膳食補(bǔ)充n3多不飽和脂肪酸保護(hù)大鼠衰老皮膚膠原的作用及機(jī)制研究

薛 歡,王佩茹,徐雨婷,韓佳彤,張國龍,王秀麗,*(.安徽醫(yī)科大學(xué)上海皮膚病臨床學(xué)院,上海 00443;.同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院光醫(yī)學(xué)研究所，上海市皮膚病醫(yī)院,上海 00443)

衰老是腫瘤、免疫功能障礙等疾病發(fā)生的最大單一風(fēng)險因素[1]。皮膚老化可分為內(nèi)源性老化和外源性老化,內(nèi)源性老化即自然老化,因年齡的增長而發(fā)生。外源性老化主要由紫外線照射(ultraviolet radiation,UVR)引起,又稱為光老化。自然老化真皮細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)中多種膠原的減少和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)增加,造成皮膚容量減少,臨床可表現(xiàn)為皮膚變薄,出現(xiàn)細(xì)紋、彈性降低等現(xiàn)象。皮膚自然老化的病理生理改變是老年皮膚生理功能障礙[2]、皮膚免疫狀態(tài)紊亂及皮膚腫瘤發(fā)生的天然因素[3]。

多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)是人體所必需的脂肪酸,其中n-3多不飽和脂肪酸(n-3 PUFAs),在海洋魚類及某些堅果中含量較為豐富,已被證明在心血管疾病、腫瘤、皮膚保護(hù)等方面都有有益作用[4-5]。N-3 PUFAs主要包括α-亞麻酸(α-linolenic acid,ALA)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)及二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)等,在人體內(nèi)不能合成,必須從食物中供給,屬于必需脂肪酸,但現(xiàn)代生活日常飲食中其含量一般較少。其來源主要為海洋生物或海洋魚類,如鯖魚、沙丁魚、鯡魚。近年研究發(fā)現(xiàn),n-3 PUFAs對包括光敏性疾病、光老化和皮膚腫瘤等在內(nèi)的皮膚病均有防治作用[6-7]。團(tuán)隊前期研究發(fā)現(xiàn),魚油作為n-3 PUFAs的膳食補(bǔ)充劑對大鼠表皮屏障及部分膠原基因表達(dá)有一定促進(jìn)作用[8],并可減少急性光損傷的炎癥反應(yīng)[9],但是否對皮膚自然老化有保護(hù)作用尚缺乏研究。膳食補(bǔ)充n-3 PUFAs簡單易行,可按推薦劑量長期服用,無副作用[10],適合防治包括自然老化等需要長期堅持治療的慢性疾病或狀態(tài)。本文通過膳食干預(yù),探索膳食補(bǔ)充n-3 PUFAs對自然老化大鼠皮膚真皮膠原的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雌性F344大鼠 15只,SPF級,6周齡,購于上海雷根生物科技有限公司;特殊飼料 由美國賓夕法尼亞州的戴茨公司定制,具體配方如表1所示，前期實驗中質(zhì)譜分析顯示老化n-3 PUFAs組飼料富含EPA及DHA,總n-3 PUFAs脂肪酸明顯較老化對照組多[11]；甲醛溶液、無水乙醇(分析純)、二甲苯(分析純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;異氟烷 深圳瑞沃德生命科技有限公司;Weigert彈力纖維染色試劑盒、Masson三色染色試劑盒 安徽雷根生物技術(shù)有限公司;BCA試劑盒 上海雅酶生物科技有限公司;大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(Krishgen Biosystems)、蘇木素染液、伊紅染液、中性樹膠 上海威奧生物科技有限公司;總RNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Hifair? Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus))、QpcR試劑盒(Hieff? qPCR SYBR Green Master Mix(No Rox)) 上海翊圣生物科技有限公司。

表1 老化對照組及老化n-3 PUFAs組的飼料成分Table 1 Feed composition of aging control group and aging n-3 PUFAs group

