響應(yīng)面分析法優(yōu)化魚(yú)露揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)萃取工藝

陳麗麗,白春清,袁美蘭,江 勇,趙 利,*

(1.江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江西南昌 330013; 2.國(guó)家淡水魚(yú)加工技術(shù)研發(fā)分中心,江西南昌 330013)

魚(yú)露是一種高營(yíng)養(yǎng)的水產(chǎn)調(diào)味品,是一種清澈的棕色液體,味道鮮美。魚(yú)露主要以低價(jià)值的魚(yú)、蝦及其加工的副產(chǎn)物為原料,與一定比例的食鹽混合,利用原料自身的內(nèi)源性酶和多種微生物之間的共同作用,通過(guò)分解和發(fā)酵原料中的脂肪、蛋白質(zhì)和其它成分制成的液體調(diào)味品[1]。魚(yú)露具有魚(yú)蝦等水產(chǎn)品原料特有的風(fēng)味,是東亞及東南亞各國(guó)必需的日常調(diào)味料,也是這些地區(qū)居民膳食中主要蛋白質(zhì)的來(lái)源之一[2]。

人類雖然很早就開(kāi)始食用魚(yú)露,但對(duì)魚(yú)露的風(fēng)味物質(zhì)卻并不是完全了解,國(guó)外對(duì)魚(yú)露的研究主要集中在風(fēng)味和微生物方面[3-6]。近年來(lái)隨著對(duì)魚(yú)露的進(jìn)一步研究,關(guān)于魚(yú)露呈味方面的報(bào)道層出不窮,對(duì)于魚(yú)露風(fēng)味已經(jīng)有了一部分的了解。魚(yú)露風(fēng)味組成相當(dāng)復(fù)雜,Katsuya等[7]通過(guò)炙烤香、魚(yú)腥味、氨味、酸敗味、奶酪香、肉香來(lái)描述魚(yú)露的特征性風(fēng)味;Pham等[8]通過(guò)魚(yú)腥味、奶酪味、黃油爆米花味和熟米飯味來(lái)描述魚(yú)露的特征性風(fēng)味;Giri等[9]認(rèn)為魚(yú)露的主要特征氣味是堅(jiān)果味、奶酪味、氨味、魚(yú)腥味,其中氨、胺類等構(gòu)成氨味。Shimoda等[10]對(duì)魚(yú)露進(jìn)行堿化處理,提高了魚(yú)露中含氮和含硫化合物的釋放,采用GC-MS分析法對(duì)魚(yú)露的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè),初步鑒定了124種化合物,堿化后對(duì)三甲胺、二甲基二硫等不易被現(xiàn)有方法檢測(cè)到的高揮發(fā)性含氮含硫化合物檢測(cè)得到了加強(qiáng)。Yimdee等[6]采用氣相色譜-質(zhì)譜-嗅聞技術(shù)(GC-MS-O)對(duì)14種魚(yú)露中的揮發(fā)性化合物進(jìn)行檢測(cè),共檢定了79種化合物。揮發(fā)性成分是調(diào)味品中主要的商業(yè)元素,雖然占比較小,但卻是區(qū)別兩種食品的一個(gè)重要質(zhì)量特征,是衡量食品品質(zhì)的重要因素[11]。作為調(diào)味品,風(fēng)味的研究對(duì)提高魚(yú)露的質(zhì)量和品質(zhì)具有重要的指導(dǎo)意義[12]。魚(yú)露是發(fā)酵產(chǎn)品,其發(fā)酵過(guò)程是以其原料中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和糖類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為基礎(chǔ),在微生物和酶的作用下發(fā)生以營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解為主體的一系列復(fù)雜代謝活動(dòng),逐漸產(chǎn)生醇、酯、醛、酮等化合物[13-14],最終才有了魚(yú)露獨(dú)特的風(fēng)味。

