基于色譜質(zhì)譜法分析食品中硝基咪唑類藥物殘留的研究進(jìn)展

朱姍姍,吳 澎,徐雙雙,紀(jì)文華,朱文卿,鄭振佳,*(.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點實驗室,山東泰安 708;.北京市理化分析測試中心,有機(jī)材料檢測技術(shù)與質(zhì)量評價北京市重點實驗室,北京 00089;.山東省分析測試中心,齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院),山東濟(jì)南 5004)

硝基咪唑類藥物是一類以硝基咪唑環(huán)為基礎(chǔ)的化合物(圖1),主要包括甲硝唑(Metronidazole,MNZ)、替硝唑(Tindazole,TNZ)、奧硝唑(Ornidazole,ONZ)、洛硝噠唑(Ronidazole,RNZ)、塞克硝唑(Secnidazole,SNZ)、地美硝唑(Dimetridazole,DMZ)等。由于硝基咪唑類藥物抗菌能力較強(qiáng)且硝基類物質(zhì)在生物還原方面有一定優(yōu)勢,所以硝基咪唑類物質(zhì)可以有效檢測細(xì)胞的缺氧部位;多種硝基咪唑類衍生物也可以與DNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)進(jìn)行超分子結(jié)合[1-2],對癌癥、感染、寄生蟲等有一定的抑制作用,被廣泛用于治療畜禽的滴蟲病、厭氧菌感染等疾病[3]。2019年發(fā)布的GB 31650-2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》[4]重新制定獸藥最大殘留限量,其中硝基咪唑類藥物殘留是重點檢測對象。消費者食用含有殘留過量的硝基咪唑類藥物的肉類產(chǎn)品時會引起惡心、嘔吐,甚至畸變、突變、癌變等癥狀,對人體造成危害[1,5],因此對硝基咪唑類藥物進(jìn)行準(zhǔn)確檢測的方法開發(fā)成為獸藥檢測重要方向。本文介紹了硝基咪唑類藥物的分析檢測現(xiàn)狀以及硝基咪唑類物質(zhì)在畜禽動物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物和部位,并且對國內(nèi)外肉類食品中硝基咪唑類物質(zhì)的前處理方法以及檢測方法進(jìn)行研究探討,同時對硝基咪唑類物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的殘留檢測分析方向進(jìn)行展望。

圖1 硝基咪唑類物質(zhì)結(jié)構(gòu)通式Fig.1 General structural formula of nitroimidazole

1 硝基咪唑類藥物殘留檢測研究現(xiàn)狀

目前對于硝基咪唑類藥物的檢測方法日益增加,以硝基咪唑為詞條在中國知網(wǎng)進(jìn)行檢索共檢出自1951年至2019年的文獻(xiàn)1370個,其中自2015年至2019年的文獻(xiàn)為288個,占到文獻(xiàn)總數(shù)的21%,可看出近5年在硝基咪唑方面尤其是檢測方法上的研究相對較多。在Web of Science以及中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫中的文獻(xiàn)進(jìn)行檢索,對2011～2019年發(fā)表的文章中硝基咪唑檢測方法進(jìn)行整理(圖2所示),發(fā)現(xiàn)前處理過程中固相萃取(Solid phase extraction,SPE)技術(shù)的使用可以占到71.58%,而液-液萃取技術(shù)(Liquid-liquid extraction,LLE)以及其他方法占比較少。在檢索中發(fā)現(xiàn)常用的檢測方法高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)((liquid chromatography mass spectrometry,LC-MS)的使用占到92%以上,而氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Gas Chromatography-Mass Spectrometer,GC-MS)近年來較少使用。

圖2 中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫與Web of Science數(shù)據(jù)庫文獻(xiàn)統(tǒng)計情況Fig.2 Literature statistics at CNKI database and Web of Science database

