發(fā)酵過程中時空水平的動態(tài)調(diào)控策略研究進展

周勝虎，毛銀，鄧禹*

1(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫,214122) 2(江南大學(xué),江蘇省生物活性制品加工工程技術(shù)研究中心，江蘇 無錫,214122)

近年來，隨著合成生物技術(shù)、代謝工程和系統(tǒng)生物學(xué)的快速發(fā)展與交叉融合，微生物發(fā)酵合成高附加值化學(xué)品得到了長足的進步[1-2]。在此過程中，構(gòu)建高效的細(xì)胞工廠始終是研究的核心。細(xì)胞工廠的傳統(tǒng)改造策略主要包括：過表達途徑基因、敲除或抑制產(chǎn)物降解途徑和競爭性代謝途徑、蛋白質(zhì)工程改造限速酶和定向進化強化菌株生產(chǎn)性能等[3-4]。這些改造策略的核心思想是最大化的引導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)和能量流向產(chǎn)物合成方向，同時強化產(chǎn)物合成途徑的代謝通量。經(jīng)過上述改造策略已經(jīng)實現(xiàn)了多類重要化合物的高效合成，例如黃酮類化合物[5-6]、脂肪酸[7-8]、萜類化合物[9-11]、生物燃料[12-14]、聚合物單體化合物[15-16]等。然而，隨著底物消耗、副產(chǎn)物積累和產(chǎn)物合成，發(fā)酵過程中的環(huán)境始終處于不斷變化的過程中，這導(dǎo)致基因表達水平不能隨時與環(huán)境變化相適應(yīng)，因此僅僅通過簡單的靜態(tài)代謝工程改造難以使細(xì)胞適應(yīng)復(fù)雜多變的發(fā)酵環(huán)境[17]。此外，發(fā)酵系統(tǒng)中每個單細(xì)胞的生長狀態(tài)都不相同，通過統(tǒng)一調(diào)節(jié)發(fā)酵條件(pH、溫度和碳源等)或者添加誘導(dǎo)劑(異丙基-β-D-硫代半糖苷等)的方式改變基因表達水平并不能使每一個細(xì)胞都處于最佳的生長和生產(chǎn)狀態(tài)[18]。發(fā)酵系統(tǒng)中不同位置的細(xì)胞所處環(huán)境也不盡相同，這進一步增加了調(diào)控的難度。因此，發(fā)酵過程中環(huán)境變化具有瞬時的空間和時間特性。綜上，為實現(xiàn)目標(biāo)化合物的高效合成，急需建立一種可在時間和空間水平上針對特定細(xì)胞所處的生理生化環(huán)境進行精準(zhǔn)控制的調(diào)控手段。

為在發(fā)酵過程中實現(xiàn)時空水平的精準(zhǔn)調(diào)控，研究者們設(shè)計了大量的生物傳感器用于實時定量監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的變化，同時根據(jù)監(jiān)測信號實時動態(tài)的調(diào)控代謝網(wǎng)絡(luò)[19-20]。這些動態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)設(shè)計的一般思路是以可響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境變化的生物傳感器控制關(guān)鍵基因，傳感器根據(jù)檢測到的信號變化強化或抑制基因表達，從而達到代謝流量調(diào)控的目標(biāo)[17-21]。

本文根據(jù)發(fā)酵過程中代謝調(diào)控的時空尺度不同，將動態(tài)調(diào)控策略分為環(huán)境響應(yīng)型、胞內(nèi)產(chǎn)物響應(yīng)型和胞外產(chǎn)物響應(yīng)型(圖1)。

a-發(fā)酵環(huán)境響應(yīng)的動態(tài)調(diào)控策略；b-胞內(nèi)產(chǎn)物響應(yīng)的動態(tài)調(diào)控策略；c-胞外產(chǎn)物響應(yīng)的動態(tài)調(diào)控策略圖1 時空水平的動態(tài)調(diào)控響應(yīng)機制Fig.1 The mechanisms of dynamic regulation in spatiotemporal le el

環(huán)境響應(yīng)型動態(tài)調(diào)控針對整個發(fā)酵系統(tǒng)中所有細(xì)胞進行集體調(diào)控(圖1-a)；胞內(nèi)產(chǎn)物響應(yīng)型動態(tài)調(diào)控基于每個單細(xì)胞自身生理生化狀態(tài)而進行自我調(diào)控(圖1-b)；胞外產(chǎn)物響應(yīng)型動態(tài)調(diào)控的特點是代謝物可分泌出細(xì)胞并同時被其他單細(xì)胞攝取，這將會造成不同單細(xì)胞在空間尺度上的信號干擾(圖1-c)。

