明，水蛭素可以抑制血管SMC增殖。李紅梅等[34]直接將水蛭素作用于體外培養(yǎng)的人冠狀動(dòng)脈SMC，通過MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況，發(fā)現(xiàn)6.25 mg/mL水蛭素對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生較明顯的抑制作用，抑制率達(dá)44.6%。增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet deri ed growth factor，PDGF)對(duì)SMC增殖的調(diào)控起關(guān)鍵作用，當(dāng)兩者表達(dá)被抑制時(shí)，能夠有效降低增生內(nèi)膜的厚度[35-36]，故常作為SMC增殖的生物標(biāo)志物。凝血酶可使SMC進(jìn)入增殖期的細(xì)胞數(shù)明顯增多，而水蛭素已被證實(shí)可以通過抑制PDGF和PCNA的表達(dá)而抑制凝血酶誘導(dǎo)的SMC增殖[19]。

2.5 蛋白質(zhì)酶解物的多重抑制作用

已有研究分離、純化并鑒定了蛋白質(zhì)酶解物中的部分活性肽序列，并證實(shí)了單一活性肽也具有多重生物活性(表1)。MONTOYA等[37]發(fā)現(xiàn)莧菜蛋白經(jīng)體外胃蛋白酶、胰酶模擬消化后的3條肽段均具有抗氧化、抗炎、抑制細(xì)胞間黏附反應(yīng)的多重功效。其中，肽HGSEPFGPR的IC50值最低，與凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體1(lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor 1，LOX-1)晶體結(jié)構(gòu)的相互作用更好，對(duì)相關(guān)生物標(biāo)志物的抑制效果也最好。但是3種多肽聯(lián)合應(yīng)用的效果并不優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用，這也提示了活性肽的生物活性優(yōu)于肽組分。類似的，50 μg/mL的GEQQQQPGM、50 μg/mL的YYGGEGSSSEQG、25 μg/mL的SESEM也被證實(shí)具有抑制細(xì)胞凋亡、抗氧化和保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的功效，從而表現(xiàn)出預(yù)防AS的潛力。它們的物質(zhì)的量濃度相似，這可能解釋了它們具有相似的活性[31,38]。

表1 活性肽基于細(xì)胞模型的多重抑制作用Table 1 Multiple inhibition of bioacti e peptides based on cell model

縱覽已有研究，大部分蛋白質(zhì)酶解物成分不明確、分子量較大，它們?cè)隗w內(nèi)具有不穩(wěn)定性或半衰期較短，生物利用率及能否以完整形式吸收仍然未知，是否在吸收過程經(jīng)肽酶等水解釋放了活性更高的物質(zhì)也待證實(shí)。針對(duì)已明確活性成分的蛋白質(zhì)酶解物，其活性肽在細(xì)胞中發(fā)揮作用的靶點(diǎn)和分子信號(hào)通路也需要深入研究。同時(shí)，具有降膽固醇、抗氧化、防止內(nèi)皮細(xì)胞損傷、抗炎或抑制SMC增殖作用的蛋白質(zhì)酶解物，表現(xiàn)出了預(yù)防AS的潛力，但其對(duì)AS的有效抑制作用仍需要進(jìn)一步的體內(nèi)研究來闡明。

3 基于動(dòng)物模型的功效評(píng)價(jià)

除臨床試驗(yàn)外，動(dòng)物模型是用來評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)酶解物體內(nèi)功效最直觀的手段。已有許多研究在前期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過動(dòng)物模型評(píng)價(jià)驗(yàn)證了蛋白質(zhì)酶解物表現(xiàn)出的預(yù)防AS的能力。如WANG等[22]發(fā)現(xiàn)購得的水蛭酶解物在體外具有保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的生物活性，也可以減少ApoE-/-小鼠的AS斑塊，綜合細(xì)胞和動(dòng)物模型，驗(yàn)證了該水蛭酶解物具有抑制AS的功效。TANG等[40]前期研究發(fā)現(xiàn)膠原酶型蛋白酶消化豬皮膚I型膠原得到的膠原三肽(collagen tripeptide,Ctp)片段通過下調(diào)PCNA表達(dá),抑制了體外培養(yǎng)的人主動(dòng)脈SMCs的增殖和遷移，且減少Ctp組AS病變中HHF35陽性SMCs的數(shù)量，可能對(duì)AS具有調(diào)節(jié)作用。進(jìn)一步驗(yàn)證表明，Ctp可顯著降低高膽固醇血癥家兔的主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積和血清TC水平，進(jìn)而抑制炎癥過程，包括抑制巨噬細(xì)胞和SMCs的增殖，減少ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，可穩(wěn)定AS斑塊[41]。Lunasin也被證實(shí)在高脂飼料喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠中可以有效保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化損傷，抑制AS斑塊的發(fā)展[16]。可以看出，蛋白質(zhì)酶解物在動(dòng)物體內(nèi)的功效更傾向于對(duì)AS的多重抑制作用，而不僅局限于其在細(xì)胞模型中表現(xiàn)出的單一抑制作用。