2 硝基咪唑類藥物代謝產(chǎn)物及其分布

常見的硝基咪唑類物質(zhì)的基本信息見表1。硝基咪唑類物質(zhì)進(jìn)入動物機(jī)體經(jīng)過肝臟代謝產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物,部分代謝產(chǎn)物會保留原來物質(zhì)的特性,另一部分會代謝成高于或者低于原有物質(zhì)所具特性的衍生物發(fā)揮作用[5]。目前國內(nèi)外對于硝基咪唑類物質(zhì)的代謝以及代謝物的檢測的文章相對較少。為準(zhǔn)確檢測食品中的硝基咪唑類物質(zhì)的殘留量,需同時對硝基咪唑類藥物的代謝物進(jìn)行分析,硝基咪唑類藥物的代謝過程相對復(fù)雜,大多經(jīng)過肝臟代謝,代謝產(chǎn)物較多[1]。

表1 硝基咪唑類化合物的基本信息Table 1 Basic information of the nitrodetomidine compounds

2.1 甲硝唑

甲硝唑是一種可以抗厭氧菌以及原蟲感染的硝基咪唑類衍生物,屬于濃度依賴型抗菌藥,臨床上可用于治療消化道、呼吸道、組織關(guān)節(jié)等處的厭氧菌感染。甲硝唑主要在肝臟內(nèi)經(jīng)過細(xì)胞色素P-450進(jìn)行代謝,其側(cè)鏈發(fā)生氧化代謝產(chǎn)生羥基化合物和羧基化合物等,動物體內(nèi)代謝產(chǎn)物主要為1-(β-羥乙基)-2-羥甲基-5-硝基咪唑(HM),其次為2-甲基-5-硝基咪唑-1-乙酸(MAA)、1-(β-羥乙基)-2-羧基-5-硝基咪唑(MOOH)等七種物質(zhì),其中羥基代謝物因具備抗菌活性而有臨床意義[10-12]。羥基甲硝唑?qū)ο嗨凭甑幕钚詾槟阁w化合物的30%～65%,其活性要小于甲硝唑[13]。甲硝唑及其代謝物的代謝主要通過尿液排出,以藥物原型形式排出的占6%～18%,HM占24%～28%,MAA占12%～20%,MOOH占8%～12%,14%的劑量經(jīng)糞便排出體外,經(jīng)由糞便排出時,被腸微生物活化為活性中間體,HM也會被微生物所活化,在有些情況下它比母體活性更高,極小部分通過乳汁以及膽汁排出[14-16]。GB 31650-2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》[4]規(guī)定允許甲硝唑的使用,但不得在動物性食品中檢出。

2.2 替硝唑

替硝唑又稱“服凈”,作為硝基咪唑類衍生物的研發(fā)始于1969年,主要用于治療滴蟲病、賈第蟲病的治療[17]。作用機(jī)理為與厭氧菌細(xì)胞內(nèi)的DNA、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)相結(jié)合,導(dǎo)致厭氧菌失去正常的活性,進(jìn)而達(dá)到抑制厭氧菌的作用[18]。替硝唑在藥理上與甲硝唑相比,有更強(qiáng)的抗菌活性、耐受性、半衰期與療效,同時副作用低于甲硝唑[17]。替硝唑代謝的主要場所也是肝臟,60%～80%經(jīng)過腎臟排出,其中20%以原型的藥物排出，其余代謝物以尿液排出,14%經(jīng)皮膚排出,少部分經(jīng)過糞便和乳汁排出[19-21]。