本文通過對比當(dāng)前國內(nèi)外的相關(guān)研究，深入分析不同動態(tài)調(diào)控策略的優(yōu)缺點，為更廣泛的代謝工程和發(fā)酵工程應(yīng)用提供理論參考。

1 發(fā)酵環(huán)境響應(yīng)的動態(tài)調(diào)控策略

1.1 溫度響應(yīng)的動態(tài)調(diào)控策略

溫度是發(fā)酵過程中的重要參數(shù)，不僅與能量消耗息息相關(guān)，同時也顯著影響著細(xì)胞生長、酶的催化活性和產(chǎn)物的穩(wěn)定性。因此，通過溫度來調(diào)控微生物生長與代謝是發(fā)酵過程控制的重要手段。對整個發(fā)酵體系進行加熱或冷卻會影響體系中所有細(xì)胞的代謝過程，這種動態(tài)調(diào)控策略忽略了微觀層面上每個單細(xì)胞的性能差異性，目標(biāo)是針對發(fā)酵體系中所有細(xì)胞集體的動態(tài)調(diào)控。目前，應(yīng)用最為廣泛的溫敏型生物傳感器包括CI857阻遏蛋白介導(dǎo)的高溫激活傳感器以及CI434-te S阻遏蛋白突變體(TFts)介導(dǎo)的低溫激活傳感器[22-23]。其中CI857在溫度高于37 ℃時失去活性而無法與結(jié)合位點結(jié)合，進而開啟目標(biāo)基因表達;當(dāng)溫度低于30 ℃時，CI857阻遏目標(biāo)基因表達。而TFts在溫度低于30 ℃時失去活性而無法與結(jié)合位點結(jié)合，進而開啟目標(biāo)基因表達;當(dāng)溫度高于37 ℃時，TFts阻遏目標(biāo)基因表達。基于這些調(diào)控機制，SUN等[24]構(gòu)建了一個乙醇生產(chǎn)菌株EscherichaicoliB0013-2021 HPA,該菌株的生長繁殖過程僅以木糖、半乳糖和阿拉伯糖為碳源，而乙醇合成過程僅以葡糖糖為碳源。在該工程菌株中，敲除了乙醇的競爭性代謝途徑基因(pta-ackA、ldhA和pflB)，同時突變了葡萄糖的攝取和氧化的必需基因(glk、ptsG和manZ)。在此基礎(chǔ)上以受CI857調(diào)控的啟動子pR/pL調(diào)控ptsG表達，從而達到葡萄糖消耗受溫度控制的目的。在低溫條件下大腸桿菌B0013-2021HPA利用木糖、半乳糖和阿拉伯糖生長，隨后溫度升高到37 ℃后開始利用葡萄糖合成乙醇。經(jīng)過12 h發(fā)酵，乙醇產(chǎn)量比無動態(tài)調(diào)控菌株提高1.4倍，達到4.06 g/(L·h)。與高溫激活的生物傳感器相比，低溫激活的生物傳感器鮮有報道和應(yīng)用。最近，ZHENG等[22]在低溫傳感器的設(shè)計和應(yīng)用上獲得了突破性進展。在這項研究工作中，作者首先通過定向進化獲得了受高溫激活的阻遏蛋白TFts、受低溫激活的蛋白酶TEts和MycoplasmaflorumLon蛋白酶(mf-Lon)。經(jīng)過巧妙組合，構(gòu)建了如圖2所示的動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)。在不同種大腸桿菌中,該系統(tǒng)均具有良好的功能，是目前已知低溫誘導(dǎo)生物傳感器中動態(tài)范圍最廣、本地表達最低和對信號響應(yīng)速度最快的傳感器。此外，應(yīng)用該傳感器控制ftsZ和mreB的表達可實現(xiàn)大腸桿菌形態(tài)的動態(tài)控制。

圖2 低溫誘導(dǎo)型生物傳感器工作機制Fig.2 The mechanisms of low temperature induced biosensor注:當(dāng)溫度低于30 ℃時TFts失去活性，無法阻遏TEts、TetR和目標(biāo)蛋白GOI的表達，此時TEts特異性的降解TFts蛋白從而進一步強化GOI的表達。當(dāng)溫度高于37 ℃時TFts阻遏TEts、TetR和目標(biāo)蛋白GOI的表達，因此mf-Lon得以表達并特異性降解滲漏表達的GOI蛋白。鈍箭頭代表抑制作用。

