鐵皮石斛糖蛋白對皮膚炎癥期的調(diào)控作用及機(jī)制

趙 倩,戴天浥,洪文龍,周麗免,蘇海冉,田 洋,4,*,白忠彬,*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650201; 2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家辣木加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心,云南昆明 650201; 3.云南斛哥藥業(yè)有限公司,云南普洱 665000; 4.食藥資源開發(fā)與利用教育部工程中心,云南昆明 650201)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKinura et Migo,DOKM)為石斛屬蘭科多年生草本植物,全球約1400多種,主要分布于亞洲的熱帶地區(qū)[1]。我國石斛屬植物共76種,鐵皮石斛是中國藥典收錄的5種石斛之一,具有益胃生津、滋陰清熱、潤肺止咳等功效[2]。在2018年鐵皮石斛被國家衛(wèi)健委收錄為新資源食品。已經(jīng)有研究報道,石斛與機(jī)體多個部位的炎癥反應(yīng)密切相關(guān),如對于糖尿病引發(fā)的心肌病,鐵皮石斛提取物可通過抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng),降低炎癥因子白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的分泌來減輕心肌病癥狀[3]。對于胃腸道疾病,鐵皮石斛多糖對治療急性結(jié)腸炎小鼠具有明顯作用,其機(jī)理為通過β-arrestin1信號通路抑制NLRP3炎性體[4]。在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥模型中,石斛通過抑制一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,iNOS),環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)的表達(dá)以及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途徑中的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)的磷酸化達(dá)到抑制炎癥的作用[5]。

皮膚傷口愈合一般經(jīng)歷炎癥、新生肉芽組織填充和瘢痕形成三個階段[6],其組織學(xué)變化為傷口部位發(fā)生凝血,細(xì)胞因子分泌及后續(xù)的炎癥細(xì)胞聚集,細(xì)胞外基質(zhì)填充損傷部位,愈合后瘢痕組織的降解和吸收[7]。正常愈合過程中,在傷口受損的初期,大量的單核細(xì)胞聚集于受損部位,逐漸轉(zhuǎn)化為活化的巨噬細(xì)胞,對壞死組織和細(xì)胞碎片進(jìn)行吞噬,并分泌大量的炎癥因子,同時釋放抗菌物質(zhì),促進(jìn)創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)[8]。到創(chuàng)面炎癥的后階段,創(chuàng)面的炎癥被抑制,巨噬細(xì)胞主要分泌生長轉(zhuǎn)化因子(transforming growth factor,TGF-β)和血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Grown Factor,VEGF)等蛋白因子,使成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等修復(fù)細(xì)胞遷移至創(chuàng)面,肉芽組織開始覆蓋病損組織,新生血管大量生成,逐步進(jìn)入創(chuàng)面修復(fù)時期[9-10]。

鐵皮石斛作為新資源食品,其在藥食同源領(lǐng)域具有諸多功效,但其促進(jìn)傷口愈合及其機(jī)理未見報道。本實驗采用小鼠皮膚損傷模型,檢測了鐵皮石斛糖蛋白對小鼠皮膚損傷愈合的促進(jìn)作用,同時選用巨噬細(xì)胞株RAW264.7作為體外研究對象,應(yīng)用MTT、ELISA、RT-PCR、WB等方法檢測鐵皮石斛糖蛋白對RAW264.7細(xì)胞分泌炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6以及NF-κB信號通路的影響,研究了鐵皮石斛糖蛋白在傷口愈合過程中的炎癥調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

C57雄性小鼠7-8周齡,體重(20±2) g 購自常州卡文斯實驗動物有限公司,飼養(yǎng)于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)工程中心動物飼養(yǎng)室(N000013);RAW264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞 由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南辣木所提供;三年生林下仿生鐵皮石斛 來自云南省普洱市斛哥莊園,于12月份采集;高糖DMEM培養(yǎng)基 美國BI公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS) 美國Hyclone公司;二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、RIPA細(xì)胞裂解液、磷酸酶抑制劑、青鏈霉素 北京索萊寶科技有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR染料 南京喏唯贊生物科技有限公司;抗體AMPK、P-AMPK、NF-κB、P-NF-κB、VEGF、IL-6、TNF-α、ECL發(fā)光液 遼寧萬類生物科技有限公司;BCA試劑盒 碧云天公司。