2.3 奧硝唑

奧硝唑的研究始發(fā)于1972年,是第三代硝基咪唑類衍生物,作用機(jī)理為通過還原與生物DNA結(jié)合使其無法轉(zhuǎn)錄進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌死亡,主要用于抗厭氧菌以及滴蟲的感染。奧硝唑半衰期長于替硝唑與甲硝唑,耐受性與副作用優(yōu)于兩者[18]。奧硝唑是一種消旋體,在體內(nèi)代謝過程中可以轉(zhuǎn)化成左奧硝唑和右奧硝唑。左奧硝唑主要通過脂肪側(cè)鏈氧化代謝以及側(cè)鏈水解代謝,它在人體內(nèi)的代謝產(chǎn)物有五種,分別是奧硝唑氧化得到的M1(1-氯-3-(2-羥甲基-5-硝基-1-咪唑基)-2-丙醇)和M2(2-甲基-5-硝基咪唑),水解得到的M3(N-(3-氯-2-羥丙基)乙酰胺)、M4(3-(2-甲基-5-硝基-1-咪唑基)-1,2-丙二醇)、M5(乙酰胺)[22]。左奧硝唑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性方面比奧硝唑以及右奧硝唑要低且安全效果更好[8]。奧硝唑大部分的代謝物主要經(jīng)尿排出,其中游離代謝物與結(jié)合代謝物的比例為1∶2[1]。

2.4 洛硝噠唑

洛硝噠唑又稱羅硝唑,學(xué)名為1-甲基-2-氨基甲酰氧甲基-5-硝基咪唑,主要用來治療畜禽的組織滴蟲病、細(xì)菌感染等疾病,在抗原生動物作用方面它的活性甚至是甲硝唑的5倍[23]。洛硝噠唑在生物體經(jīng)過代謝后主要生成羥甲基甲硝咪唑,其代謝產(chǎn)物可能會與蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)進(jìn)行結(jié)合,推斷該路徑是其抗菌活性的機(jī)理。洛硝噠唑的環(huán)狀結(jié)構(gòu)對人體有致癌性和致突變性的可能[24],由于部分被違法作為飼料添加劑用于提高飼料的轉(zhuǎn)化率以及動物的重量,因此GB 31650-2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》[4]中規(guī)定該組分在食品的獸殘檢測中不得檢出。

2.5 地美硝唑

地美硝唑又稱二甲硝唑,化學(xué)名為1,2-二甲基-5-硝基咪唑,主要用于治療和預(yù)防禽畜的組織滴蟲病以及厭氧菌感染等疾病,由于地美硝唑可以提高飼料的轉(zhuǎn)化率并且可以促進(jìn)動物的生長,所以在飼料中的添加相對較多[25-26]。地美硝唑的代謝物與洛硝噠唑相同,主要是羥甲基甲硝咪唑。由于地美硝唑具有遺傳毒性,對人體有致癌、致畸等作用[26],1995年歐盟委員會第1798/95號法規(guī)規(guī)定禁止其在動物性食品中使用,GB 31650-2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》[4]中規(guī)定在養(yǎng)殖過程中允許地美硝唑進(jìn)行治療,但不得在動物性食品中檢出。

2.6 塞克硝唑

塞克硝唑的化學(xué)名稱為1-(2-羥丙基)-2-甲基-5-硝基咪唑與甲硝唑和替硝唑在結(jié)構(gòu)上相似,已被用于治療阿米巴病、賈第蟲病、毛滴蟲病等疾病[27-28]。塞克硝唑的抗原生蟲的生物活性與鐵氧化還原蛋白還原酶調(diào)節(jié)的硝基的還原作用有關(guān),通過被動擴(kuò)散進(jìn)入微生物體內(nèi),硝基還原后產(chǎn)生一個不穩(wěn)定的中間體(帶一個電子的硝基陰離子),氧化微生物的DNA,使DNA鏈斷裂,破壞了DNA的螺旋結(jié)構(gòu),導(dǎo)致核酸合成受到抑制,引起細(xì)胞死亡[29]。相比較其他硝基咪唑類藥物,塞克硝唑具有更長的半衰期,長時間殘留對生物將會造成傷害[30]。塞克硝唑主要在肝臟代謝,對肝細(xì)胞色素P450酶無誘導(dǎo)或抑制作用,50%的藥物以原型從腎排出,主要代謝物為RP35843[31]。