目前有許多關(guān)于魚(yú)露的營(yíng)養(yǎng)成分的研究,但對(duì)于魚(yú)露的風(fēng)味成分卻并不是完全了解。全二維氣相色譜質(zhì)譜具有較高的分離度和分辨度,其峰容量相當(dāng)于兩個(gè)色譜柱各自峰容量的乘積,適用于復(fù)雜樣品的分析,根據(jù)不同的樣品類型以及不同的分離效率和分類特征(官能團(tuán)、極性、沸點(diǎn)等),選擇不同的二維柱系統(tǒng),因此極大地提高了光譜峰值分析的準(zhǔn)確度。本文建立使用的HS-SPME-GC×GC-MS聯(lián)用能較好地分析測(cè)定魚(yú)露揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)百分比,更好的對(duì)樣品中的成分進(jìn)行分離,分辨率高。此方法方便、快捷且效率高,測(cè)定結(jié)果真實(shí)且較為全面地反映銀魚(yú)魚(yú)露中揮發(fā)性物質(zhì)的組成,可以為魚(yú)露產(chǎn)品的品質(zhì)檢測(cè)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀魚(yú)魚(yú)露 青島正道食品有限公司;混合正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)溶液 美國(guó)Restek公司;2,4,6-三甲基吡啶標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Afla Aesar公司;氯化鈉 上海麥克林生化客家有限公司。

AOC-5000頂空-固相微萃取三合一自動(dòng)進(jìn)樣器 瑞士CTC公司;65 μm P DMS/DVB固相微萃取頭萃取頭 美國(guó)Supelco公司;GCMS-TQ8050三重四極桿型氣質(zhì)聯(lián)用儀 日本島津公司;20 mm聚四氟乙烯磁性蓋頭 德國(guó)CNW公司;20 mL頂空瓶 美國(guó)Altech公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 魚(yú)露風(fēng)味物質(zhì)的萃取 向20 mL的頂空瓶中加入5 mL魚(yú)露樣品和5 g NaCl,振搖1 min,使其達(dá)到過(guò)飽和,加入10 μL濃度為0.05 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品2,4,6-三甲基吡啶,然后用聚四氟乙烯磁性蓋頭迅速密封,置于自動(dòng)進(jìn)樣器中。萃取頭(250 ℃活化30 min)頂空吸附20 min后,迅速將萃取頭插入氣相色譜進(jìn)樣口解吸5 min,然后進(jìn)行GC×GC-MS分析,每組樣品分別測(cè)5個(gè)平行樣品。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 將HS-SPME-GC×GC-MS檢測(cè)魚(yú)露時(shí)設(shè)定的參數(shù)作為單因素,包括萃取溫度、萃取時(shí)間和振蕩頻率。取市售銀魚(yú)魚(yú)露進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。每個(gè)條件做三次平行試驗(yàn)。

1.2.2.1 萃取時(shí)間的優(yōu)化 取5 mL魚(yú)露樣品按照上述樣品處理方法預(yù)處理后放入20 mL頂空瓶中進(jìn)行風(fēng)味成分的萃取,固定萃取溫度為50 ℃、振蕩頻率500 r/min保持不變,萃取時(shí)間設(shè)定按照30、40、50、60、70和80 min,進(jìn)行樣品風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定來(lái)優(yōu)化萃取時(shí)間。

1.2.2.2 萃取溫度的優(yōu)化 取5 mL魚(yú)露樣品按照上述樣品處理方法預(yù)處理后放入20 mL頂空瓶中進(jìn)行風(fēng)味成分的萃取,固定萃取時(shí)間60 min、振蕩頻率500 r/min保持不變,萃取溫度設(shè)定按照40、45、50、55、60、65和70 ℃,進(jìn)行樣品風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定來(lái)優(yōu)化萃取溫度。

1.2.2.3 振蕩頻率的優(yōu)化 取5 mL魚(yú)露樣品按照上述樣品處理方法預(yù)處理后放入20 mL頂空瓶中進(jìn)行風(fēng)味成分的萃取,固定萃取時(shí)間為60 min、萃取溫度50 ℃保持不變,振蕩頻率設(shè)定按照300、400、500、600和700 r/min,進(jìn)行樣品風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定來(lái)優(yōu)化振蕩頻率。