Epoch2全波長酶標(biāo)儀 美國BioTek公司;LightCycler480 II熒光定量PCR儀 德國Roche公司;JY-scz2電泳儀 美國Bio-Rad公司;K3000mini化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng) 北京科創(chuàng)銳新生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鐵皮石斛糖蛋白的制備 參照白忠彬[11]方法,在此基礎(chǔ)上適當(dāng)修改。試驗采用熱水浸提法,采取工藝為提取料液比1∶10,浸提溫度70 ℃,提取時間為90 min,提取次數(shù)3次,(紗布過濾)合并濾液;4000 r/min,離心15 min,合并上清液;濃縮(減壓濃縮),濃縮到一定體積后,加5倍體積95%乙醇,靜置24 h,離心取沉淀,沉淀用適量無水乙醇洗滌2次,冷凍干燥得到石斛糖蛋白粉,于常溫儲存。

1.2.2 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng) 取出低溫保存的1 mL細(xì)胞株,快速融化,放于15 mL無菌離心管中,加入5 mL培養(yǎng)液混勻后,以1500 r/min離心3 min,去上清將細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)移至100 mm培養(yǎng)皿中,于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至80%,用磷酸緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)沖洗2次,0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液在37 ℃培養(yǎng)箱中消化3～4 min,用無血清培養(yǎng)基吹打底部細(xì)胞,使細(xì)胞脫落。取細(xì)胞懸液以1500 r/min離心3 min,棄上清,加入新鮮培養(yǎng)液使底部細(xì)胞沉淀懸浮于培養(yǎng)液中。取細(xì)胞混懸液按1∶3傳代放于3個培養(yǎng)皿中,并分別補(bǔ)充培養(yǎng)液,于 37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞毒性實驗 以200 μL/孔(104個細(xì)胞)接種細(xì)胞到96孔板上,于37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h,用PBS清洗未貼壁細(xì)胞,添加25、50、100、200 μg/mL鐵皮石斛糖蛋白,對照組更換新鮮培養(yǎng)基。每孔200 μL,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完成后,每孔用100 μL新鮮培養(yǎng)基配制的0.25 mg/mL的MTT溶液37 ℃避光孵育4 h顯色。吸去培養(yǎng)基,PBS洗2次,每孔添加150 μL DMSO,輕微振蕩使紫色結(jié)晶物溶解。酶標(biāo)儀于490 nm測定吸光值。細(xì)胞存活率計算公式如下:

表1 RT-PCR擴(kuò)增條件Table 1 RT-PCR amplification conditions

表2 RT-PCR引物序列Table 2 RT-PCR primer sequence

式中:OD0為調(diào)零孔;OD1為空白孔;OD2為實驗孔。

1.2.4 RT-PCR法檢測RAW264.7細(xì)胞中細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平 將處于對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞按每皿1.2×106個細(xì)胞接板于60 mm培養(yǎng)皿內(nèi),培養(yǎng)24 h后進(jìn)行添加鐵皮石斛糖蛋白。對照組更換新鮮培養(yǎng)基,石斛糖蛋白組添加鐵皮石斛糖蛋白終濃度分別為25、50、100 μg/mL。添加石斛糖蛋白干預(yù)12、24、48、72 h后,按照試劑盒說明書提取總RNA,將RNA按照試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,按表1的擴(kuò)增條件加樣上機(jī)。RT-PCR引物序列見表2。

1.2.5 ELISA法檢測細(xì)胞上清中炎癥因子的分泌 將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞按照5×104個/mL每孔200 μL接種于96孔板中37 ℃,5% CO2培養(yǎng)24 h。在檢測IL-1β時,先用1 μg/mL的LPS誘導(dǎo)1 h然后添加鐵皮石斛糖蛋白。對照組更換新鮮培養(yǎng)基,石斛糖蛋白組終濃度為25、50、100 μg/mL。培養(yǎng)24 h后,收集上清液于200 μL的離心管里。每組5個復(fù)孔。上清液1200 r/min離心10 s后吸取上層清液分裝后放于-20 ℃冰箱里備用。