1.2 pH響應(yīng)的動態(tài)調(diào)控策略

綜上所述，無論是基于物理環(huán)境(如溫度)還是化學(xué)環(huán)境(如pH)的動態(tài)調(diào)控策略都屬于針對發(fā)酵系統(tǒng)全局的動態(tài)調(diào)控。這些策略更加關(guān)注環(huán)境因素在時間水平上的波動，而忽略了每個單細(xì)胞在空間水平上的不同需求。因為發(fā)酵系統(tǒng)是一個混合體系，在發(fā)酵過程中的任意時間段都存在著大量不同生長時期的細(xì)胞、基因表達水平不同的細(xì)胞、代謝負(fù)擔(dān)不同的細(xì)胞和生產(chǎn)性能不同的細(xì)胞[18]，因此僅僅根據(jù)環(huán)境因素的時間水平對發(fā)酵系統(tǒng)所有細(xì)胞進行整體的動態(tài)調(diào)控并不能滿足每個單細(xì)胞在空間水平上的需求。

圖3 基于TDAG8的pH響應(yīng)生物傳感器工作機制Fig.3 The mechanisms of TDAG8 dependent pH-responsi e biosensor

2 胞內(nèi)代謝物響應(yīng)的動態(tài)調(diào)控策略

為了同時滿足發(fā)酵系統(tǒng)中不同性能的單細(xì)胞在時間和空間水平上的不同需求，急需建立一種基于單細(xì)胞自身的獨特狀態(tài)進行自我調(diào)節(jié)的動態(tài)調(diào)控策略。胞內(nèi)代謝物僅存在于細(xì)胞內(nèi)部，因此能體現(xiàn)每個單細(xì)胞獨特的生理狀態(tài)?；谶@些特性，胞內(nèi)代謝物響應(yīng)的動態(tài)調(diào)控策略可同時實現(xiàn)對單細(xì)胞的時間和空間水平上的調(diào)控。

輔酶A(coenzyme A，CoA)及其硫酯化合物是胞內(nèi)典型的代謝中間產(chǎn)物，與胞內(nèi)能量供應(yīng)和物質(zhì)循環(huán)息息相關(guān)[1]。近年來，研究者們建立了多種基于胞內(nèi)丙二酰-CoA和酯酰-CoA含量變化的動態(tài)調(diào)控策略[28]。其中最為經(jīng)典的設(shè)計是XU等[29]的乙酰-CoA/丙二酰-CoA振蕩器和ZHANG等[30]的脂肪酸/酯酰-CoA動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)?；诒?CoA的動態(tài)調(diào)控策略主要依賴于受丙二酰-CoA調(diào)控的阻遏蛋白FapR和1個17 bp長度的結(jié)合位點fapO。當(dāng)胞內(nèi)丙二酰-CoA含量增加后可與FapR結(jié)合形成FapR-丙二酰-CoA復(fù)合體，該復(fù)合體無法識別fapO，從而無法形成阻遏作用，目標(biāo)蛋白得以表達[31]。相反，當(dāng)胞內(nèi)丙二酰-CoA不足時無法形成FapR-丙二酰-CoA復(fù)合體，F(xiàn)apR得以與fapO結(jié)合進而阻遏目標(biāo)基因表達。為了構(gòu)建1個動態(tài)調(diào)控裝置用以實時平衡脂肪酸合成時乙酰-CoA和丙二酰-CoA含量，XU等[29]篩選得到了1個受FapR激活的啟動子Pgap，將該啟動子與受FapR阻遏的啟動子T7-fapO結(jié)合，構(gòu)建得到了乙酰-CoA/丙二酰-CoA振蕩器(圖4-a)。當(dāng)胞內(nèi)丙二酰-CoA含量不足時該振蕩器激活Pgap表達并阻遏T7-fapO表達，從而分別強化乙酰-CoA轉(zhuǎn)化為丙二酰-CoA和抑制丙二酰-CoA轉(zhuǎn)化為脂肪酸；當(dāng)胞內(nèi)丙二酰-CoA含量過高時該振蕩器阻遏Pgap表達并激活T7-fapO表達，從而分別抑制乙酰-CoA轉(zhuǎn)化為丙二酰-CoA和強化丙二酰-CoA轉(zhuǎn)化為脂肪酸(圖4-b)。為了構(gòu)建1個平衡脂肪酸合成與酯酰-CoA積累的動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)，ZHANG等[30]首先設(shè)計了一個可高效響應(yīng)胞內(nèi)酯酰-CoA含量的生物傳感器(圖4-c)。該傳感器包括酯酰-CoA響應(yīng)的阻遏蛋白(FadR)和基于FadR結(jié)合位點構(gòu)建的啟動子組成。當(dāng)胞內(nèi)酯酰-CoA不足時FadR與識別位點結(jié)合并阻遏目標(biāo)基因表達；相反，當(dāng)胞內(nèi)酯酰-CoA含量過高時與FadR結(jié)合形成FadR-酯酰-CoA復(fù)合體，從而離開結(jié)合位點同時激活目標(biāo)基因表達。應(yīng)用該動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)調(diào)控丙酮酸脫羧酶(pdc)、醇脫氫酶(adhB)、酯酰-CoA合酶(fadD)和蠟酯合酶(atfA)的表達，最終獲得了1.5 g/L的生物柴油產(chǎn)量(圖4-c)。