1.2.3 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn),對(duì)萃取溫度、萃取時(shí)間和振蕩頻率三個(gè)因素的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,根據(jù)揮發(fā)性物質(zhì)的總個(gè)數(shù)和總體積來(lái)確定較優(yōu)的萃取條件,采用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)方案,響應(yīng)面分析因素和水平見(jiàn)表1,得到魚(yú)露風(fēng)味物質(zhì)固相微萃取的最佳工藝,在最佳工藝的條件下進(jìn)行魚(yú)露風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定。

表1 SPME萃取實(shí)驗(yàn)因素水平編碼Table 1 SPME extraction experimental factors level coding

1.2.4 檢測(cè)分析 參考文獻(xiàn)[15]的方法操作。

1.2.4.1 色譜條件 色譜柱一:聚乙二醇(PEG)毛細(xì)色譜柱HP-INNOWax(30 m×0.25 mm,0.25 μm);色譜柱二:ID-BPX1毛細(xì)色譜柱(10 m×0.1 mm,0.1 μm)。載氣為He(99.999%);柱前壓為285.7 kPa;柱箱溫度為50 ℃;進(jìn)樣口溫度為250 ℃;不分流進(jìn)樣;流速為1 mL/min;進(jìn)樣時(shí)間1 min;程序升溫:起始溫度為50 ℃,保持2 min,然后以2 ℃/min的速度升到250 ℃,保持10 min。

1.2.4.2 質(zhì)譜條件 離子化方式為電子轟擊(electron impactionization,EI),離子源溫度為200 ℃,接口溫度為250 ℃,電子能量為70 eV;不分流進(jìn)樣;溶劑延遲1.5 min后采集信號(hào);檢測(cè)模式為全掃描,掃描質(zhì)量范圍(m/z)45～330。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,每個(gè)試驗(yàn)平行4次。采用SPSS對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析(ANOVA)檢查各個(gè)結(jié)果的顯著性差異,同時(shí)采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)作圖處理。響應(yīng)面試驗(yàn)采用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行結(jié)果分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響 由圖1可知,出峰個(gè)數(shù)和峰體積隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后下降的趨勢(shì),在30～40 min內(nèi),隨著時(shí)間的增加,峰體積和出峰個(gè)數(shù)增加,40～50 min這段時(shí)間,峰體積和出峰個(gè)數(shù)呈下降趨勢(shì),在60 min時(shí),峰體積達(dá)到最高值7.55×1010,出峰個(gè)數(shù)在70 min時(shí)達(dá)到最高1346個(gè)。隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng),頂空瓶中揮發(fā)性物質(zhì)的濃度升高,萃取頭不斷吸附頂空瓶中的揮發(fā)性成分,所以檢測(cè)到的出峰個(gè)數(shù)和峰體積不斷升高。隨著萃取時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng),檢測(cè)到的出峰個(gè)數(shù)和峰體積有所下降,這表明萃取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)并不一定有效。萃取一段時(shí)間后,萃取頭達(dá)到飽和狀態(tài),如果時(shí)間延長(zhǎng),可能導(dǎo)致?lián)]發(fā)性氣體溢出,檢測(cè)到的揮發(fā)性物質(zhì)成分將減少[16]。綜合考慮,最終選取60 min作為最佳萃取時(shí)間。

圖1 萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響Fig.1 Effect of extraction time on extraction

