白方腐乳開蓋后儲藏過程中生物胺和理化指標(biāo)的變化

馬艷莉,席曉麗,李大偉,梁靜靜,丁玉峰,李素萍,王 頡,孫劍鋒,*(1.南陽理工學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,河南南陽 473004;.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北保定 071000)

腐乳是以大豆為原料,經(jīng)加工磨漿、制坯、培菌、發(fā)酵而成的調(diào)味制品[1],含有蛋白質(zhì)、亞油酸、鈣以及維生素B12等物質(zhì)[2]。它營養(yǎng)豐富而且還能夠起到抗氧化、降膽固醇、降血壓的作用[3-4]。Wang等[5]研究發(fā)現(xiàn)腐乳中的多肽具有清除DPPH自由基的作用;杭梅等[6]用乙醇提取毛豆腐樣品,并測定提取物的體外血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制活性,發(fā)現(xiàn)毛豆腐發(fā)酵第5 d時(shí),60%的乙醇提取物對ACE的抑制活性最高。腐乳按其顏色可分為紅方、青方、白方以及各種花色腐乳,白方腐乳不添加著色劑且外表和內(nèi)部均呈淡黃色[7]。因獨(dú)特的風(fēng)味和外觀而深受大眾喜愛。但腐乳中蛋白質(zhì)和氨基酸含量豐富,容易發(fā)生生物胺累積現(xiàn)象,因而存在安全風(fēng)險(xiǎn)。

生物胺是一類具有生物活性的含氮低分子量有機(jī)化合物,按其結(jié)構(gòu)可分為脂肪族、芳香族和雜環(huán)胺[8]。不同的食品在加工或貯藏過程中產(chǎn)生的生物胺種類和含量也不相同。葡萄酒中腐胺檢出率最高,腐乳中生物胺主要有腐胺、β-苯乙胺、尸胺、酪胺、組胺及色胺等[9]。生物胺的合成需滿足3個(gè)條件:食品中存在前體物質(zhì)氨基酸;含有能分泌氨基酸脫羧酶的微生物;有利于微生物生長以及氨基酸脫羧酶發(fā)揮作用的環(huán)境[10]。少量生物胺可以促進(jìn)機(jī)體正?；顒?但過量攝入可能會引起中毒等問題,而且中毒程度因人而異。目前,一些國家和組織對部分食品中生物胺的含量制定了限量標(biāo)準(zhǔn),如美國限定可食用魚類中組胺的含量應(yīng)低于50 mg/kg,我國限定可食用魚類中組胺的含量為200～400 mg/kg[11]。

腐乳類似奶酪,具有可涂抹的奶油稠度和獨(dú)特的味道,主要和米飯或饅頭一起食用,是一道受歡迎的配菜[12]。目前,對腐乳的研究大部分集中在分析微生物多樣性,優(yōu)化加工條件以及營養(yǎng)價(jià)值和功能成分的挖掘等方面。但腐乳開蓋后,通常不能一次性全部食用,需對其儲藏,而對腐乳在不同儲藏條件下生物胺含量變化規(guī)律的研究較少。本研究以開蓋的白方腐乳為實(shí)驗(yàn)材料,對其在不同儲藏條件下生物胺和理化指標(biāo)的變化進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白方腐乳(生產(chǎn)日期2019年11月3日) 2019年11月15日購于河北省保定市當(dāng)?shù)厣虉?并當(dāng)天進(jìn)行實(shí)驗(yàn);丹磺酰氯 純度≥98%,上海麥克林試劑有限公司;乙腈 色譜級,上海Merck試劑有限公司;腐胺、色胺、組胺、苯乙胺、精胺、酪胺、尸胺和亞精胺 純度≥97%,美國Sigma-Aldrich試劑有限公司;氨水、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、丙酮、濃鹽酸(37%)、甲醛(38%)和乙酸銨 分析試劑,天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

CP214電子分析天平 奧斯豪儀器上海有限公司;2695型高效液相色譜儀 美國Waters儀器有限公司;Eclipse XDB-C18液相色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm) 美國Agilent儀器有限公司;STARTER2100酸度計(jì) 寧波新芝生物科技有限公司;Novasina CH-8533水分活度測定儀 瑞士步琦有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白方腐乳處理方法 將從超市購買的8瓶同一生產(chǎn)日期白方腐乳開蓋后,在不同溫度條件下(4、15、25和35 ℃)各放置2瓶,儲藏0、15、30、45和60 d后,取樣測定其生物胺含量和理化指標(biāo)。

1.2.2 生物胺的測定 生物胺含量按照李大偉等[13]的方法進(jìn)行測定。具體方法如下:在5 mL試管中依次加入1 mL待衍生樣品、200 μL氫氧化鈉溶液(2 mol/L)、300 μL飽和碳酸氫鈉溶液、1 mL丹磺酰氯溶液(10 mg/mL),渦旋1 min,混勻后置于42 ℃恒溫水浴中并在暗黑條件下衍生45 min,取出,加100 μL氨水避光反應(yīng)30 min后,用乙腈定容至5 mL最后,有機(jī)膜過濾(0.45 μm)后用于高效液相色譜分析。色譜條件:色譜柱為Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱溫40 ℃,流速1 mL/min,進(jìn)樣量20 μL,紫外檢測波長254 nm,流動相A為0.1 mol/L的乙酸銨,流動相B為乙腈。

