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    徐長卿丹皮酚對骨癌痛大鼠鎮(zhèn)痛作用的研究

    2020-11-18 07:15:26赫錦錦
    中國藥理學通報 2020年11期
    關鍵詞:徐長卿骨癌動作電位

    赫錦錦,方 東

    (1. 河南大學第一附屬醫(yī)院藥學部,河南 開封 475000;2. 河南大學藥學院藥理學教研室,河南 開封 475004)

    原發(fā)性骨腫瘤或其他部位腫瘤(乳腺癌、前列腺癌、肺癌)的骨轉移都會導致骨癌痛的發(fā)生,嚴重影響病人的生活質量[1]。臨床上用于骨癌痛的藥物主要是阿片類藥物,然而這類藥物具有耐受性和成癮性,因此臨床上亟需開發(fā)鎮(zhèn)痛效果好、成癮性低的鎮(zhèn)痛藥物[2-3]。

    蘿藦科植物徐長卿的干燥根、根莖及帶根全草可用于風濕痹痛、腰痛、跌打損傷痛等痛證的治療,療效明顯[4-5]。大量研究表明,徐長卿最主要的藥理成分是丹皮酚[6-7],然而,徐長卿丹皮酚(Paeonol of Cynanchum paniculatumhas, Paeonol)是否具有抗骨癌痛的作用還不清楚,因而本研究采用乳腺癌誘發(fā)的骨癌痛大鼠模型評價徐長卿丹皮酚抗骨癌痛的作用,并探討其作用機制。

    1 材料與方法

    1.1 藥品與試劑徐長卿丹皮酚(貨號:H111081)購于阿拉丁公司(上海,中國),兔源TRPV1多克隆抗體(貨號:ab6166),小鼠源transferrin receptor單克隆抗體(貨號:ab1086)購于英國Abcam公司,小鼠源β-actin單克隆抗體(貨號:TA-09)購于中杉金橋(北京,中國);辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(貨號:sc-2054),辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG(貨號:sc-2973)購于Santa Cruz公司(MN, USA)。

    1.2 實驗動物健康雌性Sprague-Dawley大鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。大鼠初始體質量為(160~180) g,分籠飼養(yǎng)于SPF級動物房中,動物房室溫控制在(23±2) ℃,相對濕度控制在70%±10%,大鼠自由飲水和飲食。

    1.3 骨癌痛大鼠模型的建立將復蘇后的大鼠乳腺癌MRMT-1細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中,當細胞處于對數(shù)生長期時進行傳代培養(yǎng),收集傳代2次后的細胞用于骨癌痛模型的建立。用PBS緩沖液將收集的MRMT-1細胞稀釋成1×1010個·L-1的細胞懸液,用微量進樣器將4 μL上述細胞懸液(4×104個)接種于大鼠左后肢脛骨骨髓腔內(nèi),建立骨癌痛大鼠模型,對照組大鼠給予等量的PBS溶液。

    1.4 機械痛閾值的測定按照Chaplan等[8]報道的“up and down”方法,測定大鼠左后肢的機械痛閾(paw withdrawal threshold,PWT)。首先將大鼠放置在用于測定機械痛的有機玻璃籠中,并保持室內(nèi)安靜以防大鼠出現(xiàn)躁動。當大鼠安靜后,用一系列標準化的von Frey hair刺激大鼠左后肢足墊中部,每次刺激持續(xù)時間約5 s,觀察大鼠是否出現(xiàn)縮足反應,不同刺激之間相隔5 min以上,以消除上一次刺激對大鼠的影響,根據(jù)“up and down”方法計算50%縮足閾值。

    1.5 熱輻射痛閾值的測定將大鼠置于有機玻璃套筒(18 cm × 6 cm × 6 cm) 內(nèi),使其適應30 min,待大鼠安靜后開始測試。將熱輻射光源對準大鼠左側足墊正下方,開啟光源并計時,出現(xiàn)抬足現(xiàn)象為陽性反應,大鼠出現(xiàn)陽性反應后立即關閉熱輻射光源,記錄該次大鼠的抬足潛伏期(paw withdraw latency,PWL)。為了保證測試結果的準確性,每只大鼠左后肢至少重復測量3次,每次測試間隔5 min以上,最后取3次PWL的平均值記為大鼠的熱輻射痛閾。

    1.6 大鼠DRG中蛋白的提取及Western blot實驗總蛋白的提?。捍笫髷囝^處死后,迅速取出左側L4,L5的背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)置于1.5 mL EP管中,加入100 μL RIPA裂解液,以25%的強度超聲破碎DRG至無組織塊出現(xiàn),將其放置在冰上繼續(xù)裂解30 min,然后12 000 r·min-1離心10 min,取上清,采用BCA法進行蛋白定量,取40 μg總蛋白進行Western blot 實驗。

    膜蛋白的提?。喝〈笫驦4,L5 DRG置于玻璃研磨器中,加入800 μL膜成分提取液(0.3 mol·L-1Sucrose,10 mmol·L-1Tris,2 mmol·L-1EDTA,1 mmol·L-1PMSF,1 mmol·L-1DTT,10 mg·L-1Leupeptin),按照Black等[9]的方法進行超高速離心得到膜成分,之后用含有1% Triton X-100的RIPA裂解液冰上裂解1 h,12 000 r·min-1離心10 min后取上清,定量,取20 μg膜蛋白進行Western blot 實驗。

