基于在體單向腸灌流模型的紅車軸草異黃酮類成分滲透性研究

羅立宇，吳宏偉，趙海譽，高文遠

基于在體單向腸灌流模型的紅車軸草異黃酮類成分滲透性研究

羅立宇1，吳宏偉2，趙海譽2，高文遠1

1.天津大學藥物科學與技術學院，天津 300072；2.中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京 100700

研究紅車軸草水提物的異黃酮類腸吸收成分及其腸滲透性，探討其相應機制。采用超高效液相色譜串聯(lián)質譜法（UPLC-MS/MS），建立紅車軸草水提物腸灌流液中異黃酮類成分大豆苷元、大豆苷、染料木苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷的定量分析方法。基于大鼠在體單向腸灌流模型，研究紅車軸草水提物中6種異黃酮類成分在不同小腸段（十二指腸、空腸、回腸）的腸滲透性，并對不同濃度的芒柄花素、芒柄花苷單體成分腸滲透特征進行研究。建立了紅車軸草水提物腸灌流液中6種異黃酮類成分的UPLC-MS/MS定量分析方法，符合方法學要求。紅車軸草水提物灌流液各成分的有效滲透系數（P）均大于5×10-5cm/s，最大者為芒柄花素（P＝3.20，十二指腸），其次為染料木苷（P＝2.19，空腸）；對于不同腸段，各成分P和吸收速率常數（Ka）均存在一定差異，大豆苷元、芒柄花素的十二指腸P最大，其余4種成分的空腸P最大，表明紅車軸草水提物中異黃酮的最佳吸收窗口為十二指腸和空腸；不同濃度芒柄花素、芒柄花苷單體灌流的P、Ka差異均無統(tǒng)計學意義（＞0.05），吸收曲線近似線性，其吸收機制符合被動擴散的特征。本研究初步明確了紅車軸草水提物中異黃酮類成分的腸滲透性及吸收機制，可為質控成分篩選、制劑開發(fā)及臨床合理用藥提供參考。

在體單向腸灌流；滲透性；紅車軸草；異黃酮；芒柄花素；芒柄花苷

紅車軸草為豆科車軸草屬植物紅車軸草L.的花序及帶花枝葉，廣泛分布于世界各地，我國各地均有栽培或野生。該植物主要含黃酮、異黃酮、香豆素、有機酸等化學成分[1]，其中異黃酮類成分為紅車軸草的主要藥效成分，如芒柄花素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、染料木苷等，該類成分具有雌激素樣作用[2-3]，可預防癌癥[4]、抗骨質疏松[5]、改善女性圍絕經期綜合征[6-7]等。

口服給藥是中藥臨床常用途徑，胃腸道吸收是影響口服藥生物利用度和變異性的重要因素，了解藥物的胃腸道吸收機制、吸收部位及腸滲透性，對于確定藥物的劑型、揭示中藥功效物質基礎及其相互作用、指導臨床用藥具有重要意義[8]。目前，預測藥物小腸吸收的方法主要分為體外法、離體法、在體法3種[9]，其中在體單向腸灌流模型能夠維持血液供應，較好地模擬體內環(huán)境，不損傷研究部位的循環(huán)系統(tǒng)和生理環(huán)境，并可精確獲取不同腸段的吸收特征，與人體試驗結果更具有一致性[10-11]。

目前關于紅車軸草中異黃酮類成分的研究主要集中在成分定性、定量及藥理活性，其腸吸收成分及吸收規(guī)律研究迄今尚未見報道。因此，本研究基于大鼠在體單灌流模型，首先采用超高效液相色譜串聯(lián)質譜法（UPLC-MS/MS）分析紅車軸草腸灌流液中主要有效成分，建立其中主要異黃酮類成分芒柄花素、大豆苷元、大豆苷、芒柄花苷、染料木苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的定量分析方法，在此基礎上對紅車軸草水提物的腸吸收特征進行研究，揭示其在不同小腸段（十二指腸、空腸、回腸）的滲透和吸收動力學特征，并以芒柄花素、芒柄花苷為代表，對其吸收機制進行探索，為辨識紅車軸草質控成分、揭示紅車軸草異黃酮類有效成分在體內的吸收機制奠定基礎。