2.1.2 萃取溫度對(duì)萃取效果的影響 由圖2可知,在萃取過(guò)程中隨著萃取溫度的升高,出峰個(gè)數(shù)和峰體積呈現(xiàn)一種先增加后下降的趨勢(shì)。在40～45 ℃時(shí),萃取的揮發(fā)性化合物峰體積和出峰個(gè)數(shù)增加,50～60 ℃溫度范圍內(nèi),隨著溫度的升高,峰體積和出峰個(gè)數(shù)也隨著增加,當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時(shí),出峰個(gè)數(shù)1663個(gè)和峰體積9.94×1010達(dá)到了最高值,這是由于頂空瓶中揮發(fā)性物質(zhì)的濃度升高,被萃取頭吸附的揮發(fā)性成分含量更高,所以檢測(cè)到的出峰個(gè)數(shù)和峰體積也在升高。隨著萃取溫度的繼續(xù)升高,萃取的揮發(fā)性化合物的峰體積和出峰個(gè)數(shù)呈下降趨勢(shì)。當(dāng)溫度繼續(xù)升高到70～80 ℃時(shí),樣品中的一些揮發(fā)性成分遭到破壞,檢測(cè)得到的出峰個(gè)數(shù)和體積下降。萃取溫度對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)的吸附有一定的影響,溫度過(guò)低,沸點(diǎn)低的化合物不能揮發(fā)出來(lái),但溫度過(guò)高,一些化合物可能會(huì)分解和變性,同時(shí)萃取頭分析揮發(fā)性化合物組分的能力將降低[17]。綜合來(lái)看,選取60 ℃作為最適宜的萃取溫度。

圖2 萃取溫度對(duì)萃取效果的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction

2.1.3 振蕩頻率對(duì)萃取效果的影響 由圖3可知,振蕩頻率對(duì)出峰個(gè)數(shù)和峰體積也有一定的影響。隨著振蕩頻率的增加,出峰個(gè)數(shù)和峰體積呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),在300～500 r/min振蕩頻率內(nèi),萃取的揮發(fā)性化合物隨著振蕩頻率的增加峰體積和出峰個(gè)數(shù)增加,在500 r/min振蕩頻率,峰體積和出峰個(gè)數(shù)達(dá)到了最大1663個(gè)和9.94×1010,隨著振蕩頻率的繼續(xù)增加,出峰個(gè)數(shù)和峰體積明顯減少。SPME采用的是纖維振蕩的方式,可以精確控制振蕩頻率,提高分析的重復(fù)性。纖維頭的振蕩促進(jìn)樣品均勻化,從而液體樣品連續(xù)產(chǎn)生新的液位,并加速了分析物從樣品到頂部空間,然后從頂部空間到纖維頭的傳質(zhì)過(guò)程[18]。綜上所述,500 r/min振蕩頻率萃取效果最好,在此振蕩頻率下萃取的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)最多。

圖3 振蕩頻率對(duì)萃取效果的影響Fig.3 Effect of oscillation frequency on extraction

2.2 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化萃取魚(yú)露風(fēng)味物質(zhì)的工藝

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對(duì)萃取時(shí)間、萃取溫度和振蕩頻率進(jìn)行結(jié)果分析,分別選取最佳的萃取條件,響應(yīng)面分析法試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2和表3。

2.2.1 萃取魚(yú)露風(fēng)味響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及方差分析 采用Design-Expert 8.0.6對(duì)表2出峰個(gè)數(shù)結(jié)果進(jìn)行多元擬合回歸分析,表3為出峰個(gè)數(shù)的方差分析結(jié)果。以出峰個(gè)數(shù)為響應(yīng)值對(duì)應(yīng)自變量萃取溫度、萃取時(shí)間和振蕩頻率進(jìn)行橫量型擬合,得到二次響應(yīng)面回歸模型方程為:出峰個(gè)數(shù)Y1=1541.2-8.625A+21.625B+22C-28.75AB+49.5AC+18BC-42.975A2-13.475B2-59.725C2,該模型失擬項(xiàng)P值大于0.05,回歸項(xiàng)P值小于0.01,R2=0.9217,說(shuō)明該模型與試驗(yàn)擬合良好,可用于理論推測(cè)對(duì)萃取效果的判定。

采用Design-Expert 8.0.6對(duì)表2、表4峰體積進(jìn)行多元擬合回歸分析,得到峰體積的二次響應(yīng)面回歸模型方差分析,峰體積(×1010)Y2=7.366-0.06625A+0.24375B+0.42C-0.33AB+0.6375AC-0.0575BC-0.268A2-0.173B2-0.5505C2,失擬項(xiàng)P值大于0.05,回歸項(xiàng)P值小于0.01,R2=0.9185,說(shuō)明該模型與試驗(yàn)擬合良好。

