響應(yīng)面法優(yōu)化鹿筋蛋白提取工藝及體外抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性

郅 慧,蘭 夢(mèng),李晶峰,張 曄,楊小倩,張 輝,*,李春楠,*(.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林省人參科學(xué)研究院,吉林長(zhǎng)春 307;.吉林鑫水科技開發(fā)有限公司,吉林長(zhǎng)春 30000)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為主要表現(xiàn)的自身免疫疾病[1-2]。RA的反復(fù)發(fā)作,可引起關(guān)節(jié)軟骨的損害和侵蝕,造成關(guān)節(jié)畸形和功能喪失。調(diào)查發(fā)現(xiàn),RA是一種致殘性疾病,高致殘率已經(jīng)嚴(yán)重影響人民的生活和健康[3-4]。臨床上常用的抗RA藥物價(jià)格昂貴,毒副作用大。因此,開發(fā)廉價(jià)、高效、副作用少的藥物成為科學(xué)家關(guān)注的熱點(diǎn)[5-7]。

鹿筋是梅花鹿CervusnipponTemminck的四肢干燥筋,是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴動(dòng)物藥,具有一定的藥用價(jià)值[8],同時(shí)可以用于食品、保健品等行業(yè)。鹿筋含有豐富的蛋白[9],現(xiàn)代研究表明鹿筋蛋白具有抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用,主治風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、轉(zhuǎn)筋等癥[10-11],對(duì)維護(hù)機(jī)體正常功能和修復(fù)損傷作用顯著[12]。孫曉迪等[13]研究結(jié)果表明鹿筋膠原可顯著抑制大鼠足腫脹度及炎性細(xì)胞因子的分泌,抗炎作用顯著。曲毅等[14]研究結(jié)果表明鹿筋膠原蛋白能有效的抑制小鼠耳廓腫脹,降低炎性滲出,具有良好的抗炎鎮(zhèn)痛作用。張鶴等[15]研究結(jié)果表明鹿筋膠原蛋白對(duì)骨質(zhì)疏松癥具有較好的防治作用。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞(RAFLSs)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的炎癥發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色,其中RAFLSs的作用包括炎癥因子的分泌、血管翳的生成、軟骨及軟骨下骨的侵蝕等[16]。MH7A細(xì)胞屬于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞(RAFLSs)的一種成熟的細(xì)胞系,其作用和RAFLS基本相同,與RAFLSs相比具有增殖速度快,不受傳代次數(shù)限制等特性。TNF-α作為一種促炎癥因子,貫穿RA發(fā)病的始終,目前認(rèn)為TNF-α可誘導(dǎo)RAFLS發(fā)生凋亡機(jī)制障礙,從而導(dǎo)致RA病變持續(xù)存在、遷延發(fā)展[17-18],因此本實(shí)驗(yàn)選擇TNF-α誘導(dǎo)MH7A細(xì)胞。NO、IL-6、TNF-α是RA炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵效應(yīng)因子,其分泌過量將產(chǎn)生炎性損傷[19-20],研究表明,RA患者的炎性反應(yīng)發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用的是細(xì)胞炎癥因子的釋放,因此本實(shí)驗(yàn)需要測(cè)定這三種炎癥因子的含量。目前大量抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物通過抑制炎癥細(xì)胞因子的釋放從而達(dá)到治療疾病目的。

為探討鹿筋蛋白抗RA活性,本研究以梅花鹿鹿筋為原料,優(yōu)化蛋白的提取工藝,并考察其對(duì)MH7A細(xì)胞的增殖抑制活性及炎癥因子分泌的影響,在細(xì)胞水平上探討鹿筋蛋白抗RA的作用,為鹿筋的開發(fā)應(yīng)用提供了研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

梅花鹿鹿筋 吉林省東鰲鹿業(yè)科技開發(fā)有限公司;細(xì)胞株(MH7A) 購(gòu)自廣東吉尼歐生物技術(shù)公司;胎牛血清 美國(guó)Gibco公司;四甲基偶氮唑鹽 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素 美國(guó)Hyclone公司;TNF-α北京索萊寶科技有限公司;IL-6、TNF-α、NO試劑盒 長(zhǎng)春百金生物科技有限公司;其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

倒置顯微鏡 奧林巴斯工業(yè)有限公司;680 型酶標(biāo)儀 上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司;紫外分光光度計(jì) 德國(guó)耶拿分析儀器股份有限公司;冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鹿筋前處理 將鹿筋剪成8 mm×8 mm小塊,用蒸餾水沖洗干凈,置-20 ℃冷凍保存。