總之，胞內(nèi)代謝產(chǎn)物響應(yīng)的生物傳感器由于可專一性的實時監(jiān)測單細(xì)胞水平的代謝變化，為單細(xì)胞水平的動態(tài)調(diào)控提供了新的思路。然而，在發(fā)酵過程中大多數(shù)代謝產(chǎn)物或中間產(chǎn)物往往可以不同程度地分泌到細(xì)胞外，這將會導(dǎo)致細(xì)胞間的信號交叉，從而不同程度地影響在單細(xì)胞水平上生物傳感器對自身信號的監(jiān)測準(zhǔn)確度。

a-丙二酰-CoA振蕩器工作機制,箭頭和鈍箭頭分別代表激活和抑制作用;b-丙二酰-CoA振蕩器工作示意圖，當(dāng)丙二酰-CoA不足時啟動ACC表達，當(dāng)丙二酰-CoA充足時啟動FAS表達;c-基于酯酰-CoA的動態(tài)調(diào)控策略,模塊A、B和C分別代表脂肪酸、乙醇和生物柴油(FAEE)的合成途徑圖4 基于酯酰-CoA生物傳感器的動態(tài)調(diào)控策略Fig.4 Acyl-CoA biosensor based dynamic regulation strategies

3 胞外代謝物響應(yīng)的動態(tài)調(diào)控策略

3.1 部分分泌型代謝物響應(yīng)的動態(tài)調(diào)控策略

由于微生物膜系統(tǒng)的豐富載體和多種轉(zhuǎn)運模式并存，大多數(shù)代謝物都可部分穿透細(xì)胞膜而分泌到胞外或進入其他細(xì)胞。這種廣泛存在的細(xì)胞間物質(zhì)交換對單細(xì)胞動態(tài)調(diào)控的精準(zhǔn)性造成了干擾。盡管如此，基于這種可部分跨膜轉(zhuǎn)運的代謝產(chǎn)物的動態(tài)調(diào)控策略依然備受關(guān)注，并且取得了良好的效果[32-34]。其中，基于氨基酸響應(yīng)生物傳感器的動態(tài)調(diào)控在近年來的研究較為廣泛。TyrR是芳香族氨基酸合成途徑的調(diào)控蛋白，常常作為芳香族類化合物合成代謝網(wǎng)絡(luò)動態(tài)調(diào)控的中樞。其調(diào)控機制是當(dāng)無苯丙氨酸或酪氨酸時TyrR形成2個二聚體結(jié)合于啟動子PtyrP或ParoF上游并激活下游基因表達；然而，當(dāng)存在苯丙氨酸或酪氨酸時，TyrR與苯丙氨酸或酪氨酸形成TyrR-苯丙氨酸或TyrR-酪氨酸復(fù)合體，該復(fù)合體可相互結(jié)合形成六聚體并分別彎曲啟動子PtyrP或ParoF結(jié)構(gòu)，從而達到阻遏下游基因表達的效果[35]。基于TyrR的調(diào)控原理，CHOU等[35]設(shè)計了1個菌株表型進化的反饋調(diào)控系統(tǒng)(feedback-regulated e olution of phenotype,FREP)，該系統(tǒng)以TyrR傳感器為基礎(chǔ)調(diào)控大腸桿菌突變子(mutD5)表達水平，從而實現(xiàn)菌株快速進化的目標(biāo)。具體而言，ParoF啟動子控制mutD5的表達，當(dāng)菌株酪氨酸產(chǎn)量增加時會抑制mutD5的表達，進而降低突變發(fā)生的頻率；相反，當(dāng)菌株酪氨酸產(chǎn)量較低時mutD5表達水平增加，進一步強化了該菌株的突變率，直至獲得高產(chǎn)酪氨酸菌株為止。此外，WU等[36]通過啟動子工程改造獲得了梯度強度PtyrP啟動子，該啟動子收到苯丙氨酸誘導(dǎo)。利用所構(gòu)建的PtyrP啟動子調(diào)控表達芳香族氨基酸合成途徑的關(guān)鍵酶——莽草酸激酶異構(gòu)酶(AroK)，成功構(gòu)建了可動態(tài)響應(yīng)苯丙氨酸的動態(tài)調(diào)控菌株xllp3，獲得了61.3 g/L的苯丙氨酸，且產(chǎn)量和產(chǎn)率相比較未動態(tài)調(diào)控的菌株分別提高了1.36和1.22倍。