    Western blot實驗:每組樣品取等量的蛋白在10%的SDS-PAGE分離膠中以120 V的電壓進行電泳分離2 h。電泳結束后,再通過200 mA的電流轉膜2 h,將蛋白轉移到PVDF膜上。然后取出PVDF膜置于5%脫脂奶中室溫封閉1 h。封閉之后,使用5%脫脂奶分別稀釋TRPV1抗體(1:1 000)、β-actin抗體(1 ∶2 000)、transferrin抗體(1 ∶1 000),4 ℃孵育上述抗體過夜。一抗孵育完成后,再在室溫下用相應的二抗孵育1 h,采用ECL試劑盒顯色,用Quantity One軟件分析條帶光密度值。

    1.7 電生理記錄大鼠DRG神經(jīng)元的興奮性和TRPV1電流大鼠DRG神經(jīng)元的急性分離:斷頭處死大鼠,快速取出左側L4和L5 的DRG,置于預冷的DMEM培養(yǎng)基中,快速洗滌2次,加入1.5 mL膠原酶,37 ℃消化45 min;然后棄去膠原酶,用DMEM洗滌2次,加入1.5 mL胰酶,繼續(xù)消化10 min。當胰酶消化結束后,加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化,1 000 r·min-1離心5 min,棄去上清,然后加入新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基,用拋光后的巴斯德管吹打DRG,使神經(jīng)元分散至培養(yǎng)基中。最后將分散后的神經(jīng)元接種在24孔培養(yǎng)板中(24孔板中提前放置有多聚賴氨酸包被過的蓋玻片),置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后進行電生理實驗。

    全細胞膜片鉗記錄:選取直徑小于25 μm的DRG神經(jīng)元,在電流鉗模式下,將神經(jīng)元鉗制于0 pA,記錄各組神經(jīng)元的靜息膜電位(resting membrane potential,RMP),此后采用階梯式給予一系列去極化電流,每次躍遷5 pA,持續(xù)100 ms,直至誘發(fā)出第一個動作電位,即為動作電位的去極化電流閾值(current threshold,CT),并同時記錄動作電位爆發(fā)的閾值(threshold of action potential,TP)。然后給予恒定去極化電流(300 pA, 500 ms)刺激DRG神經(jīng)元,記錄相同刺激下每個神經(jīng)元爆發(fā)動作電位的個數(shù)。最后在電壓鉗模式下,將神經(jīng)元的電壓鉗制在-70 mV,執(zhí)行TRPV1受體激動劑辣椒素(Capsaicin,CAP)灌流給藥步驟(細胞外液2 s,激動劑3 s,細胞外液20 s),記錄TRPV1電流。實驗中采用EPC-10膜片鉗放大器和Patch master軟件來記錄和分析DRG神經(jīng)元的電活動。

    2 結果

    2.1 徐長卿丹皮酚對骨癌痛大鼠痛行為的影響大鼠造模后d 14測定大鼠機械痛閾和熱痛閾,d 15腹腔注射不同濃度的Paeonol,連續(xù)給藥3 d后,再次測定大鼠的機械痛閾和熱痛閾。實驗結果顯示,Paeonol能明顯提高骨癌痛大鼠的機械痛閾和熱輻射痛閾,并且具有劑量依賴性(Fig 1)。

    2.2 徐長卿丹皮酚對骨癌痛大鼠DRG神經(jīng)元興奮性的影響以往的研究表明,骨癌痛大鼠的DRG神經(jīng)元興奮性會明顯增強,這也是骨癌痛的外周敏化機制[10]。因此,本研究首先急性分離給藥3 d后的骨癌痛大鼠的DRG神經(jīng)元,然后采用膜片鉗技術記錄DRG神經(jīng)元的電生理參數(shù)。結果表明,Paeonol(100 mg·kg-1)能明顯增加骨癌痛大鼠DRG神經(jīng)元靜息膜電位的絕對值,上調(diào)骨癌痛大鼠DRG神經(jīng)元誘發(fā)動作電位的去極化電流閾值、動作電位爆發(fā)的閾值(Fig 2)。同樣,Paeonol(100 mg·kg-1)也能降低300 pA去極化電流誘發(fā)的DRG神經(jīng)元動作電位發(fā)放的頻率(Fig 3)。這些結果表明,Paeonol能降低骨癌痛大鼠DRG神經(jīng)元的興奮性。

    Fig 1 Effects of Paeonol of Cynanchum paniculatum on development of bone cancer pain of ratsNote that Paeonol of Cynanchum paniculatum could increase both the paw withdrawal threshold;(A) paw withdrawal latency (B) in a dose-dependent manner in bone cancer pain rats. n=8).*P<0.05, **P<0.01 vs normal saline group