1.2.3 理化指標(biāo)的測定

1.2.3.1 水分活度的測定 水分活度(Water activity,Aw)用水分活度儀進(jìn)行測定,同一樣品重復(fù)測定3次。

1.2.3.2 pH的測定 pH的測定參照劉振鋒[14]的方法。

1.2.3.3 氨基態(tài)氮的測定 氨基態(tài)氮(Amino acid nitrogen,FAAN)含量按照SB/T 10170-2007的方法進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 22.0分析顯著性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果由平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,P<0.05表示差異顯著。用SPSS 22.0對生物胺含量和理化指標(biāo)作Pearson相關(guān)性分析。繪圖使用Origin 8.6。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度下白方腐乳中生物胺組成及含量的動態(tài)變化

不同溫度條件下(4、15、25和35 ℃)開蓋白方腐乳儲藏過程中生物胺的變化如表1所示。在4 ℃儲藏期間,白方腐乳中色胺、腐胺、組胺、酪胺、精胺和亞精胺儲藏至第15 d時(shí)含量達(dá)到最大,此時(shí),總胺含量最高為835.51 mg/kg,其中亞精胺、色胺和組胺的含量增加較大,共占總胺含量約68.92%;苯乙胺和尸胺貯藏至第45 d時(shí)含量達(dá)到最大,分別為39.83和75.57 mg/kg。在整個(gè)儲藏過程中,總胺含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在15 ℃儲藏期間,白方腐乳中尸胺的含量隨著儲藏時(shí)間的延長而升高,在第60 d達(dá)到最大值65.99 mg/kg;在整個(gè)儲藏過程中,生物胺呈現(xiàn)出波動的趨勢;酪胺、色胺、腐胺、亞精胺和精胺的含量均在第15 d達(dá)到最高,苯乙胺含量在第60 d達(dá)到最高,組胺含量在第30 d達(dá)到最大。在25 ℃下儲藏,白方腐乳中色胺和酪胺含量在剛開蓋時(shí)最高,二者大體呈下降趨勢;亞精胺在儲藏至第60 d才檢測到,總胺含量隨著儲藏時(shí)間的延長而增加,在第60 d時(shí),占總胺比重較大的是組胺(43.16%)和亞精胺(27.96%)。在35 ℃下儲藏,色胺、苯乙胺、尸胺、組胺和亞精胺的變化趨勢大體與25 ℃下呈現(xiàn)的趨勢一致。在第15 d組胺和酪胺含量突增,此時(shí)總胺含量也增高。

表1 開蓋白方腐乳在不同儲藏條件下生物胺含量的變化Table 1 Changes of biogenic amines in the opened sufu products under different storage conditions

綜上所述,以美國食品藥品監(jiān)督管理局規(guī)定的限量標(biāo)準(zhǔn)為參照,總胺含量在安全范圍內(nèi);在25和35 ℃貯藏的白方腐乳苯乙胺含量比4和15 ℃的要高,說明25和35 ℃下苯乙胺更容易累積;組胺在25和35 ℃含量增長較快;酪胺在35 ℃儲藏至第15 d時(shí),其含量超出建議標(biāo)準(zhǔn),其余不同溫度不同貯藏時(shí)間酪胺含量均<100 mg/kg。在貯藏期間腐胺和尸胺的含量較低,盡管二者對人體的毒性相對較弱,但在一定程度上可增強(qiáng)組胺與酪胺的中毒風(fēng)險(xiǎn),主要是由于腐胺和尸胺可抑制組胺代謝酶與甲基轉(zhuǎn)移酶的活性[15-16]。Bover等[17]在研究貯藏條件對發(fā)酵風(fēng)干腸中生物胺含量的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),貯藏在4 ℃下比貯藏在19 ℃下生物胺含量低。由此可知,低溫儲藏對生物胺的累積有一定的抑制作用,因?yàn)榈蜏靥幚碓谝欢ǔ潭壬峡梢种撇糠治⑸锷L并降低氨基酸脫羧酶活性。

2.2 不同溫度下白方腐乳中理化指標(biāo)的變化

2.2.1 不同溫度下水分活度(AW)的變化 水分活度能反映產(chǎn)品中潛在微生物對水分的可利用性,不同微生物生長所需的水分活度都有一定的閾值。不同溫度條件下(4、15、25和35 ℃)開蓋白方腐乳儲藏過程中AW的變化如圖1所示,AW在0.85～0.92之間。在貯藏過程中,4 ℃儲藏的白方腐乳AW相對較低。在15、25、35 ℃下儲藏的前15 d,AW均呈下降趨勢,其中35 ℃下白方腐乳的AW下降速度最快。不同溫度下儲藏,開蓋白方腐乳的AW均高于0.85,有利于微生物生長以及酶的分泌,可能會促進(jìn)樣品中生物胺的積累。