1.2.2 鹿筋蛋白提取工藝 稱取一定量的鹿筋,加入到一定量的水中[21],磁力攪拌提取,提取過程中保持溫度恒定,過濾,收集濾液,測(cè)定蛋白含量。

1.2.3 鹿筋蛋白含量測(cè)定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 分別吸取蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mg/mL)10、20、40、60、80、100 μL置于試管中,用蒸餾水補(bǔ)足至1 mL,加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液,混勻,室溫靜置5 min。并設(shè)置空白對(duì)照(以蒸餾水作為空白對(duì)照),測(cè)定595 nm 處吸光度A值。將蛋白質(zhì)溶液質(zhì)量濃度(μg/mL)作為橫坐標(biāo)(X),將A595作為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程Y=5.0164X+0.0261,R2=0.9930,結(jié)果表明質(zhì)量濃度為10～100 μg/mL范圍內(nèi)時(shí),蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度與吸光度線性關(guān)系良好。

1.2.3.2 樣品溶液的測(cè)定 稱取鹿筋蛋白凍干樣品,配制質(zhì)量濃度為100 μg/mL樣品溶液,吸取1 mL樣品溶液加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液,混勻,室溫反應(yīng)5 min,測(cè)定595 nm處A值。根據(jù)公式(1)計(jì)算鹿筋蛋白含量。

式(1)

式中:c為供試品(樣液)溶液中的蛋白質(zhì)濃度(μg/mL);D為樣品溶液的稀釋倍數(shù);W樣為樣品質(zhì)量(μg)。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果,對(duì)提取時(shí)間、提取溫度、料液比進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì),試驗(yàn)因素水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.6 鹿筋蛋白對(duì)MH7A增殖抑制活性及炎癥因子分泌的影響

1.2.6.1 細(xì)胞培養(yǎng) MH7A細(xì)胞用含10% 胎牛血清、1×105U·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)[22]。

1.2.6.2 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率 將配制好的細(xì)胞5×104cell·mL-1懸液接種于96孔培養(yǎng)板,每孔接種100 μL,置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱,培養(yǎng)24 h后造模(加入質(zhì)量濃度為60 ng/mL的 TNF-α溶液)繼續(xù)培養(yǎng)24 h給藥,每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔,于5% CO2、37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后每孔加入20 μL質(zhì)量濃度5 g·L-1的MTT溶液,培養(yǎng)4 h后棄上清液,加入150 μL DMSO,振蕩10 min,于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)其OD值,計(jì)算每組增殖抑制率。設(shè)置空白組(加DMEM高糖培養(yǎng)液)、TNF-α模型組(60 ng·mL-1TNF-α)、給藥組(25、50、100、200 μg·mL-1鹿筋蛋白+60 ng·mL-1TNF-α),實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次[23]。

1.2.6.3 鹿筋蛋白對(duì)MH7A細(xì)胞釋放NO、IL-6、TNF-α水平的影響 細(xì)胞給藥培養(yǎng)24 h后,分別吸取上清液。采用ELISA試劑盒檢測(cè)NO、IL-6、TNF-α的含量水平,于490 nm測(cè)定吸光度OD值[24]。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)鹿筋蛋白含量的影響 由圖1可以看出,時(shí)間在2～12 h時(shí),鹿筋蛋白含量隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。在10 h時(shí),蛋白含量最高,此時(shí)蛋白含量為10.04%。但提取時(shí)間在8～12 h范圍內(nèi),隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),鹿筋蛋白含量增長(zhǎng)緩慢,10與12 h條件下的蛋白含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),考慮到節(jié)約人力物力等經(jīng)濟(jì)因素,因此確定下一步優(yōu)化范圍在7～9 h。

圖1 提取時(shí)間對(duì)鹿筋蛋白含量的影響Fig.1 Effect of extraction time on deer gluten protein content 注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),相同字母表示差異不顯著(P>0.05);圖2～圖3同。

2.1.2 提取溫度對(duì)蛋白含量的影響 由圖2可以看出,溫度在30～100 ℃時(shí),蛋白含量隨著提取溫度的升高而增加。80與90 ℃效果較好,100 ℃效果最好,100 ℃時(shí)蛋白含量顯著高于其它試驗(yàn)組(P<0.05),但在100 ℃提取時(shí),由于溫度太高,水分蒸發(fā)過快,為保持恒定的料液比,需要經(jīng)常補(bǔ)充水,且耗能較大,因此確定下一步優(yōu)化范圍在70～90 ℃。