氨基酸可通過跨膜蛋白的主動運輸作用或自由擴散作用進出細(xì)胞，因此其在細(xì)胞內(nèi)外的濃度分布主要取決于濃度差以及轉(zhuǎn)運蛋白活性[37-38]。一般而言，當(dāng)誘導(dǎo)物在胞內(nèi)的含量遠(yuǎn)高于胞外含量時,不同單細(xì)胞之間的信號干擾較小。這是因為不同單細(xì)胞所分泌的誘導(dǎo)物難以通過自由擴散進入其他細(xì)胞，而經(jīng)過主動運輸進入后也會因為胞內(nèi)已存在的大量誘導(dǎo)物而降低了這種信號干擾的程度。因此，部分分泌型代謝物響應(yīng)的動態(tài)調(diào)控根據(jù)胞內(nèi)外誘導(dǎo)物濃度差的不同將會產(chǎn)生不同的調(diào)控效果。

3.2 外排型代謝物響應(yīng)的動態(tài)調(diào)控策略

有些代謝物主要通過自由運輸或主動運輸?shù)耐馀抛饔梅置诘郊?xì)胞外，因此會形成胞內(nèi)代謝物含量等于或低于胞外代謝物含量的現(xiàn)象[39-40]。本文將這種代謝物定義為“外排型代謝物”。這種代謝物的動態(tài)調(diào)控策略往往無法進行精準(zhǔn)的空間水平動態(tài)調(diào)控，因為胞外代謝物含量高于或等于胞內(nèi)，導(dǎo)致不同單細(xì)胞受到環(huán)境中代謝物的誘導(dǎo)作用相同，容易形成整個發(fā)酵系統(tǒng)所有單細(xì)胞的“集體調(diào)控”現(xiàn)象。微生物培養(yǎng)過程中的群體響應(yīng)現(xiàn)象就是由該動態(tài)調(diào)控策略所控制的自然現(xiàn)象。據(jù)報道，細(xì)菌群體響應(yīng)的信號分子N-高絲氨酸內(nèi)酯(acyl-homoserine lactone,AHL)主要通過自由擴散和主動運輸作用進出細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)外的AHL含量基本相同[41-42]，這是群體響應(yīng)的信號傳導(dǎo)基礎(chǔ)。群體響應(yīng)分為2種調(diào)控模式，一種是來自Pantoeastewartia的EsaI-EsaR系統(tǒng)，該系統(tǒng)中EsaI催化合成AHL，AHL抑制EsaR對PesaS啟動子的激活作用；另一種是來自ibriofischeri的LuxI-LuxR系統(tǒng)，該系統(tǒng)中LuxI催化合成AHL，AHL與LuxR結(jié)合形成復(fù)合體進而激活PluxI下游基因的表達[17]。已有研究主要應(yīng)用群體響應(yīng)效應(yīng)動態(tài)調(diào)控目標(biāo)化合物合成途徑，從而達到平衡細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成的目標(biāo)[33]。具體而言，當(dāng)菌體剛開始生長時菌體濃度較低，群體響應(yīng)效應(yīng)較弱，目標(biāo)產(chǎn)物合成途徑關(guān)閉；當(dāng)菌體濃度達到設(shè)定閾值后啟動群體響應(yīng)效應(yīng)，從而啟動目標(biāo)產(chǎn)物合成[43-45]。近年來PRATHER課題組在群體響應(yīng)的設(shè)計和應(yīng)用中取得了較好成果[33,46-48]。例如，應(yīng)用EsaI-EsaR系統(tǒng)調(diào)控柚皮素合成途徑(酪氨酸解氨酶和4-香豆酸:CoA連接酶)，同時LuxI-LuxR系統(tǒng)調(diào)控CRISPR/dCas抑制系統(tǒng)實現(xiàn)在生產(chǎn)階段抑制脂肪酸合成的目標(biāo)(圖5)。最終DINH等[46]建立了一個群體響應(yīng)的雙動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)，顯著提高了柚皮素的生物合成效率，此外該系統(tǒng)對水楊酸的生物合成同樣具有顯著效果。