動(dòng)物模型的功效評(píng)價(jià)指標(biāo)主要包括模型的疾病表型及生物標(biāo)志物變化。動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)(atherogenic index，AI)由總膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇(high density liptein cholesterol, HDL-C)計(jì)算得來，AI=[(TC-HDL-C)/HDL-C]是國(guó)際公認(rèn)的動(dòng)脈粥樣硬化指標(biāo)，它的正常數(shù)值<4，數(shù)值越小動(dòng)脈硬化的程度就越輕，引發(fā)心腦血管病的危險(xiǎn)性就越低；如果AI≥4就說明已經(jīng)發(fā)生了動(dòng)脈硬化，數(shù)值越大動(dòng)脈硬化的程度就越重，發(fā)生心腦血管病的危險(xiǎn)性就越高[42]。許多研究通過動(dòng)物模型的AI值來判斷模型是否產(chǎn)生AS病變及蛋白質(zhì)酶解物在體內(nèi)的抗AS作用效果，作為AS早期預(yù)防的參考。另外，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主動(dòng)脈內(nèi)出現(xiàn)明顯的斑塊也可作為判斷AS建模成功的重要病理表型，通過蛋白質(zhì)酶解物作用前后斑塊面積大小的改變來初步評(píng)價(jià)其作用效果。由于AS復(fù)雜、多因素的形成過程，脂質(zhì)積累、細(xì)胞間黏附、炎癥、氧化應(yīng)激、血管內(nèi)皮保護(hù)等因素也形成了一系列生物標(biāo)志物，如TC、 CAM-1、IL-6、MDA、iNOS等，對(duì)蛋白質(zhì)酶解物預(yù)防AS功效評(píng)價(jià)，即通過生物標(biāo)志物的上調(diào)或下調(diào)來判斷其是否具有良好效果，這也與基于細(xì)胞模型的研究相符。

近年來，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇方面，SD大鼠、Wistar大鼠及C57BL/6 ApoE-/-小鼠最為常用。隨著AS發(fā)病機(jī)制的深入研究，AS動(dòng)物模型的構(gòu)建也已從單純高脂飼料喂養(yǎng)法發(fā)展為混合飼料喂養(yǎng)法、炎癥免疫法、內(nèi)皮損傷法、血液流變學(xué)法及基因工程法等多種造模方法。高脂飼料喂養(yǎng)法及基因工程法具備造模時(shí)間短、造模簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，成為建立高效、簡(jiǎn)便、理想的AS動(dòng)物模型常用方法[43]。