圖2 提取溫度對(duì)蛋白含量的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on deer gluten protein content

2.1.3 料液比對(duì)蛋白含量的影響 由圖3可知,料液比在1∶10～1∶20 g/mL時(shí),蛋白含量隨料液比的的增加而增加,在料液比為1∶20 g/mL時(shí),其蛋白含量顯著高于其它試驗(yàn)組(P<0.05),當(dāng)超過1∶20 g/mL時(shí),蛋白含量隨著料液比的增加而下降。因此確定下一步優(yōu)化范圍在1∶17～1∶23 g/mL。

圖3 料液比對(duì)鹿筋蛋白含量的影響Fig.3 Effect of feed-liquid ratio on deer gluten protein content

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面模型的建立與分析 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取的響應(yīng)面試驗(yàn)因素為料液比(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C),蛋白含量為響應(yīng)值。根據(jù)Box-Benhnken中心組合原理設(shè)計(jì)試驗(yàn),采用響應(yīng)面法優(yōu)化鹿筋蛋白提取工藝。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2,ANOVA方差分析結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

表3 回歸模型顯著性檢驗(yàn)及方差分析Table 3 Significant test and variance analysis for the regression model

運(yùn)用Design Expert 8.0.6.1軟件對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸分析,得鹿筋蛋白含量預(yù)測(cè)值(Y)對(duì)自變量A、B和C的二次多項(xiàng)回歸方程模型:Y=12.05+1.21A+0.77B+0.60C-0.30AB+0.70AC+1.30BC-1.50A2-0.87B2-1.54C2。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化 利用Design Expert軟件做不同因素間響應(yīng)面分析圖與等高線圖。各因素的響應(yīng)圖可直觀地反映各因素及其交互作用對(duì)蛋白得率大小的影響程度。其中等高線的形狀可以反映兩因素間交互作用的強(qiáng)弱,圓形表示兩因素間交互作用較弱,橢圓表示兩因素間交互作用較強(qiáng)[25-26]。響應(yīng)面圖和等高線圖見圖4～圖6。

圖4 料液比與提取溫度交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.4 Response surface map and contour map of interaction between material-liquid ratio and extraction temperature

圖5 料液比與提取時(shí)間交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface map and contour map of interaction between material-liquid ratio and extraction time

圖6 提取溫度與提取時(shí)間交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Extraction of response surface and contour maps of interaction between temperature and extraction time

如圖4所示,隨著提取溫度的升高,蛋白含量先升高后降低。隨著料液比的增加,蛋白含量先升高后降低,等高線圖呈圓形,說明AB因素之間交互作用不顯著。如圖5所示,隨著提取時(shí)間及料液比的的增加,蛋白含量先升高后降低,說明在所選區(qū)域內(nèi)鹿筋蛋白含量存在極值,等高線圖呈橢圓形,說明AC因素之間存在顯著交互作用。如圖6所示隨著提取時(shí)間的增加及提取溫度的升高,蛋白含量先升高后降低,等高線圖呈橢圓形,說明BC因素之間存在顯著交互作用。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 通過軟件Design-Expert 8.0.6.1求解方程,計(jì)算得到蛋白得率達(dá)到最大值時(shí)的最優(yōu)提取工藝條件為:料液比1∶21.21 g/mL,提取溫度88.32 ℃,提取時(shí)間8.66 h,提取率預(yù)測(cè)值12.87%。為了便于進(jìn)行試驗(yàn),對(duì)該條件進(jìn)行修正:料液比1∶21 g/mL,提取溫度88 ℃,提取時(shí)間8.6 h。該條件下進(jìn)行三次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),取平均值,得鹿筋中蛋白含量為12.53%,與預(yù)測(cè)值相接近,為鹿筋蛋白的提取提供了良好的技術(shù)支撐。