表3 出峰個(gè)數(shù)的響應(yīng)面二次模型方差分析Table 3 Analysis of the variance of the response surface quadratic model of the number of peaks

通過(guò)對(duì)出峰個(gè)數(shù)和峰體積進(jìn)行響應(yīng)面二次模型方差分析,振蕩頻率和萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響顯著(P<0.05),萃取溫度對(duì)萃取效果的影響不顯著(P>0.05),在交互項(xiàng)中萃取溫度/振蕩頻率對(duì)萃取效果的影響極顯著(P<0.01),萃取時(shí)間/振蕩頻率對(duì)萃取效果的影響不顯著(P>0.05)。由此可知,樣品的出峰個(gè)數(shù)和峰體積與萃取溫度、萃取時(shí)間和振蕩頻率之間有明顯的線性關(guān)系,各個(gè)因素對(duì)魚(yú)露揮發(fā)性化合物萃取效果影響主次因素為振蕩頻率>萃取時(shí)間>萃取溫度。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results ofBox-Behnken response surface

2.2.2 萃取魚(yú)露風(fēng)味響應(yīng)面交互作用分析 對(duì)響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行方差和顯著性檢驗(yàn)后,依據(jù)二次多項(xiàng)方差擬合結(jié)果,確定其中一個(gè)因子,并繪制Y和另外兩個(gè)因子的三維響應(yīng)曲面圖和等高線圖,最佳參數(shù)和每個(gè)參數(shù)之間的相互作用可以從響應(yīng)面分析圖中直觀地看到[19]。當(dāng)特征值為正值時(shí),響應(yīng)分析圖為具有最小值的山谷形曲面。當(dāng)特征值為負(fù)時(shí),它是一個(gè)具有最大值的山丘曲面。當(dāng)特征值具有正值和負(fù)值時(shí),它們是鞍形曲面,并且無(wú)極值存在[20]。根據(jù)響應(yīng)曲面和等高線圖,分析萃取溫度、萃取時(shí)間以及振蕩頻率對(duì)萃取效果的影響,結(jié)果如圖4～圖9所示。

表4 峰體積的響應(yīng)面二次模型方差分析Table 4 Analysis of the variance of the response surface quadratic model of the volume of peaks

圖4 萃取時(shí)間和萃取溫度對(duì)出峰個(gè)數(shù)影響的響應(yīng)曲面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots of extraction time and extraction temperature on the number of peaks

圖5 振蕩頻率和萃取溫度對(duì)出峰個(gè)數(shù)影響的響應(yīng)曲面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour map of the influence of oscillation frequency and extraction temperature on the number of peaks

圖6 振蕩頻率和萃取時(shí)間對(duì)出峰個(gè)數(shù)影響的響應(yīng)曲面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour map of the influence of oscillation frequency and extraction time on the number of peaks

圖7 萃取溫度和萃取時(shí)間對(duì)峰體積影響的響應(yīng)曲面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots of extraction temperature and extraction time on peak volume

當(dāng)固定振蕩頻率不變時(shí),隨著萃取時(shí)間和萃取溫度的增加,出峰個(gè)數(shù)逐漸增加,萃取時(shí)間增加的更顯著一些,且等高線呈現(xiàn)橢圓形,表明萃取時(shí)間和萃取溫度兩個(gè)因素的交互作用比較明顯;當(dāng)固定萃取時(shí)間不變,隨著振蕩頻率和萃取溫度的增加,出峰個(gè)數(shù)呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì),且等高線呈現(xiàn)橢圓形,橢圓效果最明顯,表明振蕩頻率和萃取溫度兩個(gè)因素的交互作用比較明顯;當(dāng)固定萃取溫度不變時(shí),隨著振蕩頻率和萃取時(shí)間的增加,峰體積呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì),且等高線呈現(xiàn)橢圓形,表明振蕩頻率和萃取時(shí)間兩個(gè)因素的交互作用比較明顯。