Module A-柚皮素合成模塊；Module B-丙二酰-CoA消耗抑制模塊圖5 基于群體響應(yīng)效應(yīng)的動態(tài)調(diào)控策略強化柚皮素合成Fig.5 Quorum sensing based dynamic regulation strategy to impro e the biosynthesis of naringenin

4 結(jié)論

目前存在多種時空水平的動態(tài)調(diào)控策略，且在發(fā)酵過程中展現(xiàn)出優(yōu)越的實時調(diào)控性能。將這些動態(tài)調(diào)控策略按照時空調(diào)控尺度不同分為環(huán)境響應(yīng)型、胞內(nèi)代謝物響應(yīng)型和胞外代謝物響應(yīng)型動態(tài)調(diào)控策略。其中環(huán)境響應(yīng)型動態(tài)調(diào)控策略主要以全體細(xì)胞的“集體調(diào)控”為主，在此基礎(chǔ)上實時監(jiān)測環(huán)境變化，并動態(tài)調(diào)節(jié)代謝途徑；胞內(nèi)代謝物響應(yīng)型動態(tài)調(diào)控策略主要以單細(xì)胞的“個體調(diào)控”為主，在此基礎(chǔ)上實時監(jiān)測單細(xì)胞自身的生理生化環(huán)境變化，并動態(tài)調(diào)節(jié)代謝途徑；胞外代謝物響應(yīng)型動態(tài)調(diào)控策略是一種處于“集體調(diào)控”與“個體調(diào)控”之間的過渡性策略，當(dāng)胞內(nèi)代謝物含量遠(yuǎn)高于胞外時則偏向于“個體調(diào)控”，當(dāng)胞內(nèi)代謝物含量等于或低于胞外含量時則偏向于“集體調(diào)控”。這些動態(tài)調(diào)控策略各有優(yōu)缺點，胞內(nèi)代謝產(chǎn)物響應(yīng)型動態(tài)調(diào)控策略雖然可以實現(xiàn)單細(xì)胞水平調(diào)控，但是由于僅有少數(shù)代謝物僅存在于胞內(nèi)，導(dǎo)致很多產(chǎn)物合成中無法應(yīng)用此策略。因此，未來應(yīng)用多種動態(tài)調(diào)控策略相結(jié)合的方式，構(gòu)建更加靈敏、適應(yīng)復(fù)雜環(huán)境的動態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)將可能成為重要研究方向[46-51]。

此外，由于多數(shù)代謝物可分泌到胞外，并被其他細(xì)胞攝取，引起了不同單細(xì)胞之間的信號干擾。建立微觀尺度的單細(xì)胞發(fā)酵技術(shù)，實現(xiàn)單細(xì)胞的獨立發(fā)酵至關(guān)重要。作為一種可能的解決方案，結(jié)合微流控技術(shù)的微液滴發(fā)酵技術(shù)有效隔絕了單細(xì)胞之間的相互干擾，有望實現(xiàn)更加精準(zhǔn)的發(fā)酵調(diào)控[52-53]。另一方面，雖然成千上萬的化合物實現(xiàn)了微生物法合成，但是其跨膜轉(zhuǎn)運模式以及胞內(nèi)外分布狀態(tài)依然報道較少，這不利于時空水平的動態(tài)調(diào)控研究。因此，未來通過蛋白質(zhì)工程手段調(diào)控代謝物在胞內(nèi)外的分布將有助于動態(tài)調(diào)控的精準(zhǔn)控制，促進發(fā)酵工程合成更多高附加值化合物。