圖1 白方腐乳開蓋后不同貯藏溫度條件下水分活度(Aw)的變化Fig.1 The change of water activity of opened sufu under different storage temperature

2.2.2 不同溫度下pH的變化 pH能引起酶活性的改變,而氨基酸脫羧酶對生物胺的產(chǎn)生有較大影響。因此,pH可間接影響生物胺的合成。肖洪等[18]發(fā)現(xiàn)在低的pH環(huán)境下細(xì)菌為了抵抗外部酸性環(huán)境會產(chǎn)生更多的氨基酸脫羧酶。不同溫度條件下(4、15、25和35 ℃)開蓋白方腐乳儲藏過程pH的變化如圖2所示,pH均在5.4～6.8之間,4 ℃下白方腐乳的pH相對較低,且波動范圍較小。當(dāng)儲藏至30～45 d,35 ℃下放置的白方腐乳樣品pH呈現(xiàn)大幅度增加,其它溫度下儲藏的白方腐乳pH變化較小,這可能與樣品中生物胺等堿性物質(zhì)的含量有關(guān)。

圖2 白方腐乳開蓋后不同貯藏溫度條件下pH的變化Fig.2 The change of pH of opened sufu under different storage temperature

2.2.3 不同溫度下氨基態(tài)氮(FAAN)的變化 樣品中各種氨基化合物所含氮的總量為氨基態(tài)氮含量,通過對氨基態(tài)氮的測定可以了解蛋白質(zhì)的水解程度[19-20]。不同溫度條件下開蓋白方腐乳儲藏過程中氨基態(tài)氮含量變化如圖3所示。白方腐乳在4、15、25、和35 ℃貯藏時(shí),氨基態(tài)氮含量達(dá)到的最大值分別為0.31、0.41、0.22、0.43 g/100 g。15 ℃貯藏的白方腐乳氨基態(tài)氮含量最高時(shí),相應(yīng)的總胺含量也達(dá)到最大。Lu等[21]將40份醬油樣品分成氨基氮低含量、中含量和高含量組,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在氨基氮含量高的樣品中,生物胺的總含量普遍較高,而氨基氮含量低的醬油樣品中,生物胺的總含量較低,說明氨基態(tài)氮含量與生物胺含量存在一定的正相關(guān)關(guān)系。

圖3 白方腐乳開蓋后不同貯藏溫度條件下氨基態(tài)氮含量的變化Fig.3 The change of FAAN of opened sufu under different storage temperature

2.3 生物胺與理化指標(biāo)的相關(guān)性分析

對生物胺與理化指標(biāo)進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析,結(jié)果見表2。雙變量分析結(jié)果表明,腐胺與精胺、亞精胺,苯乙胺與尸胺、組胺的相關(guān)性較高;尸胺與組胺相關(guān)性最高(r=0.824,P<0.01);苯乙胺與腐胺、精胺,酪胺與精胺呈顯著正相關(guān)。這可能與菌株種類以及生物胺的轉(zhuǎn)化相關(guān)。例如,腐胺在亞精胺合成酶的催化下形成亞精胺,亞精胺在精胺合成酶的作用下形成精胺[22]。此外,精氨酸會水解或脫羧成鳥氨酸或胍丁胺,因而是腐胺合成的重要前體物質(zhì)。胍丁胺作為腐胺的起始底物,主要有胍丁胺酶路徑和胍丁胺亞氨基路徑,而菌株的種類決定了產(chǎn)生腐胺的具體路徑[23]。pH與苯乙胺呈顯著正相關(guān),與其余生物胺之間呈弱相關(guān);氨基態(tài)氮與苯乙胺、尸胺、組胺呈顯著正相關(guān)。大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)氨基態(tài)氮與生物胺之間存在一定的正相關(guān)關(guān)系[24]。Andic等[25]發(fā)現(xiàn)含氮量較高的干酪樣品中總胺含量也較高。

表2 生物胺與理化指標(biāo)的相關(guān)性Table 2 Correlation between biogenic amines and physical and chemical indicators

3 結(jié)論

生物胺是影響腐乳品質(zhì)和食用安全的重要因素,其含量可作為評價(jià)食品質(zhì)量安全的重要指標(biāo)之一。本研究采用柱前衍生高效液相色譜分析開蓋白方腐乳生物胺,結(jié)果表明,8種生物胺均有檢出,總胺含量在151.11～835.51 mg/kg之間,未超過食品中生物胺的總含量建議值1000 mg/kg,但組胺含量超過100 mg/kg,這可能使白方腐乳存在潛在的中毒風(fēng)險(xiǎn)。通過對理化指標(biāo)的分析,發(fā)現(xiàn)水分活度在0.85以上,超出病原體生長的安全界限,需要采取冷藏或其它措施。本研究為開蓋的白方腐乳提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù),之后將進(jìn)一步研究白方腐乳開蓋后儲藏過程中微生物和風(fēng)味物質(zhì)的變化,這可能有助于確定開蓋腐乳的最佳食用期,以保證腐乳的食用口感和安全性。