    2.3 徐長卿丹皮酚對骨癌痛大鼠DRG上TRPV1蛋白表達的影響大量研究發(fā)現(xiàn),TRPV1在骨癌痛大鼠DRG神經(jīng)元上的表達明顯上調(diào),并且介導了DRG神經(jīng)元的興奮性和骨癌痛的發(fā)生[1, 11],因此本研究檢測了Paeonol(100 mg·kg-1)對骨癌痛大鼠DRG上TRPV1總蛋白和膜蛋白表達的影響,實驗結果顯示,連續(xù)給藥3 d后,Paeonol能夠明顯抑制骨癌痛大鼠DRG上TRPV1總蛋白和膜蛋白的表達(Fig 4),這提示Paeonol很可能是通過下調(diào)TRPV1蛋白的表達進而抑制神經(jīng)元興奮性和骨癌痛的發(fā)生。

    Fig 2 Effects of Paeonol of Cynanchum paniculatum on DRG neurons hyperexcitability in bone cancer pain of ratsA: Representative of the first action potential evoked by depolarizing current pulse recorded from the DRG neurons;B: Paeonol of Cynanchum paniculatum reversed bone cancer-induced the decrease of the absolute values of resting membrane potential(RMP) in bone cancer pain rats; C: Bone cancer-induced the decreased values of current threshold (CT) was reversed by Paeonol of Cynanchum paniculatum; D: Paeonol of Cynanchum paniculatum attenuated the increased absolute values of threshold potential (TP) induced by bone cancer pain. n=25-26)*P<0.05, **P<0.01 vs Normal, #P<0.05, ##P<0.01 vs Normal saline.

    Fig 3 Numbers of AP in DRG neurons decreased by Paeonol of Cynanchum paniculatum in bone cancer pain of ratsA: Representative of evoked discharges by a-500 ms, 300 pA depolarizing current pulse; B: Analysis of the evoked AP numbers. Note that the number of the evoked AP was significantly reduced in Paeonol-treated group. n=24-26) **P<0.01 vs Normal, ##P<0.01 vs NS (Normal saline).

    2.4 徐長卿丹皮酚對骨癌痛大鼠DRG上TRPV1電流的影響Paeonol對TRPV1功能的影響尚不清楚,因此本研究采用膜片鉗技術記錄了TRPV1電流的變化。實驗結果顯示,連續(xù)3 d給予Paeonol(100 mg·kg-1)后,骨癌痛大鼠DRG神經(jīng)元上TRPV1的電流密度也明顯降低(Fig 5)。

    Fig 5 Effects of Paeonol of Cynanchum paniculatumon TRPV1 currents in DRG neurons in bone cancer pain ratsA: Representative currents evoked by application of capsaicin (0.5 μmol·L-1 for 3 seconds) to DRG neurons in rats; B: Paeonol of Cynanchum paniculatum significantly decreased TRPV1 currents in DRG neurons in bone cancer pain rats. n=20) **P<0.01 vs Normal, ##P<0.01 vs NS (Normal saline), 1-way ANOVA.

    Fig 4 Effects of Paeonol of Cynanchum paniculatum on protein expression of TRPV1 in DRGs in bone cancer of rats Note that Paeonol of Cynanchum paniculatum reversed bone cancer-induced the up-regulation of TRPV1 total protein (A) and membrane protein (B) expression. β-actin and TfR (transferrin receptor) was used as an internal control. n=6) **P<0.01 vs Normal, ##P<0.01 vs Normal saline.

    3 討論

    徐長卿味辛、性溫,無毒,歸肝、腎經(jīng),臨床上常用于各種痛癥的治療,例如徐長卿內(nèi)服或外用在治療牙痛、胃痛、腹痛、風濕性關節(jié)痛、痛經(jīng)等方面有良好的止痛效果,但到目前為止還沒有文獻對徐長卿發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的成分和作用機制進行報道。本研究中,我們首次證明Paeonol可以通過下調(diào)TRPV1的表達進而抑制神經(jīng)元的興奮性,從而治療骨癌痛。

    然而,我們并沒有探討Paeonol下調(diào)TRPV1表達的機制,有文獻報道,丹皮酚具有抗炎、抗氧化的作用[12],特別是在神經(jīng)系統(tǒng),丹皮酚可以抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的表達[14-15],而TNF-α、IL-6可以通過MEK/ERK、PI3K/AKT等多條信號通路上調(diào)TRPV1蛋白的表達和功能的敏化,并且在骨癌痛的發(fā)生發(fā)展過程中,這些炎癥因子的表達也明顯上調(diào)[11, 15],因此我們推測Paeonol很可能是通過抑制炎癥反應,進而抑制TRPV1蛋白表達和功能的敏化。

    除了TRPV1受體,在外周DRG神經(jīng)元上還有很多受體或離子通道參與了骨癌痛的外周敏化,例如Nav1.8通道及KCNQ通道等[16]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)使用Paeonol后,DRG神經(jīng)元膜電位絕對值增大,而TRPV1對細胞膜電位影響并不明顯,因此我們推測Paeonol也可能會通過調(diào)節(jié)Nav1.8通道及KCNQ通道的表達或功能進而發(fā)揮抗骨癌痛的作用,當然這些假說還需要實驗驗證。

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