3.1 基于高脂飼料喂養(yǎng)法建立的AS動(dòng)物模型

脂質(zhì)沉積是AS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，高脂狀態(tài)的建立是復(fù)制AS模型的基礎(chǔ)。表2匯總了近年來多種蛋白質(zhì)酶解物在高脂飼料法建立的AS動(dòng)物模型體內(nèi)的預(yù)防AS功效的研究。其中，燕麥多肽展示出較優(yōu)的抑制AS功效[44]。還有研究通過設(shè)置陽性藥物對(duì)照組，發(fā)現(xiàn)了效果與一定劑量藥物相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)酶解物。如龔吉軍等[42]發(fā)現(xiàn)油茶粕多肽高劑量組(1 000 mg/kg BW)和降脂藥物組(辛伐他汀片0.30 mg/kg BW)的AI值沒有顯著差異；WANG等[22]發(fā)現(xiàn)高劑量水蛭酶解物[0.5 g/(kg·g)]可以顯著減少9.29%的AS斑塊面積，這與陽性對(duì)照辛伐他汀組[10 mg/(kg·g)]減少11.6%的效果相近。但是在AS動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，目前關(guān)于蛋白質(zhì)酶解物與預(yù)防類藥物的功效多集中于降血脂藥物，未來仍需進(jìn)一步探究其與其他預(yù)防類藥物效果的異同，如抗血栓藥物阿司匹林等。同時(shí)，還需要根據(jù)蛋白質(zhì)酶解物在實(shí)際應(yīng)用時(shí)人體服用的劑量來合理優(yōu)化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的灌胃劑量。

另外，有研究證實(shí)了蛋白質(zhì)酶解物預(yù)防AS的功效可能優(yōu)于蛋白質(zhì)本身。如油茶粕蛋白也具有一定的降A(chǔ)I效果，雖然效果不如油茶粕多肽高劑量組，但與中劑量組相比沒有明顯差異[42]；類似的，TONG等發(fā)現(xiàn)水稻α-球蛋白經(jīng)消化吸收后的功能性肽片段功效優(yōu)于相同劑量的水稻α-球蛋白[31,45]。

表2 蛋白質(zhì)酶解物基于動(dòng)物模型(高脂飼料喂養(yǎng)法)的預(yù)防AS功效評(píng)價(jià)Table 2 E aluation of the efficacy of protein hydrolysates on pre ention of AS based on animal model(high fat feed method)

3.2 基于基因工程法建立的AS動(dòng)物模型

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成熟，有研究者[49]用基因改良的小鼠分別對(duì)炎癥、高血壓、蛋白酶、細(xì)胞外基質(zhì)、糖代謝及免疫系統(tǒng)等相關(guān)的基因進(jìn)行敲除或者過度表達(dá)，如以ApoE-/-小鼠、LDLR-/-小鼠、MCPI-1-/-小鼠作為動(dòng)物對(duì)象，結(jié)合高脂飲食加快建模。已有研究明確了蛋白質(zhì)酶解物中的活性成分，通過給予ApoE-/-小鼠合成的活性肽，探究了活性肽在體內(nèi)預(yù)防AS的功效(表3)。研究發(fā)現(xiàn)，活性肽也可以從抗炎、降血脂、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、抗氧化等多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮作用，從而抑制ApoE-/-小鼠的AS病變。雖然如前文所述，有研究顯示純肽的功效優(yōu)于蛋白質(zhì)酶解物組分，但是NAKAMURA等[50]分別灌胃給予ApoE-/-小鼠含有 PP和IPP的發(fā)酵乳、含有 PP和IPP的酪蛋白水解產(chǎn)物、合成的 PP和IPP，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4組小鼠主動(dòng)脈斑塊面積的減少程度相差不大，而低劑量的合成的 PP、IPP組甚至與空白對(duì)照組相比無顯著性差異[50]。這可能是由于發(fā)酵乳和酪蛋白水解物中含有多種多肽和氨基酸，包括了其他未知活性成分。另外，考慮到合成的活性肽是非天然產(chǎn)物，需以藥物的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行全面的安全評(píng)價(jià)，在實(shí)際應(yīng)用中仍提倡以蛋白質(zhì)酶解物作為膳食補(bǔ)充劑。

表3 純肽基于動(dòng)物模型(基因工程法)的預(yù)防AS功效評(píng)價(jià)Table 3 E aluation of the efficacy of pure peptide on pre ention of AS based on animal model(genetic engineering method)

值得注意的是，由于不同的AS模型具有不同的生物學(xué)特性，應(yīng)根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及造模方法。如TONG等[45]發(fā)現(xiàn)水稻α-球蛋白(100 mg/kg BW)可促進(jìn)高膽固醇飲食喂養(yǎng)的SD大鼠糞便中中性固醇的排泄，表明水稻α-球蛋白通過抑制膽固醇在腸道中的吸收來降低大鼠的血清膽固醇濃度。然而，以同樣劑量灌胃雄性ApoE-/-小鼠時(shí)，水稻α-球蛋白雖然顯著減少了AS斑塊區(qū)域，但不能顯著降低血液膽固醇濃度，推測(cè)ApoE參與了水稻α-球蛋白的降膽固醇過程。因此，TONG等[31]在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)水稻α-球蛋白抑制ApoE-/-小鼠AS病變是通過抗氧化、抗炎途徑，并非是調(diào)節(jié)了膽固醇代謝。