RM2235石蠟切片機(jī) 德國徠卡微系統(tǒng)有限公司;數(shù)顯恒溫鼓風(fēng)干燥箱 中國上海精宏有限公司;4 ℃/-20 ℃冰箱 青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司;高壓消毒鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;超低溫冰箱、冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf;移液槍 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;醫(yī)用離心機(jī) 湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司;光學(xué)顯微鏡 奧林巴斯(中國)有限公司;高通量組織研磨儀 背景鼎昊源科技有限公司;酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad;PCR儀 美國ABI;熒光定量PCR儀 美國羅氏。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物及處理 將大鼠隨機(jī)分為3組,分別為年輕組、老化n-3 PUFAs組和老化對照組。年輕組大鼠在9月齡時留取皮膚組織。老化n-3 PUFAs組和老化對照組大鼠在14月齡時開始接受特殊飲食共8個月,并在22月齡時留取皮膚組織。老化n-3 PUFAs組飼料的脂質(zhì)部分由32%的魚油及68%的混合脂肪組成,以魚油作為n-3 PUFAs的來源。老化對照組飼料的脂質(zhì)部分則全部由混合脂肪組成?；旌现灸M正常日常飲食中的脂肪模式。除此之外,飼料中其余成分均與普通飼料相當(dāng)。

1.2.2 組織取材及標(biāo)本制備 使用異氟烷(瑞沃德)將大鼠麻醉,并將大鼠背部毛發(fā)去除干凈。用5 mm環(huán)鉆鉆取大鼠背部皮膚組織2塊,其中1塊放入4%甲醛溶液中固定,用于制作組織病理切片;另1塊組織液氮速凍后放入-80 ℃保存,用于酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)及實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)實驗。

1.2.3 組織切片及染色 大鼠皮膚組織在甲醛中固定24 h后,石蠟包埋及切片。進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(HE染色)、Masson染色及Weigert彈力纖維染色。光鏡下觀察皮膚病理學(xué)改變。每張切片隨機(jī)選取3個視野,使用Image-Pro Plus 6.0分析系統(tǒng),計量膠原纖維占真皮層的面積比及表皮厚度。

1.2.4 大鼠皮膚膠原的測定 4 ℃下將大鼠皮膚剪碎,加入PBS進(jìn)行研磨,12000 r/min離心,留取上清液進(jìn)行實驗。BCA法檢測上清液中的總蛋白濃度。ELISA檢測上清液中的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量,并用總蛋白濃度進(jìn)行校正。

1.2.5 RT-qPCR分析 液氮研磨法將大鼠皮膚組織研磨成粉末狀后,使用RNA提取試劑盒提取組織RNA,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將抽提的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,qPCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增,實時熒光定量PCR儀檢測檢測Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型膠原及MMP1、MMP9、MMP10、MMP13的mRNA表達(dá)量并記錄數(shù)據(jù)。使用SYBR Green Ⅱ作為熒光染料,實驗參數(shù)設(shè)置:95 ℃預(yù)熱儀器10 min;變性:95 ℃持續(xù)10 s;退火加延伸:60 ℃持續(xù)30 s;總循環(huán)40次。結(jié)果根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線由計算后得出。本實驗重復(fù)3次以確?？煽啃浴?nèi)參基因及所檢測基因所需的引物如表2所示。

表2 RT-qPCR所需引物Table 2 Primers for RT-qPCR

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 膳食補(bǔ)充n-3 PUFAs對老化大鼠表皮及真皮結(jié)構(gòu)的影響