從4 ℃冰箱里取出試劑盒,室溫平衡30 min,取出事先制備好的細(xì)胞上清液振蕩離心混勻后,按照試劑盒說明進(jìn)行TNF-α、IL-1β表達(dá)量的測定。

1.2.6 蛋白印跡法檢測細(xì)胞中蛋白的表達(dá) 取對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞以3×105個/mL接板于60 mm培養(yǎng)皿內(nèi),每皿4 mL培養(yǎng)24 h后待細(xì)胞貼壁。對照組更換新鮮培養(yǎng)基,石斛糖蛋白終濃度分別為25、50、100 μg/mL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液,預(yù)冷PBS清洗2次,吸干PBS后,加入蛋白裂解液RIPA冰上裂解20 min,進(jìn)行總蛋白提取。隨后根據(jù)BCA試劑盒測定蛋白濃度,根據(jù)濃度制備好蛋白樣品備用。SDS-PAGE電泳先采用50 V低電壓跑30 min,后用100 V高電壓跑100 min左右。電泳后在200 mA,60 min冰浴轉(zhuǎn)到PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉膜1.5 h,TBST清洗3次,每次5 min。隨后加入一抗(TGF-β、VEGF、IL-6、TNF-α、IL-1β、P-IκB、IκB、NF-κB、P-NF-κB)4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后與1∶5000稀釋的標(biāo)記有辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)的鼠抗或者兔抗室溫孵育1 h,洗膜后用發(fā)光液顯色,采用image J對目的條帶進(jìn)行灰度分析。

1.2.7 鐵皮石斛糖蛋白對小鼠傷口的愈合影響 動物實驗根據(jù)國際指南進(jìn)行,實驗方案經(jīng)云南農(nóng)業(yè)大學(xué)機(jī)構(gòu)動物倫理委員會批準(zhǔn)。選取20只C57小鼠,每只小鼠背部左右兩側(cè)用刀片劃開約1 cm對稱的兩對刀口,左側(cè)涂抹凡士林,右側(cè)涂抹用凡士林配制的2%鐵皮石斛糖蛋白(預(yù)實驗對0.5%、1%、2%、5%等濃度實驗結(jié)果顯示,當(dāng)濃度為2%時,愈傷效果最佳),每天早晚各一次,連續(xù)7 d,停藥23 d,分別于給藥的第7 d、停藥第5 d(即給藥12 d)、第23 d(即給藥30 d)用乙醚麻醉后拍照觀察實驗結(jié)果。事后用Image Pro對傷口面積進(jìn)行分析,GraphPad Prism 5.01進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析愈合程度。

圖2 鐵皮石斛糖蛋白對RAW264.7細(xì)胞炎癥因子mRNA表達(dá)的影響Fig.2 Effect of DOKMG on the mRNA expression of inflammatory factors in RAW264.7 cells注:*表示與對照組相比兩組之間的差異；*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；圖4～圖7同。

式中:St為測定當(dāng)天的傷口面積,S為手術(shù)當(dāng)天的傷口面積。

1.3 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.01統(tǒng)計作圖軟件進(jìn)行處理,組間比較采用單因素方差分析和獨(dú)立t檢驗,* 表示P<0.05,差異顯著,** 表示P<0.01,差異高度顯著,***,表示P<0.001,差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛糖蛋白對RAW264.7細(xì)胞活力的影響

用MTT法檢測鐵皮石斛糖蛋白對RAW264.7細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果如圖1所示,在實驗劑量下,鐵皮石斛糖蛋白的添加未影響細(xì)胞的存活率。因此,在本實驗條件下,鐵皮石斛糖蛋白在25～200 μg/mL的劑量下對RAW264.7細(xì)胞無毒害作用。