3 硝基咪唑類藥物及其代謝產(chǎn)物的分析方法

3.1 樣品前處理

硝基咪唑類物質(zhì)容易與基質(zhì)中的大分子物質(zhì)結(jié)合,導(dǎo)致檢測結(jié)果受到影響,因此將樣品通過前處理有效提取硝基咪唑類物質(zhì)是該類成分研究的熱點。常用的前處理方式有液-液萃取法、固相萃取法、分子印跡技術(shù)和QuEChERS方法等。幾種常用的樣品前處理方法比較見表2。

表2 硝基咪唑類物質(zhì)殘留檢測的樣品前處理方法比較Table 2 Comparison of pretreatment methods of nitroimidazoles residues

3.1.1 液-液萃取法 液液萃取技術(shù)是利用樣品中各個組分在液相間溶解度不同,使得被萃取的物質(zhì)在兩液相之間重新分配,達(dá)到分離的目的,該法可以在提取出目標(biāo)物的同時減少溶劑對樣品本身的影響,進(jìn)而減少基質(zhì)的影響[33]。目前液液萃取發(fā)展出鹽析輔助液液萃取法、分散液液微萃取和旋渦輔助分散液液萃取等技術(shù)用于樣品前處理。Hernández-Mesa等[38]利用鹽析輔助液液萃取法作為前處理方法檢測魚卵樣品中硝基咪唑的殘留,結(jié)果顯示MNZ-OH、HMMNI和MNZ的檢測限分別為0.84、0.09和0.05 μg/kg,定量限分別為2.79、0.31和0.15 μg/kg,回收率為80.00%～93.9%。利用鹽析輔助液液萃取技術(shù)作為前處理方法檢測牛奶中硝基咪唑物質(zhì),結(jié)果顯示取得的LOD符合歐盟參考實驗室對MNZ和RNZ推薦的檢測水平均為3 μg/L[39]。王春等[35]利用液液微萃取結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用測定魚血中硝基咪唑的殘留,結(jié)果顯示硝基咪唑類物質(zhì)的檢出限為0.05～0.2 μg/L,定量下限為0.1～0.5 μg/L,回收率為88.4%～105%。

3.1.2 固相萃取技術(shù) 固相萃取技術(shù)是分離和富集藥物殘留物的常用方法,工作原理是通過固體吸附劑保留目標(biāo)分析物與其它基體以及干擾物分離,然后進(jìn)行淋洗、洗脫步驟進(jìn)而使目標(biāo)化合物分離富集[40]。根據(jù)萃取柱中填料的不同,固相萃取技術(shù)可以分為反相固相萃取、正相固相萃取、離子交換型固相萃取等。近幾年衍生出磁性固相萃取(MSPE)、分散固相萃取(dSPE)等新興方法[41]。其中,磁相固相萃取技術(shù)是利用磁性吸附劑對目標(biāo)物進(jìn)行萃取的過程(如圖3所示),分散固相萃取將分散劑分散到樣品溶液中對目標(biāo)物進(jìn)行萃取的過程。Zhong等[42]利用在線固相萃取技術(shù)聯(lián)合液相色譜檢測豬肝臟中硝基咪唑含量,結(jié)果顯示豬肝中加標(biāo)樣品的回收率為81.7%～97.8%,檢測限符合中國對豬和家禽肌肉,腎臟和肝臟中DMZ和MNZ的最大殘留限量(MRL)5和50 μg/kg的要求。Hernández-Mesa等[43]利用固相萃取技術(shù)結(jié)合毛細(xì)管電泳法測定牛奶中硝基咪唑物質(zhì),結(jié)果顯示牛奶樣品中的所有分析物的回收率均超過60%,同時5-NDZ及其代謝物的檢測限低于CRL的建議值3 μg/L。Hu等[44]利用磁性固相萃取技術(shù)萃取地美硝唑,結(jié)果顯示雞蛋,奶粉和豬飼料樣品的加標(biāo)回收率為90.33%～106.20%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于4.54%。方力等[41]利用基質(zhì)固相萃取技術(shù)結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用對動物源性食品中硝基咪唑進(jìn)行檢測,得出MNZ-OH和HMMNI為0.2和0.5 μg/kg。固相萃取技術(shù)存在萃取時間較長,凈化效果差對于分子結(jié)構(gòu)相似度較高的物質(zhì)不能將目標(biāo)物較好的分離,目前分子印跡技術(shù)與固相萃取技術(shù)聯(lián)用提高了萃取的效果,但對于分離、提取多種硝基咪唑類化合物方面研究較少,后期需加強(qiáng)可分離凈化多種硝基咪唑類化合物的萃取劑的研究。