2.3 鹿筋蛋白對(duì) MH7A 細(xì)胞增殖抑制的影響

由表4可知，與空白組相比,TNF-α模型組細(xì)胞極顯著增殖(P<0.01),證明TNF-α模型造模成功;與TNF-α模型組相比,各給藥組均不同程度地抑制MH7A細(xì)胞的增殖。在200 μg/mL質(zhì)量濃度下,鹿筋蛋白抑制作用最高,增殖抑制率為78.93%,與模型相比有極顯著差異(P<0.01)。在50～200 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi),細(xì)胞增殖抑制率隨著樣品濃度的增高而增高(P<0.01或P<0.001),呈現(xiàn)濃度依賴性,各樣品組與模型組相比有顯著性差異。綜上所述鹿筋蛋白對(duì)MH7A細(xì)胞增殖抑制活性結(jié)果為:200 μg/mL>100 μg/mL>50 μg/mL>25 μg/mL。

表4 各組細(xì)胞增殖抑制率 Table 4 Cell proliferation inhibitory rate in each group

2.4 鹿筋蛋白對(duì)MH7A細(xì)胞釋放NO、IL-6、TNF-α水平的影響

2.4.1 對(duì)MH7A細(xì)胞釋放NO的影響 如圖7所示,所示與空白組相比,TNF-α模型組可以極顯著誘導(dǎo)MH7A細(xì)胞分泌NO(P<0.01);與TNF-α模型組比較,各給藥組均可不同程度的下調(diào)MH7A細(xì)胞炎癥因子NO的水平。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí),NO釋放量達(dá)到最低,效果高度顯著(P<0.001)。

圖7 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量Fig.7 NO contents in culture medium in each group

2.4.2 對(duì)MH7A細(xì)胞釋放TNF-α的影響 如圖8所示,與空白組相比,TNF-α模型組可以極顯著誘導(dǎo)MH7A細(xì)胞分泌TNF-α(P<0.01);與TNF-α模型組比較,質(zhì)量濃度在25～200 μg/mL范圍內(nèi),各劑量組均可不同程度的下調(diào)TNF-α的水平,有極顯著差異(P<0.01)。經(jīng)質(zhì)量濃度為100 μg/mL樣品處理后的MH7A細(xì)胞分泌TNF-α含量水平最低(P<0.01)。

圖8 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α含量 Fig.8 TNF-α contents in culture medium in each group

2.4.3 對(duì)MH7A細(xì)胞釋放IL-6的影響 由圖9可知,與空白組相比,TNF-α模型組可以極顯著誘導(dǎo)MH7A細(xì)胞分泌IL-6(P<0.01);與TNF-α模型組比較,質(zhì)量濃度在25～200 μg/mL范圍內(nèi),各劑量組均可不同程度的抑制細(xì)胞釋放IL-6,有極顯著差異(P<0.01)。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí),IL-6的釋放量達(dá)到最低,效果最顯著。

圖9 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6含量 Fig.9 IL-6 contents in culture medium in each group

上述3個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,鹿筋蛋白能夠抑制MH7A細(xì)胞釋放細(xì)胞炎癥因子,在質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí),細(xì)胞炎癥因子NO、IL-6、TNF-α釋放量達(dá)到最低,效果最佳。因此推測(cè)鹿筋蛋白對(duì)因炎癥因子過度釋放引起的滑膜炎癥和關(guān)節(jié)損傷,具有良好的治療作用。

鹿筋蛋白對(duì)上述三種炎癥因子(NO、IL-6、TNF-α)抑制的最佳濃度為100 μg/mL,這與對(duì)細(xì)胞增殖抑制率的最佳濃度(200 μg/mL)不一致,推測(cè)是由于鹿筋蛋白對(duì)MH7A細(xì)胞發(fā)生的增殖抑制作用不單純是通過對(duì)這三種炎癥因子NO、IL-6、TNF-α的抑制發(fā)揮藥效,可能同時(shí)通過其他途徑來抑制MH7A細(xì)胞的增殖抑制率。

3 討論與結(jié)論

鹿筋蛋白常用的的提取方法為酸法提取,但酸法提取反應(yīng)劇烈,反應(yīng)過程難控制,影響生物活性,故本實(shí)驗(yàn)采用熱水提取法提取鹿筋蛋白并對(duì)其活性進(jìn)行研究,目前未見使用此法提取鹿筋蛋白。熱水提取過程中溫度的控制非常重要,提取溫度控制不當(dāng),提取不完全,產(chǎn)量會(huì)受到影響[27]。本實(shí)驗(yàn)采用恒溫水浴磁力攪拌法提取鹿筋蛋白,既保證溫度的恒定,又加速浸提物的溶出。通過單因素試驗(yàn)結(jié)果得出響應(yīng)面優(yōu)化條件。鹿筋蛋白提取最佳條件為料液比1∶21 (g/mL),提取溫度88 ℃,提取時(shí)間8.6 h,測(cè)得蛋白含量為12.53%。