圖1 鐵皮石斛糖蛋白對RAW264.7活力的影響Fig.1 Effect of DOKMG on RAW264.7 vitality

2.2 鐵皮石斛糖蛋白對IL-1β、IL-6、TNF-α炎癥因子基因的影響

圖3 鐵皮石斛糖蛋白對炎性關(guān)鍵酶mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Effect of DOKMG on the mRNA expression of inflammatory key enzymes

圖4 鐵皮石斛糖蛋白促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞分泌炎癥因子Fig.4 DOKMG promotes the secretion of inflammatory cytokines in RAW264.7 cells注:圖B中#表示與LPS組相比兩組之間的差異；#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001。

IL-1β、IL-6、TNF-α是炎癥反應(yīng)中常見的促炎因子,其表達(dá)量可間接反映炎癥反應(yīng)的程度。隨著時間的推移,IL-1β、IL-6、TNF-α的相對表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,且在24 h達(dá)到峰值(圖2A、B、C)。隨著濃度的增加,IL-6、TNF-α的相對表達(dá)量也隨之增加,在100 μg/mL時相對表達(dá)量最高。如圖2D、E、F所示,與24 h的對照組相比,IL-1β在峰值(24 h,100 μg/mL)相對表達(dá)量增加了10.09倍,IL-6在峰值(24 h,100 μg/mL)相對表達(dá)量增加了20.45倍,TNF-α的峰值(24 h,100 μg/mL)相對表達(dá)量增加了0.95倍,均出現(xiàn)極顯著差異(P<0.001)。炎癥因子的基因表達(dá)預(yù)示,在鐵皮石斛糖蛋白刺激24 h的促炎效果最佳,因此后續(xù)炎癥因子檢測均選用24 h這個時間點(diǎn)。

2.3 鐵皮石斛糖蛋白對iNOS、COX-2基因表達(dá)的影響

iNOS可催化L-精氨酸不斷地產(chǎn)生NO,且其產(chǎn)生能活化自身的環(huán)氧合酶COX,而COX-2與炎癥密切相關(guān)[12]。由圖3A、B所示,50、100 μg/mL各時間點(diǎn)的iNOS,COX-2的mRNA的表達(dá)量均在對照組之上。隨著時間的推移,COX-2與iNOS的相對表達(dá)量均出現(xiàn)先上升后下降的趨勢,iNOS在48 h達(dá)到峰值。隨著濃度的增加,COX-2的相對表達(dá)量也隨之增加。與24 h的對照組相比,COX-2在峰值(24 h,100 μg/mL)的表達(dá)量增加了4.14倍,與48 h的對照組相比,iNOS在峰值(48 h,50 μg/mL)的表達(dá)量增加了3.49倍。結(jié)果表明,鐵皮石斛糖蛋白能促進(jìn)炎性關(guān)鍵酶的mRNA的表達(dá)。

2.4 鐵皮石斛糖蛋白對RAW264.7細(xì)胞炎癥因子分泌量的影響

TNF-α作為腫瘤壞死因子,主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,是機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)的重要促炎因子。IL-1β是IL-1家族的一種,同樣具有介導(dǎo)炎癥的作用,在生理狀態(tài)下巨噬細(xì)胞IL-1β的分泌量較少。LPS具有誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞大量分泌IL-1β的作用,當(dāng)細(xì)胞分泌的炎癥因子因分泌量過少而不易檢查時,加入LPS可促進(jìn)檢測的順利完成[13]。如圖4所示,隨著鐵皮石斛糖蛋白的濃度的升高,在其濃度為100 μg/mL時，TNF-α的分泌量呈現(xiàn)極顯著增加(P<0.001),對照組中僅為0.52 μg/mL,而當(dāng)鐵皮石斛糖蛋白濃度上升為100 μg/mL時,分泌量達(dá)到1.99 μg/mL。IL-1β分泌量未能達(dá)到檢測閾值,采用LPS誘導(dǎo)1 h后,再用鐵皮石斛糖蛋白刺激,其分泌量由118.52 pg/mL達(dá)到272.81 pg/mL。此實驗結(jié)果表明,鐵皮石斛糖蛋白能促進(jìn)炎癥因子分泌。