1 儀器、試藥與動物

Acquity UPLC I-Class型超高效液相色譜儀，美國沃特世公司；Xevo TQ-S micro三重四級桿質譜串聯(lián)（配備MassLynx數據采集軟件），美國沃特世公司；BSA2202S、BSA124S分析天平，德國賽多利斯公司；KQ5200E超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Sigma 1-15PK高速離心機，德國希格瑪公司；LSP02-1B注射泵，保定蘭格恒流泵有限公司；Milli-Q超純水制備系統(tǒng)，美國密理博公司。

紅車軸草采自陜西省寧強漢源鎮(zhèn)，經北京中醫(yī)藥大學王晶娟副教授鑒定為豆科車軸草屬植物紅車軸草L.的花序及帶花枝葉；對照品芒柄花素（上海詩丹德標準技術服務有限公司，純度＞98%，批號1559/15005）、大豆苷元（四川省維克奇生物科技有限公司，純度＞98%，批號110794）、大豆苷（成都曼斯特生物科技有限公司，純度＞98%，批號MUST-11121201）、芒柄花苷（成都普菲德生物技術有限公司，純度＞98%，批號130507）、染料木苷（上海源葉生物科技有限公司，純度＞98%，批號P09M8F31018）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（成都普菲德生物技術有限公司，純度＞98%，批號140326）、金絲桃苷（上海源葉生物科技有限公司，純度＞98%，批號Y04A9X62302），芒柄花素、芒柄花苷原料藥（南京普怡生物科技有限公司，純度＞98%，批號140189、141112）；質譜級乙腈、甲酸，美國飛世爾科學世界公司；分析級磷酸、氯化鎂、氯化鈉、磷酸二氫鈉、氯化鉀、氯化鈣、碳酸氫鈉、葡萄糖，北京化工廠。

SD大鼠，雄性，體質量250～280 g，斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司提供，動物許可證號SCXK（京）2019-0010。飼養(yǎng)于SPF級動物實驗室，環(huán)境溫度（23±2）℃，濕度（55±10）%，12 h/12 h光照黑暗循環(huán)，自由攝食飲水。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液

精密稱取各對照品適量，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得單一成分對照品貯備液。精密量取各單一成分對照品貯備液適量于同一50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度約為15 μg/mL的混合對照品貯備液，取混合對照品貯備液繼續(xù)稀釋，得系列不同濃度的混合對照品溶液，用于分析方法的建立。

2.1.2 Krebs-Ringer’s溶液

分別稱取葡萄糖1.4 g、氯化鈣0.37 g，分別單獨溶解。稱取氯化鎂0.02 g、磷酸二氫鈉0.32 g、氯化鉀0.35 g、碳酸氫鈉1.37 g、氯化鈉7.8 g，加水溶解，緩慢加入葡萄糖溶液和氯化鈣溶液，加水稀釋并定容至1000 mL，即得Krebs-Ringer’s溶液（K-R溶液）。

2.1.3 酚紅溶液

取酚紅20 mg，精密稱定，溶于1 L K-R溶液中，混勻，即得濃度20 μg/mL的酚紅貯備液。精密移取酚紅貯備液適量至量瓶中，以K-R溶液稀釋成酚紅濃度分別為5～20 μg/mL的系列溶液，以吸光度對酚紅濃度進行線性回歸，繪制標準曲線。精密移取灌流液0.5 mL，置10 mL試管中定容，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，用紫外-可見分光光度計在波長555 nm處測定吸光度，以標準曲線法計算酚紅含量，用于藥物濃度校正。

2.1.4 紅車軸草水提物及單體成分灌流液

稱取100 g紅車軸草，剪斷，加適量水浸泡30 min，加熱煎煮45 min，紗布過濾，得濾液，藥渣繼續(xù)加水煎煮45 min，過濾，合并2次濾液，加熱濃縮為含原藥材1 g/mL的紅車軸草水提液。精密移取紅車軸草水提液2 mL于50 mL容量瓶中，用酚紅貯備液定容，即得腸灌流實驗所用紅車軸草水提物灌流液。