采用HE染色觀察皮膚結(jié)構(gòu),Masson染色觀察真皮膠原纖維,weigert染色觀察彈力纖維。根據(jù)大鼠年齡分期,9月齡大鼠尚處于成年早期,22月齡大鼠已進(jìn)入老年期。如圖1所示,HE染色顯示年輕組皮膚組織結(jié)構(gòu)完整,表皮呈波浪狀,真皮膠原排列整齊;老化大鼠表皮變平變薄,真皮膠原纖維排列紊亂。老化n-3 PUFAs組比老化對照組的真皮膠原排列更為整齊。Masson染色顯示年輕大鼠真皮中的膠原纖維緊密排列,老化大鼠的膠原纖維減少,可見變性斷裂且分布不均。老化n-3 PUFAs組比老化對照組老化大鼠膠原纖維的排列相對整齊,斷裂減輕。Weigert染色中,彈力纖維表現(xiàn)為細(xì)長型線狀纖維,分散在膠原纖維中。大鼠皮膚中的彈力纖維含量較少(如圖中箭頭所示),在3組中未觀察到明顯的數(shù)量及形態(tài)差別。

圖1 各組大鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)變化Fig.1 Changes in skin tissue structure of each group rats注:A:HE染色(200×);B:Masson染色(200×);C:Weigert染色結(jié)果(400×)。

使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對膠原纖維面積占真皮層面積的比值及表皮厚度進(jìn)行測定,如表3所示，發(fā)現(xiàn)老化大鼠膠原纖維含量較年輕大鼠高度顯著減少(P<0.001),老化n-3 PUFAs組膠原纖維減少程度較老化對照組顯著改善(P<0.01)。老化大鼠表皮厚度較年輕組顯著減少(P<0.05),老化n-3 PUFAs組和老化對照組的表皮厚度無顯著差異(P>0.05)。

表3 各組大鼠表皮厚度及膠原纖維占比統(tǒng)計結(jié)果Table 3 Statistics of epidermal thickness and collagen proportion in each group

2.2 膳食補(bǔ)充n-3 PUFAs對老化皮膚Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量的影響

老化大鼠的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)量均較年輕大鼠少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。老化n-3 PUFAs組大鼠的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)均較老化對照組多,差異具有有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖2。

圖2 ELISA檢測各組大鼠皮膚Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達(dá)Fig.2 The expression of type Ⅰ and type Ⅲ collagen of rats in each group注:Y:年輕組大鼠;C:老化對照組;F:老化n-3 PUFAs組;*表示差異顯著P<0.05,**表示差異極顯著P<0.01,***表示差異高度顯著P<0.001,ns表示無統(tǒng)計學(xué)意義;圖3～圖4同。

2.3 膳食補(bǔ)充n-3 PUFAs對老化皮膚Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型膠原基因表達(dá)的影響

老化大鼠的Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型膠原mRNA相對表達(dá)量均較年輕大鼠少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。老化n-3 PUFAs組大鼠的Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA相對表達(dá)量均較老化對照組多,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

圖3 各組大鼠皮膚Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型膠原mRNA相對表達(dá)水平Fig.3 Relative mRNA expression levels of collagen Ⅰ,Ⅲ,Ⅳ and Ⅴ in each group

2.4 膳食補(bǔ)充n-3 PUFAs對老化皮膚基質(zhì)金屬蛋白酶的影響

老化對照組大鼠的MMP1、MMP9、MMP10、MMP13的mRNA相對表達(dá)量均較年輕大鼠多,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。老化n-3 PUFAs組大鼠皮膚的MMP10、MMP13的mRNA相對表達(dá)量較老化對照組減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 各組大鼠皮膚MMPs mRNA相對表達(dá)水平Fig.4 Relative mRNA expression levels of MMPs in each group

3 討論與結(jié)論

隨著老齡化人口的比例不斷增加,越來越多的老年人飽受年齡相關(guān)皮膚病的困擾。老化皮膚易受干燥瘙癢、皮膚感染、皮膚損傷愈合延遲、老年性自身免疫性病及皮膚惡性腫瘤的困擾[12]。氧化損傷在衰老中起著核心作用。細(xì)胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)由絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)介導(dǎo)。老化皮膚MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活增加。激活的MAPK通路可介導(dǎo)組織炎癥反應(yīng)及激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)轉(zhuǎn)錄因子的合成,從而抑制膠原的合成,并通過上調(diào)MMPs基因轉(zhuǎn)錄水平[13-14]促進(jìn)膠原降解。n-3 PUFAs具有抑制炎癥和氧化反應(yīng)的作用,目前研究認(rèn)為其抑制機(jī)制為下調(diào)MAPK通路活性[15]?；谝陨蠙C(jī)制基礎(chǔ),本實驗就n-3 PUFAs是否可以保護(hù)衰老皮膚中的膠原做以研究。