圖3 磁性固相萃取技術(shù)示意圖[45]Fig.3 Schematic diagram of magnetic solid phase extraction technology[45]

3.1.3 分子印跡技術(shù) 分子印跡技術(shù)(Molecular imprinting technology,MIT)的原理類似于抗原抗體、酶與底物的特異性結(jié)合,利用功能單體、交聯(lián)劑以及致孔劑等進(jìn)行混合將模板分子包裹起來形成具有完整性的聚合物,再通過適當(dāng)?shù)姆椒▽⒛０宸肿尤コ?得到具有特異性識別能力的分子印跡聚合物(Molecularly imprinted polymers,MIPs),該過程如圖4所示[46]。Guo等[47]利用分子印跡固相萃取技術(shù)測定蜂蜜中硝基咪唑類物質(zhì),該方法的檢測限為1 μg/kg,低于標(biāo)準(zhǔn)要求的最大殘留限量3 μg/kg。Hu等[44]利用有核-殼結(jié)構(gòu)的新型二咪唑磁性分子印跡聚合物(DMMIP)檢測雞蛋和牛奶中甲硝唑的含量,結(jié)果表示DMZ的檢出限為28.2 μg/L,回收率在90.33%～106.20%之間。該方法的線性范圍比使用HPLC-UV和GC-ECNI-MS的線性范圍大,回收率高[48-49]。目前對于分子印跡聚合物特異結(jié)合的機(jī)理研究較少,導(dǎo)致聚合多種硝基咪唑類物質(zhì)的分子印跡聚合物的研發(fā)尚不完善,今后需研發(fā)效果更好的吸附和聚集多種硝基咪唑類物質(zhì)的分子印跡聚合物。

圖4 分子印跡技術(shù)的示意圖[46]Fig.4 Schematic diagram of molecular imprinting technology[46]注:(a)在模板分子(T)和功能單體(M)之間形成絡(luò)合物;(b)聚合;(c)模板提取;(d)分析物結(jié)合。

3.1.4 QuEChERS技術(shù) QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged and safe)于21世紀(jì)初期開始發(fā)展[34]。此方法的主要過程為鹽析萃取、分散固相萃取凈化和色譜分析[34],操作流程見圖5。高海榮[50]運用QuEChERS結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測魚肉中硝基咪唑類物質(zhì),有效的降低了基質(zhì)效應(yīng),MNZ、DMZ和HMMNI的檢出限分別為0.2、0.2和0.5 μg/kg,該方法具有準(zhǔn)確、高效、靈敏度高的優(yōu)點,適用于魚肉中DMZ、HMMNI及MNZ的快速檢測和日常篩查。Silva等[51]利用QuEChERS結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用測定牛肌肉組織中硝基咪唑等物質(zhì)的殘留,使用該方法硝基咪唑類的定量限范圍為0.007～0.706 μg/kg,定量限在0.011～1.203 μg/kg之間。Shendy等[52]利用QuEChERS結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用測定蜂蜜中硝基咪唑的含量,結(jié)果顯示檢測限為0.12～0.74 μg/kg,回收率為90.96%～104.80%。目前QuEChERS技術(shù)自動化水平有限,但QuEChERS自動化可以確保大量樣品的快速預(yù)富集,有助于節(jié)省成本,同時可以提高生產(chǎn)率和可重復(fù)性。因此,有必要對QuEChERS技術(shù)自動化進(jìn)行探索。