分別稱取適量芒柄花素、芒柄花苷對照品，加甲醇溶解，配制成所需濃度貯備液，4 ℃貯存。取單體成分貯備液1 mL，用酚紅貯備液稀釋至不同濃度，即得單體成分腸灌流液。

取SD大鼠，禁食不禁水12～18 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉。沿腹中線打開腹腔，選取所需3個腸段：自幽門下2 cm處向下10 cm為十二指腸段，自幽門下15 cm處向下10 cm 為空腸段，自盲腸上端2 cm處向上10 cm為回腸段。于腸段兩端切口，用37 ℃生理鹽水沖洗至無內容物流出，再用空氣將生理鹽水排空，插管并結扎，接恒流泵。注射泵與腸段入口端相連，設置灌流速度為0.2 mL/min，用腸灌流液（預熱至37 ℃）持續(xù)灌流約30 min吸收達到穩(wěn)定后重新計時，每隔15 min用已知質量的EP管在腸段出口端收集流出灌流液[12-13]。實驗結束后剪下被灌流的腸段并處死大鼠，測量腸段長度及內徑，計算EP管內灌流液的質量。所得灌流液經處理后，分別測定各時間點樣品中指標成分含量及相應的酚紅濃度。

2.2 分析方法的建立

2.2.1 色譜條件

采用ACQUITY UPLC BEH Shield RP18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流速0.3 mL/min，柱溫40 ℃，流動相A為0.1%甲酸水、B為乙腈，進樣量2 μL。梯度洗脫程序：0～1.0 min，90%～80%A；1～5.5 min，80%～60%A；5.5～6 min，60%～20%A；6～8 min，20%～5%A；8～8.5 min，5%A；8.5～9 min，5%～90%A；9～10 min，90%～90%A。

2.2.2 質譜條件

采用電噴霧離子源（ESI），正、負離子掃描，多反應監(jiān)測（MRM）方式。毛細管電壓0.5 kV，脫溶劑氣流N2，流速1000 L/h，脫溶劑溫度500 ℃，離子源溫度150 ℃。定性、定量離子對及碰撞能量等質譜參數見表1。

表1 6種化合物質譜參數

化合物 名稱ESI 模式保留時間/min母離子（m/z）定量離子（m/z）錐孔電壓/V碰撞能量/eV 大豆苷+2.42417.08255.034812 染料木苷+3.30433.07271.092416 芒柄花苷+3.78431.09269.125014 大豆苷元+5.18255.06 91.018234 芒柄花素-6.72267.04251.995816 毛蕊異黃酮 葡萄糖苷+2.55447.09285.115216

2.2.3 供試品溶液制備

取大鼠腸灌流液，加甲醇稀釋10倍，用0.22 μm微孔濾膜過濾，進行UPLC-MS/MS分析。

2.2.4 測定法

分別取空白灌流液、混合對照品溶液（50 ng/mL）及供試品溶液，按上述方法進行UPLC-MS/MS分析，結果見圖1。在上述色譜及質譜條件下，紅車軸草灌流液中6種目標成分能實現(xiàn)良好分離，并具有較好的響應值，且無其他成分干擾目標成分的檢測。

2.2.5 方法學考察

2.2.5.1 線性關系與定量限

取“2.1.1”項下混合對照品溶液，用甲醇稀釋為濃度1～300 ng/mL的系列對照品溶液（＝6），進行UPLC-MS/MS分析，以各自定量離子的峰面積為縱坐標、對照品濃度為橫坐標繪制標準曲線，得各成分線性方程和相關系數。結果表明，各成分在測定范圍內線性關系良好。