自然老化皮膚全層都會發(fā)生退行性變化,真皮層的變化最明顯[16]。真皮ECM由膠原、蛋白多糖、黏多糖等構(gòu)成。膠原是真皮最主要的成分,老化皮膚膠原進(jìn)行性丟失和破壞,不僅會損害皮膚結(jié)構(gòu),導(dǎo)致皮膚結(jié)構(gòu)和外觀的改變,且會引起皮膚功能障礙及老年性皮膚疾病,例如傷口愈合延遲和皮膚腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17]。真皮膠原纖維中,Ⅰ型膠原占膠原總量的80%～90%,Ⅲ型膠原占8%～12%,Ⅴ型膠原常和I型和III型膠原形成混合纖維。Ⅳ型膠原分布在皮膚基底膜。蛋白多糖和黏多糖圍繞并嵌入真皮中的纖維和基質(zhì)中,負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)真皮含水量,影響皮膚彈性和屏障功能。皮膚老化過程中,膠原合成減少和降解增多都會使得膠原穩(wěn)態(tài)破壞,真皮膠原缺乏[18-19]。大鼠的皮膚真皮層較小鼠厚,更適合研究真皮膠原改變,故本研究采用大鼠皮膚自然老化模型進(jìn)行實驗。

本研究發(fā)現(xiàn),自然老化大鼠表皮變薄,真皮膠原含量減少。膳食補(bǔ)充n-3 PUFAs可改善老化真皮中Ⅰ、Ⅲ膠原的含量。通過qPCR對Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型膠原基因的表達(dá)進(jìn)行相對定量分析,結(jié)果與病理組織學(xué)及蛋白結(jié)果表現(xiàn)相符,各型膠原mRNA表達(dá)量均隨老化的發(fā)生而減少,并且老化n-3 PUFAs組Ⅰ型及Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)量明顯比老化對照組多。Ⅰ型膠原主要維持皮膚韌性,Ⅲ型膠原主要維持皮膚彈性。Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量豐富,是老化過程中真皮改變最明顯的兩種成分,尤其是Ⅰ型膠原,與衰老顯著相關(guān)[20]。膠原蛋白水平和mRNA水平的改變表明膳食補(bǔ)充n-3 PUFAs可促進(jìn)皮膚中的Ⅰ、Ⅲ型膠原合成,延緩老化過程。Ⅳ、Ⅴ型膠原在皮膚中含量微少,老化皮膚中其減少可能與真皮-表皮交界處及真皮膠原纖維結(jié)構(gòu)變化相關(guān)[21-22]。本研究中Ⅳ、Ⅴ型膠原mRNA在老化n-3 PUFA組和老化對照組中未檢測到差別,亦可能與其含量少,超過檢測敏感度有關(guān)。如前所述,老化皮膚組織氧化應(yīng)激狀態(tài)激活的MAPK通路可觸發(fā)下游AP-1轉(zhuǎn)錄因子活性增加,進(jìn)而抑制真皮膠原的合成[23],n-3 PUFAs又可抑制MAPK通路活化,故推測n-3 PUFAs補(bǔ)充促進(jìn)Ⅰ、Ⅲ型膠原合成可能通過抑制老化皮膚的MAPK通路發(fā)揮作用。