圖8 萃取溫度和振蕩頻率對(duì)峰體積影響的響應(yīng)曲面和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plot of the influence of extraction temperature and oscillation frequency on peak volume

圖9 萃取時(shí)間和振蕩頻率對(duì)峰體積影響的響應(yīng)曲面和等高線圖Fig.9 Response surface and contour plots of extraction time and oscillation frequency versus peak volume

當(dāng)固定振蕩頻率不變時(shí),隨著萃取時(shí)間和萃取溫度的增加,峰體積逐漸增加,萃取時(shí)間增加的更明顯一些,且等高線呈現(xiàn)橢圓形,表明萃取時(shí)間和萃取溫度兩個(gè)因素的交互作用比較明顯;當(dāng)固定萃取時(shí)間不變,隨著振蕩頻率和萃取溫度的增加,峰體積下降的趨勢(shì),萃取溫度下降更明顯,且等高線呈現(xiàn)橢圓形,表明振蕩頻率和萃取溫度兩個(gè)因素的交互作用比較明顯;當(dāng)固定萃取溫度不變時(shí),隨著振蕩頻率和萃取時(shí)間的增加,峰體積呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì),且等高線呈現(xiàn)橢圓形,表明振蕩頻率和萃取時(shí)間兩個(gè)因素的交互作用比較明顯。

通過(guò)Design-Expert 8.0.6和綜合考慮分析,魚(yú)露風(fēng)味物質(zhì)成分萃取的最佳條件為:萃取溫度58 ℃,萃取時(shí)間70 min,振蕩頻率510 r/min,該模型在此條件下，預(yù)測(cè)的出峰個(gè)數(shù)最多,為1558.55個(gè),峰體積為7.56×1010。

2.3 魚(yú)露揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 HS-SPME-GC×GC-MS對(duì)銀魚(yú)魚(yú)露揮發(fā)性風(fēng)味成分的分離效果 魚(yú)露的風(fēng)味組成成分十分復(fù)雜,傳統(tǒng)的一維色譜由于分離分析能力有限,不能將其完全分離開(kāi)來(lái)。采用全二維正交分離系統(tǒng)對(duì)魚(yú)露揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行分離,得到分離3D圖結(jié)果如10所示。與一維色譜相比,具有分離度好、峰容量大、雜質(zhì)干擾較小等特點(diǎn)[21]。全二維氣相色譜具有較高的分離度和分辨度,其峰容量相當(dāng)于兩個(gè)色譜柱各自峰容量的乘積,適用于復(fù)雜樣品的分析,根據(jù)不同的樣品類型以及不同的分離和分類特征(官能團(tuán)、極性、沸點(diǎn)等),選擇不同的二維柱系統(tǒng),因此極大地提高了光譜峰值分析的準(zhǔn)確度[22]。在一維色譜上得不到很好地分離、分析的物質(zhì),在二維色譜上得到了很好地定性定量分析,二維色譜可以更好地對(duì)化合物進(jìn)行定性定量分析。

圖10 全二維氣相對(duì)銀魚(yú)魚(yú)露揮發(fā)性風(fēng)味成分分離3D圖Fig.10 3D map of volatile flavor components of fulltwo-dimensional gas relative to silver fish fish sauce

表5 銀魚(yú)魚(yú)露中各類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的數(shù)量和含量Table 5 Quantity and contents of various volatileflavor substances in silver fish sauce