取“2.1.1”項下對照品混合溶液，逐級稀釋并測定，至信噪比（S/N）＝10，得定量限。結果表明各成分的定量限符合測定要求，方法靈敏度良好。

注：DDG.大豆苷；MRYHTPTTG.毛蕊異黃酮葡萄糖苷；RLMG.染料木苷；MBHG.芒柄花苷；DDGY.大豆苷元；MBHS.芒柄花素

2.2.5.2 精密度試驗

取“2.1.1”項下混合對照品貯備液適量，加甲醇稀釋至濃度50 ng/mL的混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積并計算RSD。結果各成分RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.2.5.3 重復性試驗

取“2.1.4”項下同一灌流液，按“2.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，進行UPLC-MS/MS分析，記錄峰面積并計算RSD。結果各成分RSD均小于3%，表明方法重復性良好。

2.2.5.4 穩(wěn)定性試驗

取“2.1.4”項下同一灌流液，按“2.2.3”項下方法制備，分別于0、2、4、10、20、24 h進行UPLC-MS/MS分析，記錄峰面積并計算RSD。結果各成分峰面積RSD為1.2%～3.9%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.2.5.5 加樣回收率試驗

取目標成分濃度已知的紅車軸草灌流液，按低（50%）、中（100%）、高（200%）濃度分別加入對照品，各濃度平行制備3份，進行UPLC-MS/MS分析，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果表明各成分的回收率良好，RSD均小于5%，方法的準確度符合要求。

2.2.5.6 方法學考察結果

紅車軸草灌流液中6種方法學考察結果見表2。

表2 紅車軸草灌流液中6種成分方法學考察結果

化合物線性范圍/ （ng/mL）相關系數 （R2）定量限/ （ng/mL）精密度 RSD/%重復性 RSD/%穩(wěn)定性 RSD/%平均回收率/% 低濃度中濃度高濃度 大豆苷1.45～2890.999 50.0142.22.53.7 96.5105.2 97.8 毛蕊異黃酮葡萄糖苷1.28～2550.999 90.0131.32.81.5 96.6103.5103.5 染料木苷1.20～2390.999 70.2402.02.83.9 97.8101.4 97.3 芒柄花苷1.66～1660.999 80.0171.21.52.3100.4104.1 97.6 大豆苷元1.51～1510.999 20.3002.10.53.7103.7104.1100.9 芒柄花素1.17～2330.999 70.5002.61.21.2102.5 95.4 97.5

2.3 腸滲透性分析

按“2.1.4”項下方法，收集不同腸段、不同時間點的腸灌流液，按上述方法進行檢測，計算主要成分濃度；并測量相應腸段長度、內徑及灌流液質量，按以下公式計算有效滲透系數（P）和吸收速率常數（Ka）[13]。

式中，Q為灌流液流速（mL/min）；C為灌流液未經腸吸收時各成分的濃度（μg/mL）；C為灌流收集液中各成分濃度（μg/mL）；C（cor）為校正后的灌流收集液中各成分濃度（μg/mL）；L為灌流腸段長度（cm）；為灌流腸段半徑（cm）；＝2πrL，為灌流腸段體積（mL）；M、M分別為腸腔進、出口端灌流液中酚紅濃度。

大鼠腸灌流實驗獲得的P值與人體腸吸收實驗獲得的P值有較好的一致性，并與口服生物利用度具有較好的相關性，根據Zakeri-Milani[14]規(guī)則判定， P＜5×10-5cm/s為低滲透性，P＞5×10-5cm/s為高滲透性。Ka用于評價藥物吸收快慢。

紅車軸草水提物的腸滲透性分析結果見表3?？梢钥闯觯鞒煞?i>P均大于5×10-5cm/s，表明紅車軸草水提物中6種異黃酮類成分滲透性良好，其中P最大者為芒柄花素（P＝3.20±0.94，十二指腸），其次為染料木苷（P＝2.19±0.7，空腸）。對于不同腸段，各成分P和Ka均存在一定差異：P差異最大的成分為染料木苷（＜0.05），空腸（P＝2.19）為回腸（P＝0.34）的6.4倍；其次為大豆苷（＜0.05），空腸（P＝0.93）為回腸（P＝0.18）的5.2倍。各成分的最大P及Ka均出現(xiàn)在十二指腸或空腸段，表明各成分在小腸的主要吸收部位為十二指腸和空腸。另外，對于各腸段（十二指腸、空腸、回腸），苷元（大豆苷元、芒柄花素）的P和Ka均顯著大于其相應的苷（大豆苷、芒柄花苷），差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05），表明在溶液狀態(tài)下，苷元較苷更易于透過腸壁而被吸收。