圖5 原始QuEChERS分析技術(shù)的主要步驟示意圖[34]Fig.5 Schematic diagram of the main steps of the original QuEChERS analysis technique[34]

3.2 檢測方法

目前對于硝基咪唑的檢測方法主要是高效液相色譜、液質(zhì)聯(lián)用以及氣質(zhì)聯(lián)用等。氣質(zhì)聯(lián)用方法主要在2000～2010年期間使用作為檢測硝基咪唑的方法之一,自2010年后氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)就開始很少使用。部分硝基咪唑類物質(zhì)及其代謝物的檢測分析條件見表3。

表3 肉類食品中硝基咪唑類藥物的檢測分析條件Table 3 Analysis conditions of nitroimidazoles in meat food

表3總結(jié)了近年來在檢測食品中硝基咪唑類物質(zhì)的文獻(xiàn),可以看出檢測硝基咪唑類物質(zhì)的前處理方式中主要以固相萃取、QuEChERS以及液液萃取技術(shù)為主,其中固相萃取占比最多。固定相多采用C18色譜柱,其他色譜柱使用較少。流動相多采用水、乙腈和甲醇,其他溶劑使用較少。檢測分析主要以液相串聯(lián)質(zhì)譜為主,其中三重四級桿質(zhì)譜儀(QqQ)使用最多,而高分辨質(zhì)譜儀使用較少。高分辨質(zhì)譜儀可以對非目標(biāo)物進(jìn)行篩選且在多殘留分析上具有顯著優(yōu)勢,常用的高分辨質(zhì)譜儀有飛行時間(TOF)質(zhì)譜、四級桿飛行時間(Q-TOF)質(zhì)譜、軌道阱質(zhì)譜(Orbitrap)以及四級桿-軌道阱質(zhì)譜(Q-Orbitrap)等。在多殘留多類別分析上,高分辨質(zhì)譜儀將發(fā)揮著不可替代的作用。前處理技術(shù)上各種微萃取形式不斷出現(xiàn),小型化水平進(jìn)展較大,但自動化水平有待進(jìn)一步提高,且有必要探索更加綠色化學(xué)的新型吸附材料。此外小型色譜柱如:微流液相色譜、毛細(xì)管液相色譜以及納升液相色譜等的使用更適合痕量分析且有利于降低基質(zhì)效應(yīng),但未見在硝基咪唑檢測上的應(yīng)用,有必要進(jìn)一步探索。

4 展望

隨著新獸藥的研發(fā)、獸藥檢測難度的上升和人們對食品安全重視程度的增加,對檢測技術(shù)的要求逐步提高。硝基咪唑獸藥作為常用獸藥,容易在使用過程中引起超標(biāo)的問題,因此加強(qiáng)硝基咪唑代謝途徑及代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的相關(guān)研究,提高硝基咪唑類物質(zhì)檢測水平具有重要意義。目前硝基咪唑類物質(zhì)的檢測方法上以色譜-質(zhì)譜法為主,其前處理方式的材料合成、方法優(yōu)化以及自動化分析是近年來的研究熱點。提高分子印跡技術(shù)、微固相萃取技術(shù)、磁性固相萃取技術(shù)以及結(jié)合新型吸附材料的萃取技術(shù)等對于多目標(biāo)組分的定向凈化與富集效果,是今后獸藥殘留中新材料合成與研發(fā)的重要研究方向。同時,開發(fā)新型定向篩選色譜柱與高分辨質(zhì)譜分析儀的集成應(yīng)用,加快分析速度,提高檢測的靈敏度,建立獸藥類組分的多級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫也是獸藥檢測的重要發(fā)展方向。