綜上，由蛋白質(zhì)酶解物基于動(dòng)物模型預(yù)防AS的功效評(píng)價(jià)可知，蛋白質(zhì)酶解物具有調(diào)節(jié)血清膽固醇濃度、改善氧化應(yīng)激、抑制促炎細(xì)胞因子的釋放和相關(guān)蛋白的表達(dá)、改善NO系統(tǒng)相關(guān)的內(nèi)皮功能障礙及調(diào)節(jié)免疫等多種功能，可作用于多靶點(diǎn)以發(fā)揮其復(fù)雜多效的預(yù)防AS作用,同時(shí)營(yíng)養(yǎng)、安全無毒副作用，有開發(fā)為預(yù)防AS的功能性食品的潛力。然而，蛋白質(zhì)酶解物在人體內(nèi)的穩(wěn)定性、生物利用度和功效等方面與細(xì)胞、動(dòng)物模型仍有較大差異，因此，在蛋白質(zhì)酶解物實(shí)際應(yīng)用之前，還需要進(jìn)行大量的臨床人體實(shí)驗(yàn)。

4 結(jié)語及展望

AS所致心腦血管疾病在人類死亡總數(shù)所占比例逐漸增大，其防治方法已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。目前，科學(xué)家已做了大量的研究工作，取得了一定成效，證實(shí)了蛋白質(zhì)酶解物抑制AS病變的有益作用，但仍存在一些問題亟需解決：

(1)目前的研究多集中于蛋白質(zhì)酶解物在降脂、抗炎、抗氧化、降血壓、降血糖等單一方向，而以AS動(dòng)物模型為基礎(chǔ)，探究蛋白質(zhì)酶解物多重預(yù)防作用的研究仍然較少。(2)雖然蛋白質(zhì)酶解物從細(xì)胞到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均表現(xiàn)出良好的預(yù)防AS潛力，并且涉及多個(gè)機(jī)制，可針對(duì)AS的不同病理環(huán)節(jié)同時(shí)發(fā)揮作用，但目前對(duì)活性肽準(zhǔn)確的作用靶點(diǎn)及可能具有的多靶向作用機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。(3)目前，關(guān)于活性肽在巨噬細(xì)胞等AS相關(guān)細(xì)胞中發(fā)揮作用的下游MAPK及NF-κB信號(hào)通路的研究較成熟，而其上游作用靶點(diǎn)及完整的信號(hào)傳導(dǎo)仍需深入探究。(4)隨著AS發(fā)病機(jī)制的深入研究，有關(guān)表觀遺傳修飾如DNA甲基化、組蛋白修飾以及mi RNA等可作為生物標(biāo)志物，以更加全面的評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)酶解物及活性肽是否具有抗AS功效，為AS的預(yù)防提供新的策略和靶點(diǎn)。(5)許多研究并未分離、純化并鑒定具有預(yù)防AS功效活性肽的氨基酸序列，且相關(guān)活性肽的結(jié)構(gòu)特征和構(gòu)效關(guān)系還有待深入研究，這些研究將為AS預(yù)防食品或輔助藥物的開發(fā)應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)。(6)目前，在具有預(yù)防AS功效的蛋白質(zhì)酶解物開發(fā)成商業(yè)產(chǎn)品前，還需較長(zhǎng)時(shí)間的臨床觀察和實(shí)驗(yàn)研究，以保證其安全有效性。同時(shí)，此類蛋白質(zhì)酶解物的市場(chǎng)需求及產(chǎn)業(yè)化研究也有待進(jìn)行，為其常態(tài)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。對(duì)蛋白質(zhì)酶解物的深入研究，將有益于蛋白質(zhì)酶解物類膳食補(bǔ)充劑應(yīng)用于AS的一級(jí)或二級(jí)預(yù)防中，促進(jìn)人類健康。