2.3.2 銀魚(yú)魚(yú)露揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類分析 表5為銀魚(yú)魚(yú)露中各類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的數(shù)量和含量。根據(jù)上述響應(yīng)面分析得到的最佳萃取條件,進(jìn)行魚(yú)露揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分的萃取,全二維氣相色譜進(jìn)行檢測(cè),共檢測(cè)出152種揮發(fā)性化合物物質(zhì),其中酮類11種,占1.76%;醇類26種,占26.02%;醛類6種,占5.16%;酯類20種,占10.51%;酚類6種,占1.27%;酸類19種,占11.81%;雜環(huán)11種,占2.40%;苯環(huán)18種,占2.72%;烴類14種,占25.91%;其他未分類的21種,占12.44%。其中種類最多的是醇類和酯類化合物,但含量最多的是醇類和烴類化合物。醇類揮發(fā)性物質(zhì)是脂肪酸二級(jí)氫過(guò)氧化物的分解、脂質(zhì)氧化酶對(duì)脂肪酸的作用、脂肪的氧化分解生成,或由羰基化合物還原生成醇[23],大多呈香甜的果香,但閾值分布范圍較大。酯類揮發(fā)性物質(zhì)是魚(yú)露在發(fā)酵過(guò)程中脂質(zhì)代謝產(chǎn)物而生成的醇和羧酸的酯化作用而形成[24],多呈果香和花香味,且閾值較低,能賦予魚(yú)露甜香、水果香、花香[25-26]。酮類揮發(fā)性物質(zhì)與多不飽和脂肪酸的熱氧化或降解、氨基酸降解等有關(guān)[23],具有花香和果香味,且閾值高,對(duì)食品的整體甜花香和果香風(fēng)味有增強(qiáng)作用[27]。醇類化合物、酯類化合物、酮類化合物可能構(gòu)成了魚(yú)露風(fēng)味中“肉味”,或者對(duì)其他風(fēng)味有協(xié)同作用。醛類揮發(fā)性物質(zhì)是多不飽和脂肪酸在微生物和酶的作用下氧化降解產(chǎn)生醛類物質(zhì)是魚(yú)露揮發(fā)性風(fēng)味化合物的主要組成成分,酸類揮發(fā)性物質(zhì)是由脂肪的水解以及脂肪氧化過(guò)程中產(chǎn)生,大多帶有腐敗、汗味或令人作嘔的不愉快氣味,閾值較高,對(duì)魚(yú)露整體風(fēng)味有不良影響[28]。雜環(huán)類揮發(fā)性物質(zhì)形成原因較為復(fù)雜,但此類揮發(fā)性物質(zhì)閾值較低,是食品的特征風(fēng)味的重要組成,烴類揮發(fā)性物質(zhì)是脂肪酸氧化自由基的均裂所致[29],大多帶清香和香甜味,閾值和含量均較低,對(duì)魚(yú)露的風(fēng)味貢獻(xiàn)不大[30],苯環(huán)類揮發(fā)性物質(zhì)形成原因較為復(fù)雜,但此類揮發(fā)性物質(zhì)閾值較低,是食品的特征風(fēng)味的重要組成。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用HS-SPME萃取魚(yú)露的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化分析,確定魚(yú)露揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的最佳萃取條件:萃取溫度58 ℃,萃取時(shí)間70 min,振蕩頻率510 r/min,在此條件下萃取效果最好,預(yù)測(cè)得到的出峰個(gè)數(shù)最多,為1558.55個(gè),峰體積為7.56×1010。對(duì)銀魚(yú)魚(yú)露中的揮發(fā)性風(fēng)味化合物的測(cè)定,共檢測(cè)到152種化合物,可分為酮類、醇類、醛類、酯類、酚類、酸類、雜環(huán)、苯環(huán)、烴類等,其中化合物種類最多的是醇類和酯類,分別占檢測(cè)到26種和20種,但測(cè)得化合物含量最多的是醇類和烴類,分別為26.02%和25.91%。

建立使用的HS-SPME-GC×GC-MS聯(lián)用能較好地分析測(cè)定魚(yú)露揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)百分比,更好地對(duì)樣品中的成分進(jìn)行分離,分辨率高。此方法方便、快捷且效率高,測(cè)定結(jié)果真實(shí)且較為全面地反映銀魚(yú)魚(yú)露中揮發(fā)性物質(zhì)的組成,可以為魚(yú)露產(chǎn)品的品質(zhì)檢測(cè)提供理論參考。魚(yú)露揮發(fā)性風(fēng)味的構(gòu)成非常龐大與復(fù)雜,其中仍然可能存在具備特征風(fēng)味的單體物質(zhì)未被發(fā)現(xiàn),且各種揮發(fā)性物質(zhì)之間是否存在協(xié)同作用也還未十分明確。