95 份存放15 年及以上生物檢材檢驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析

柯永慶 鄧存霞 袁 紅

（東莞市公安局，廣東 東莞523008）

隨著DNA檢驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展，過去沒有條件進(jìn)行DNA檢驗(yàn)或無法得到有效檢驗(yàn)的現(xiàn)場物證，通過采取合理的提取方式和檢驗(yàn)方法，能夠進(jìn)一步提高檢驗(yàn)成功率，成為破案的關(guān)鍵。本文梳理統(tǒng)計(jì)在命案積案破案攻堅(jiān)工作中存放15 年及以上的95 份生物檢材DNA 檢驗(yàn)方法和結(jié)果，以期為DNA檢驗(yàn)在破積案方面提供參考。

1 檢材與方法

1.1 檢材情況

檢材均為存放15年及以上的歷年未破命案現(xiàn)場物證，大部分未進(jìn)行分類和提取，物證以案件為單位裝在紙皮箱中室溫保存，類型和數(shù)量見表1。

1.2 檢驗(yàn)情況

1.2.1 DNA提取

煙頭、精斑、膠帶直接剪取適量；方向盤、刀柄、電線采用脫落細(xì)胞粘取器［1］進(jìn)行粘取；可疑血跡、瓶口、刀刃采用干濕兩步法棉簽擦拭提取，共95份檢材。剪取提取好的適量檢材裝1.5mL 離心管，加細(xì)胞消化液400uL、10mg/mL 蛋白酶K 32uL，56℃溫浴1h，磁珠法（長春博坤磁珠）提純模板DNA，洗脫體積為30uL純水。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

采 用 PowerPlex?18D System 試 劑 盒 在ABI Veriti 型擴(kuò)增儀擴(kuò)增，反應(yīng)總體系25uL（模板DNA 15uL、Primer Pair Mix 5uL、Master Mix 5uL），擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)為30 次。上述擴(kuò)增產(chǎn)物均在3500XL 分析儀（AB 公司，美國）進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離，使用GeneMarker Forensic V1.9軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 檢驗(yàn)結(jié)果

檢驗(yàn)結(jié)果依據(jù)《人類DNA 熒光標(biāo)記STR 分型結(jié)果的分型及應(yīng)用》（GA/T 1163-2014）相關(guān)要求，峰高大于100 相對熒光單位，檢出17 個(gè)以上STR 基因座及Amelogenin 基因座標(biāo)記為“檢出”，檢驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.2 破獲案件

表1 檢材類型及數(shù)量

除事主外，上述檢材共檢出嫌疑人DNA分型4 人（分別為煙頭3 人、可疑血跡1 人），比中嫌疑人3 人，破獲或?yàn)槊阜e案提供線索3宗。

3 討論

3.1 檢驗(yàn)難點(diǎn)

受所處環(huán)境的溫度、濕度、光、化學(xué)及生物等因素的作用，DNA 會發(fā)生降解，或者摻入PCR 抑制劑，存放時(shí)間越久、降解越嚴(yán)重。上述檢材均存放在室溫環(huán)境，且大部分房間并不通風(fēng)，保存長達(dá)15年或以上，DNA降解非常嚴(yán)重，即使像血跡、煙頭、精斑類的常規(guī)檢材，其DNA含量或?qū)⒔咏谖⒘繖z材。因此，最大量的釋放和提純模板DNA，合理選擇擴(kuò)增反應(yīng)體系和循環(huán)次數(shù)降低抑制物質(zhì)和干擾峰的影響對檢驗(yàn)結(jié)果尤其重要。

3.2 方法選擇

第一，利用56℃溫浴1h，磁珠法最大量的釋放和提純模板DNA。細(xì)胞消化液56℃溫浴將細(xì)胞膜、核膜破壞，適當(dāng)延長溫浴時(shí)間有利于裂解細(xì)胞核，使DNA能更完全地釋放，同時(shí)蛋白質(zhì)的變性也更為徹底［2］。磁珠法提取接觸DNA等微量檢材靈敏度較高，提取的DNA物質(zhì)分型完整，純度高，且不含色素、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)［3］，并且可以去除100bp 以下的小片段DNA，減少STR擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)的小片段優(yōu)勢現(xiàn)象。