鹿筋具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的功效,主治勞損過度、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛等癥。本實(shí)驗(yàn)考察了優(yōu)化工藝條件下提取所得的鹿筋蛋白對(duì)MH7A炎癥細(xì)胞增殖抑制的影響,并測(cè)定給藥后的MH7A細(xì)胞上清液中NO、IL-6、TNF-α的含量,驗(yàn)證鹿筋蛋白抗RA活性。NO、IL-6、TNF-α是RA炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)。NO是一種重要的生物信使分子,低含量水平時(shí),NO具有生理調(diào)節(jié)和抗炎的作用,高含量水平時(shí),NO會(huì)加重炎癥反應(yīng)。TNF-α、IL-6為炎癥細(xì)胞分泌的炎癥細(xì)胞因子,其中TNF-α具有很強(qiáng)的炎癥損傷作用,可產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng),促進(jìn)IL-6細(xì)胞因子的釋放,加重炎癥反應(yīng)[28]。

本實(shí)驗(yàn)中,TNF-α誘導(dǎo)的模型組NO、IL-6、TNF-α炎癥效應(yīng)因子分泌量分別為:4.07、21.95、16.31 pg/mL,在100 μg/mL質(zhì)量濃度下,鹿筋蛋白給藥組的炎癥驗(yàn)證效應(yīng)因子分別為:1.60、13.60、7.29 pg/mL,與模型組相比,鹿筋蛋白對(duì)上述三種炎癥因子釋放的抑制作用最顯著,由此推測(cè)鹿筋蛋白可能具有一定的抗RA活性。本研究采用60 ng/mL的TNF-α誘導(dǎo)MH7A細(xì)胞,結(jié)果表明,不同濃度的鹿筋蛋白對(duì)MH7A細(xì)胞增殖有抑制作用,且增殖抑制率隨藥物濃度的增加而增加,呈濃度依賴性。鹿筋蛋白質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí),對(duì)MH7A細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng),抑制率為78.92%。給藥后MH7A細(xì)胞上清液中NO、IL-6、TNF-α含量均有不同程度的降低,在質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí),上述3種細(xì)胞炎癥因子釋放量達(dá)到最低,證明鹿筋蛋白的抗炎作用與其抑制炎癥因子的釋放密切相關(guān),進(jìn)一步驗(yàn)證了鹿筋蛋白具有較好的抗RA活性,但鹿筋蛋白抗RA活性并不是簡(jiǎn)單的通過對(duì)三種炎癥因子(NO、IL-6、TNF-α)的抑制發(fā)揮效果,推測(cè)可能同時(shí)通過其他途徑來抑制MH7A細(xì)胞的增殖抑制率。

Majumder等[29]研究表明雞蛋卵轉(zhuǎn)鐵蛋白可調(diào)節(jié)NF-κB炎癥信號(hào)通路中相關(guān)基因的表達(dá)、降低促炎細(xì)胞因子的釋放,從而達(dá)到抗炎活性。Huang等[30]研究表明雞蛋卵轉(zhuǎn)鐵蛋白可通過抑制IκBα磷酸化阻斷NF-κB細(xì)胞信號(hào)通路,減少促炎因子的表達(dá),上調(diào)抑炎因子表達(dá),從而起到減輕致炎因子TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)。Elvira Gonzalez等[31]研究表明在TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥模型中,大豆蛋白能夠阻斷NF-κB信號(hào)通路激活,抑制NF-κB通路相關(guān)的p65和p50蛋白表達(dá)量,減少炎癥因子的釋放,從而減輕細(xì)胞炎性反應(yīng)。鹿筋蛋白抗RA作用機(jī)制并不是簡(jiǎn)單通過抑制MH7A細(xì)胞的增殖,抑制三種炎癥因子(NO、IL-6、TNF-α)的分泌發(fā)揮效果,鹿筋蛋白可能通過抑制MH7A細(xì)胞中炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活,降低相關(guān)蛋白的表達(dá),抑制炎癥因子NO、IL-6、TNF-α的分泌,加速炎癥細(xì)胞因子的清除,減少M(fèi)H7A細(xì)胞的損傷,從而減輕RA炎癥反應(yīng),有待進(jìn)一步研究。