表3 紅車軸草6種異黃酮類成分不同腸段Peff、Ka（±s，n＝3）

2.4 芒柄花素、芒柄花苷腸吸收機制

為進一步探索紅車軸草異黃酮類成分的腸吸收機制，基于主要吸收部位（空腸），選取芒柄花素、芒柄花苷為代表，考察多濃度的吸收特征，探討其吸收機制。累積吸收曲線見圖2、圖3?？梢姡鄯e吸收量隨灌流液中成分濃度升高而增大，吸收曲線近似于線性，提示腸道對芒柄花素、芒柄花苷的吸收無濃度抑制，其吸收機制以被動擴散為主。由表4、表5可見，芒柄花素P、Ka分別為（1.00～1.20）×10-4cm/s、（9.62～10.98）×10-4/s，芒柄花苷P、Ka分別為（0.54～0.66）×10-4cm/s、（6.05～7.69）×10-4/s，提示濃度對芒柄花素、芒柄花苷的P和Ka沒有影響（＞0.05），進一步表明芒柄花素、芒柄花苷的吸收機制以被動擴散為主。

圖2 芒柄花素空腸累積吸收曲線

圖3 芒柄花苷空腸累積吸收曲線

表4 不同濃度芒柄花素的空腸Peff、Ka（±s，n＝3）

表5 不同濃度芒柄花苷的空腸Peff、Ka（±s，n＝3）

3 討論

本試驗對色譜條件、質譜條件及樣品前處理方法進行了系統(tǒng)考察。色譜方面，比較了甲醇-水和乙腈-水洗脫系統(tǒng)，以及不同品牌色譜柱，結果發(fā)現(xiàn)采用ACQUITY UPLC BEH Shield RP18色譜柱，流動相為乙腈-0.1%甲酸水時，可得到良好的MRM色譜峰形；質譜方面，主要對各成分的碰撞誘導解離電壓進行了優(yōu)化，以便獲得最大響應值；在樣品前處理上，除采用甲醇直接稀釋外，還考察了固相萃取的前處理法，雖然固相萃取能夠更好地去除樣品的中無機鹽、濃縮樣品，但綜合分析效果及分析通量，最終決定采用灌流液直接加甲醇稀釋的方法，該方法快速、準確，目前尚未見相關報道。

紅車軸草主要異黃酮類成分除以上6種外，含量較高的還有染料木素、鷹嘴豆芽素A[1]等，因此前期擬對其進行定量研究。但預實驗結果表明，紅車軸草水提液未能檢出染料木素與鷹嘴豆芽素A，在50%甲醇水超聲提取液中才能檢測到染料木素與鷹嘴豆芽素A，這是由于染料木素與鷹嘴豆芽素A的極性較小，難溶于水?？紤]到紅車軸草在臨床使用中主要以水作為提取溶劑，為保持與臨床用法的一致性，本研究采用水作為提取溶劑，研究紅車軸草水提液中多種異黃酮類成分的滲透性。同時，本研究確定的6種異黃酮類成分也可為基于水煎液的紅車軸草中藥復方的質量控制標志物的篩選提供參考。

紅車軸草水提液6種異黃酮類成分的P均大于5×10-5cm/s，表明紅車軸草水提液異黃酮類成分滲透性良好。由于特定的溶解性、滲透性或物理化學性質，一些藥物只在特定的腸段吸收，稱為吸收窗口[15-16]。不同腸段存在酶活性、黏膜層厚度、膜成分等生理差異，導致對不同化學成分的吸收存在顯著差異[17-19]。本研究中紅車軸草水提液6種異黃酮類成分在不同腸段的吸收均存在一定差異，大豆苷元、芒柄花素在十二指腸的P最大，其余4種成分在空腸的P最大，提示紅車軸草水提物異黃酮類成分的最佳吸收窗口為十二指腸和空腸。