第二，合理選擇擴(kuò)增反應(yīng)體系。擴(kuò)增體系擴(kuò)大，消除抑制因素能力會增強(qiáng)［4］。本文檢材采取反應(yīng)總體系25uL（模板DNA 15uL、Primer Pair Mix 5uL、Master Mix 5uL）的方式，提高了模板DNA的相對濃度，并利用大體系擴(kuò)增有利于消除抑制因素的特點(diǎn)，有利于獲得更好分型圖譜。

第三，合理選擇循環(huán)次數(shù)。法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，常規(guī)PCR循環(huán)數(shù)為28次，適當(dāng)增加循環(huán)次數(shù)，可使DNA 合成更充分，從而提高靈敏度，已被許多人用于多種類型低拷貝檢材的DNA分析。但隨著循環(huán)次數(shù)的增加，STR 分型結(jié)果中易出現(xiàn)等位基因擴(kuò)增不均衡、影子帶和等位基因丟失等現(xiàn)象，同時(shí)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和操作污染對樣本STR 分型的干擾作用變得更加明顯［5］。研究顯示循環(huán)數(shù)增至34 次甚至以上，獲得的STR分型不穩(wěn)定。微量檢材DNA 含量普遍在0.1～1.5ng之間［6］。不同PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的基因分型檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)顯示［7］，對模板量大于0.0625ng的低拷貝模板基因分型檢測結(jié)果，30次循環(huán)數(shù)的檢驗(yàn)結(jié)果優(yōu)于28次，且與32次循環(huán)數(shù)及以上的檢測結(jié)果持平。綜上所述，本文檢材采用PowerPlex?18D System 試劑盒25ul 體系 （模板15uL、Primer Pair Mix 5uL、Master Mix 5uL），30 次擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得的STR分型結(jié)果穩(wěn)定、正確，且受非特異譜帶與pullup峰影響小。

3.3 檢材類別與檢出率

血、煙頭、精斑等常規(guī)生物檢材由于分別含有大量的血細(xì)胞、唾液斑、精子細(xì)胞，雖受各種因素影響發(fā)生嚴(yán)重降解，但仍有檢出的可能。從表2 可以看出，利用本方法對存放15 年及以上的血跡、煙頭、精斑進(jìn)行DNA檢驗(yàn)，平均檢出率為77.3%。

膠帶、刀柄、電線、方向盤等檢材，主要含人體皮膚表層脫落細(xì)胞，Harbison［8］統(tǒng)計(jì)不同載體表面接觸DNA的檢驗(yàn)成功率發(fā)現(xiàn)，光滑堅(jiān)硬的載體表面提取接觸DNA 的成功率最低。且表皮細(xì)胞離體后會產(chǎn)生自溶，使DNA 降解，一般72h 內(nèi)自溶和降解速率影響因素較小，而超過該期限則會加快溶解速率［9］。上述檢材存放時(shí)間長達(dá)15年及以上，且并未妥善保存，檢出幾率非常低，僅有一處刀柄檢出（經(jīng)比對為事主所留），經(jīng)查看該刀柄存在分散血點(diǎn)，考慮檢出的DNA分型來自刀柄上潛血，而并非皮膚表層脫落細(xì)胞。

表2 檢驗(yàn)結(jié)果

3.4 存在不足

第一，對檢材保管不重視。上述檢材均存放在室溫環(huán)境下，未能及時(shí)提取并保持在-20℃超低溫冰箱，導(dǎo)致DNA降解嚴(yán)重。

第二，防污染意識不強(qiáng)?，F(xiàn)場物證均以案件為單位將全部檢材存放在同一紙皮箱中，容易造成物證之間的交叉污染。

第三，針對上述檢材未進(jìn)行DNA定量，缺少對模板DNA的精準(zhǔn)定量，不利于后期經(jīng)驗(yàn)總結(jié)和理論分析。

隨著命案積案破案攻堅(jiān)工作的深入開展，長期存放在物證室陳舊、不被重視的現(xiàn)場物證以及過去沒有條件進(jìn)行DNA檢驗(yàn)或無法得到有效基因分型的現(xiàn)場物證，經(jīng)過優(yōu)化方法重新進(jìn)行DNA檢驗(yàn)，在積案的偵破過程中發(fā)揮了重要作用，并且具有廣闊的研究空間，值得引起重視。