2.5 鐵皮石斛糖蛋白對炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

如圖5所示,經(jīng)過鐵皮石斛糖蛋白處理24 h后巨噬細(xì)胞中的TGF-β、VEGF對鐵皮石斛糖蛋白呈濃度依賴性變化,隨著濃度的升高,其蛋白表達(dá)量逐漸增強(qiáng)。而炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β的蛋白表達(dá)也隨著石斛糖蛋白濃度的增加而增加,且在濃度達(dá)到100 μg/mL時有顯著性差異(P<0.05),TNF-α、IL-1β、IL-6的相對蛋白表達(dá)量分別為1.41、3.01、1.61。

圖5 鐵皮石斛糖蛋白促進(jìn)炎癥因子蛋白表達(dá)Fig.5 DOKMG promotes the expression of inflammatory cytokines

2.6 鐵皮石斛糖蛋白對信號通路NF-κB的影響

為了了解鐵皮石斛糖蛋白促進(jìn)炎癥的機(jī)制是否與NF-κB信號通路有關(guān),檢測不同濃度鐵皮石斛糖蛋白處理后NF-κB信號通路上各項蛋白的變化情況。如圖6所示,當(dāng)鐵皮石斛糖蛋白的濃度達(dá)到100 μg/mL時,NF-κB的上游蛋白IκB的磷酸化程度相比對照組高度顯著(P<0.01)增加了0.99,當(dāng)鐵皮石斛糖蛋白處理的濃度為50 μg/mL時,NF-κB的磷酸化程度顯著(P<0.05)增加了0.85。上述結(jié)果表明,鐵皮石斛糖蛋白能顯著促進(jìn)NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的磷酸化。據(jù)文獻(xiàn)報道,AMPK是一種參與能量穩(wěn)態(tài)的酶,能調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),與NF-κB、COX-2有一定關(guān)聯(lián)[14]。結(jié)果表明,在經(jīng)過25 μg/mL的鐵皮石斛糖蛋白刺激后其磷酸化相比對照組有顯著增強(qiáng)(P<0.05)。因此,鐵皮石斛糖蛋白可能通過AMPK介導(dǎo)的NF-κB信號通路促進(jìn)炎癥發(fā)生。

圖6 鐵皮石斛糖蛋白通過NF-κB信號通路促進(jìn)炎癥發(fā)生Fig.6 DOKMG promotes inflammation through theNF-κB signaling pathway

2.7 鐵皮石斛糖蛋白對小鼠傷口愈合的影響

通過小鼠皮膚損失模型檢測了鐵皮石斛糖蛋白是否具有促進(jìn)傷口愈合的功效。由圖7可知,相對傷口愈合率以時間依賴的方式增加,鐵皮石斛糖蛋白組在第7和第12 d愈合率達(dá)到65.45%、72.45%,比凡士林為對照的組增加了15.20%、12.36%。本結(jié)果結(jié)合前面的細(xì)胞及炎癥因子的檢測,預(yù)示著鐵皮石斛糖蛋白可能在受損早期(炎癥期)通過調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá)來促進(jìn)小鼠皮膚傷口愈合。

圖7 鐵皮石斛糖蛋白對小鼠傷口的作用Fig.7 Effect of DOKMG on wound healing in mice

3 討論與結(jié)論

傷口愈合是一個復(fù)雜和動態(tài)的過程[15],包括炎癥、肉芽組織形成、瘢痕形成三個階段。炎癥階段作為傷口愈合的第一個時期,適度的炎癥反應(yīng)有利于傷口的愈合。巨噬細(xì)胞在創(chuàng)面修復(fù)的炎癥期中起到了重要作用[16-17]。在炎癥的初期,巨噬細(xì)胞能清除壞死組織,細(xì)胞碎片以及其他機(jī)體組織中的異物,分泌轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β),成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)血管生長因子(VEGF)等細(xì)胞因子,刺激成纖維細(xì)胞增殖遷移,有利于膠原沉積,肉芽組織生成。同時促進(jìn)新生血管生成[18]。

NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子,與多種免疫細(xì)胞的增殖,遷移,分化緊密相關(guān)[19]。Park等發(fā)現(xiàn),絲素蛋白通過NF-κB信號通路調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的波形蛋白、周期蛋白、纖維連接蛋白和血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)促進(jìn)傷口愈合[20]。低溫等離子體可通過誘導(dǎo)活性氧ROS的產(chǎn)生,上調(diào)磷酸化的p65,下調(diào)IκB的表達(dá),激活NF-κB信號傳導(dǎo)途徑改變成纖維細(xì)胞周期實現(xiàn)傷口愈合[21]。AMPK是一種能量傳感器,調(diào)節(jié)能量代謝和機(jī)體能量的儲存[22]。AMPKα1是巨噬細(xì)胞功能和表型極化的重要調(diào)節(jié)因子,與NF-κB、COX-2有一定的關(guān)聯(lián)[14]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),以RAW264.7為細(xì)胞系,鐵皮石斛糖蛋白刺激24 h后,NF-κB、IκB的磷酸化隨著其濃度增加相對對照組有一定的顯著性差異,意味著鐵皮石斛糖蛋白可能通過NF-κB途徑調(diào)控炎癥。與此同時,在鐵皮石斛糖蛋白濃度為25 μg/mL時,AMPK的磷酸化也相對對照組有顯著性增加,這可能暗示著AMPK與NF-κB是正相關(guān)關(guān)系,與NF-κB協(xié)同調(diào)控炎癥。

本研究發(fā)現(xiàn)在基因的水平上,鐵皮石斛糖蛋白能在一定時間內(nèi)促進(jìn)炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α和炎癥相關(guān)酶COX-2、iNOS的表達(dá)。且隨著時間的延長促進(jìn)作用有所降低。這種現(xiàn)象可以很好地解釋鐵皮石斛糖蛋白在傷口愈合的炎癥期,先起到促炎的作用,使巨噬細(xì)胞快速清理細(xì)胞碎片和壞死的組織,將體內(nèi)異物排除,隨時間推移,促炎效果減弱,降低持續(xù)炎癥給機(jī)體帶來的傷害。為更好地研究鐵皮石斛糖蛋白的促炎機(jī)理,選用促炎效果最好的24 h這個時間點(diǎn)對后續(xù)實驗研究,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞上清分泌的炎癥因子在鐵皮石斛糖蛋白的刺激下也有所增加,這種現(xiàn)象同樣發(fā)生在通過WB實驗檢測的蛋白水平。Western blot實驗同時發(fā)現(xiàn),鐵皮石斛糖蛋白激活了NF-κB信號通路導(dǎo)致炎癥加深。為驗證鐵皮石斛糖蛋白是否通過調(diào)控炎癥促進(jìn)傷口愈合,建立了小鼠全程皮膚損傷模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn),相對凡士林組,石斛糖蛋白組的愈合率在第7與第12 d都出現(xiàn)了顯著增加(P<0.05)。從體內(nèi)證明了起初的假設(shè)——鐵皮石斛糖蛋白通過調(diào)控炎癥促進(jìn)傷口愈合。

目前跟炎癥相關(guān)的文獻(xiàn),大部分認(rèn)為炎癥是對機(jī)體是有害的,因此,研究的側(cè)重點(diǎn)主要在藥物的抗炎性,而早期適度的炎癥反應(yīng)有利于創(chuàng)面的愈合[23-24],本文評價了炎癥在早期傷口愈合過程中扮演的正向調(diào)節(jié)作用,發(fā)現(xiàn)炎癥有利于傷口愈合的特性,但傷口愈合后期炎癥同樣會延誤受損部位的恢復(fù)。

總之,本研究在評估鐵皮石斛糖蛋白對巨噬細(xì)胞炎癥的調(diào)控的基礎(chǔ)上,對鐵皮石斛糖蛋白促炎的分子機(jī)理進(jìn)行了初步的探索,明確了鐵皮石斛糖蛋白能明顯促進(jìn)炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)。通過本研究,可以為鐵皮石斛糖蛋白愈傷作用的機(jī)理研究提供重要的理論依據(jù),有利于鐵皮石斛在功能食品與膳食方面的開發(fā),促進(jìn)石斛產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。