不同濃度芒柄花素和芒柄花苷的空腸段吸收實驗結果顯示，在試驗濃度范圍內，藥物濃度不影響其吸收特征，表明芒柄花素、芒柄花苷腸吸的吸收機制以被動擴散為主。其他成分的吸收機制尚待進一步確認。

與芒柄花素、芒柄花苷單體形式給藥相比，紅車軸草水提取物中芒柄花素、芒柄花苷在相應腸段（空腸）的P顯著提高（＜0.05），表明紅車軸草水提物多成分的綜合效應促進了芒柄花素、芒柄花苷的滲透吸收。

另外，在葛根芩連片有效成分滲透性研究中，基于與本研究相同的實驗方法，得到葛根芩連片中大豆苷元與大豆苷在大鼠空腸段的P分別為0.41×10-4、0.64×10-4cm/s[20]，本研究結果得到紅車軸草水提液中大豆苷元與大豆苷在大鼠空腸段的P分別為1.08×10-4、0.93×10-4cm/s，較其在葛根芩連片中的P值顯著提高，表明中藥不同復方配伍導致的化學環(huán)境變化對有效成分的滲透吸收會產生影響。

綜上，本研究通過對紅車軸草水提物異黃酮類成分的腸滲透性研究，揭示了其主要吸收成分、各成分的吸收特征，以及芒柄花素、芒柄花苷的吸收機制，可為紅車軸草質控成分的篩選、制劑的開發(fā)及臨床合理用藥提供參考和支持。

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Study on Intestinal Permeability of Isoflavones inL. Based onSingle Pass Intestinal Perfusion Model

LUO Liyu1, WU Hongwei2, ZHAO Haiyu2, GAO Wenyuan1

To study the isoflavone intestinal absorption components and intestinal permeability of water extracts ofL.; To explore the corresponding mechanism.An ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method was adopted. A quantitative analysis method for the isoflavone components of isoflavoues daidzein, daidzin, genistein, mullein isoflavone glucoside, formononetin, ononin in the intestinal perfusate of water extracts ofL. was established. In situ single-pass intestinal perfusion model was used to study the intestinal permeability of the six isoflavones in the water extracts ofL. in different small intestine segments (duodenum, jejunum, and ileum). The intestinal penetration characteristics of formononetin and ononin at different concentrations were studied.The UPLC-MS/MS quantitative analysis method of 6 isoflavones in intestinal perfusate ofL. was established, which met the methodological requirements.The effective permeability coefficient (P) of the components from the water extracts were all greater than 5×10-5cm/s. Of the six isoflavones, the maximum value ofPwas formononetin (P=3.20, duodenum), followed with genistein (P=2.19, jejunum). For the different intestinal segments, thePand absorption rate constant (Ka) of the components were different. Daidzein and formononetin had the maximumPat the duodenum. The other four components had the maximumPat the jejunum. The results indicated that the best effective absorption locations for the isoflavones in the water extracts were the duodenum and jejunum. There was no statistical significance inPand Ka (>0.05) for formononetin and ononin in different concentrations, and the absorption curve was approximately linear. Therefore, the absorption mechanisms of formononetin and ononin were both passive diffusion.This study has preliminarily clarified the intestinal permeability and absorption mechanism of isoflavones in the water extracts ofL. The results could provide a contribution for quality control component screening, formulation development and clinical rational medication.

single-pass intestinal perfusion model; permeability;L.; isoflavones; formononetin; ononin

R284.1；R285.5

A

1005-5304(2020)11-0089-07

10.19879/j.cnki.1005-5304.202003739

高文遠，E-mail：pharmgao@tju.edu.cn

（2020-03-28）

（2020-05-19；編輯：陳靜）