膠原降解主要由MMPs調(diào)節(jié)[24]。MMPs升高致使ECM受損,受損的ECM形成的微環(huán)境不利于成纖維細(xì)胞的功能,并促使成纖維細(xì)胞產(chǎn)生更多的MMPs,從而形成不良循環(huán)[25]。老化皮膚中增加的MMPs亦能影響到血管重建作用中的病理性破壞[26],在腫瘤入侵周圍組織及轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮了重要作用。故降低MMPs不僅具有積極的抗老化意義,也可對老化所致皮膚病有潛在益處。MMPs分為五類,分別為膠原酶、明膠酶、基質(zhì)酶、基質(zhì)溶解素、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶。皮膚中MMPs的主要來源是表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)在老年人皮膚中,MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、MMP10、MMP11、MMP13、MMP17、MMP26和MMP27的水平升高[24,27-28],即真皮損傷的主要介質(zhì)并非是單一的MMP,而是多種MMPs的聯(lián)合作用。眾多酶中,只有膠原酶可以降解天然Ⅰ型膠原中的三螺旋結(jié)構(gòu)[29]。MMP1、MMP13屬于膠原酶,它們有相似的結(jié)構(gòu)和功能。目前認(rèn)為MMP1是分解膠原作用最強(qiáng)的酶,在自然老化、光老化及多種腫瘤組織中都會升高。MMP13降解Ⅰ、Ⅲ型膠原的效果較MMP1弱[30]。MMP3、MMP10屬于間質(zhì)酶,只能降解被膠原酶分解的膠原以及其他ECM蛋白。間質(zhì)酶另一重要功能是激活各種Pro-MMPs[31]。MMP9屬于明膠酶,主要降解被MMP1分解的Ⅰ型膠原及Ⅳ型膠原。

本研究發(fā)現(xiàn),老化大鼠的MMP1、MMP9、MMP10、MMP13的mRNA表達(dá)均增高,符合自然老化的規(guī)律。老化n-3 PUFAs組和老化對照組的MMP10及MMP13的mRNA表達(dá)量存在顯著差異(P<0.05),而MMP1、MMP3、MMP9(P>0.05)并無差異。與此不同的是,本課題組既往曾就膳食補(bǔ)充n-3 PUFAs延緩光老化進(jìn)行過探究,結(jié)果顯示其可通過抑制小鼠皮膚中MMP1含量而發(fā)揮保護(hù)作用。推測這種差別源于自然老化和光老化的產(chǎn)生機(jī)制不同。光老化過程中的氧化應(yīng)激事件主要是UVR引起的皮膚組織中活性氧(reactive oxygen species,ROS)增多。自然老化過程中的氧化應(yīng)激事件則主要是機(jī)體氧化代謝產(chǎn)生的ROS[32]。盡管自然老化和光老化皮膚中的ROS都可激活MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,誘導(dǎo)MMPs表達(dá),從而導(dǎo)致膠原降解異常,但兩者的啟動事件并不相同,UVR的膠原降解效應(yīng)較自然老化顯著增加。ROS導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)也是老化發(fā)生機(jī)制中重要的一環(huán)。自然老化皮膚中的ROS水平及炎癥反應(yīng)都較光老化弱,這可能是n-3 PUFAs并未影響到MMP1水平的原因。根據(jù)本實驗結(jié)果,膳食補(bǔ)充n-3 PUFAs或通過減少M(fèi)MP10、MMP13延緩Ⅰ、Ⅲ型膠原及其他ECM蛋白降解保護(hù)皮膚。

以上結(jié)果表明,膳食補(bǔ)充n-3 PUFAs可促進(jìn)老化大鼠真皮Ⅰ、Ⅲ膠原生成,減少M(fèi)MP10、MMP13的表達(dá)延緩老化皮膚真皮ECM降解,一定程度延緩皮膚自然老化進(jìn)程。然而,膳食補(bǔ)充n-3 PUFAs促進(jìn)真皮膠原合成的具體機(jī)制仍需深入研究。在人體中是否可以延緩衰老,減輕衰老相關(guān)皮膚疾病亦有待探索。