基于數(shù)字PCR方法的新型冠狀病毒檢測(cè)

周陽(yáng) 費(fèi)明明 黃左安

摘要：熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)方法作為檢測(cè)SARS-CoV-2的金標(biāo)準(zhǔn)被廣泛應(yīng)用于臨床。但由于標(biāo)本病毒載量不同和RT-PCR的局限性，不可避免的會(huì)出現(xiàn)大量的假陰性報(bào)告，導(dǎo)致無(wú)法及時(shí)診斷、早期治療、阻斷傳播、評(píng)估出院標(biāo)準(zhǔn)等問(wèn)題。為了改善這一情況，我們探索了一種基于數(shù)字PCR（ddPCR）技術(shù)的檢測(cè)SARS-CoV-2的方法。首先，使用新型冠狀病毒數(shù)字PCR核酸檢測(cè)試劑盒定量三例強(qiáng)陽(yáng)咽拭子樣本ORF1ab基因拷貝數(shù)，并與RT-PCR的Ct值進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)二者呈對(duì)數(shù)相關(guān)性。隨后挑選1例陽(yáng)性樣本，進(jìn)行倍比稀釋檢測(cè)，最終確定其檢測(cè)試劑盒的最低檢出限為250 copies/ml，遠(yuǎn)低于RT-PCR的1000 copies/ml。使用60例稀釋至250 copies/ml對(duì)試劑盒檢出限進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)ORF1ab基因檢出率為93.3%，N基因檢出率為100%。臨床驗(yàn)證結(jié)果顯示在檢測(cè)的15例臨床樣本，其中8例RT-PCR診斷為疑似的樣本，ddPCR結(jié)果5例是陽(yáng)性，3例是陰性。因此，ddPCR在臨床診斷SARS-CoV-2具有更高的靈敏度，減少了假陰性和假陽(yáng)性診斷，對(duì)COVID-19診斷、治療和防控等方面均具有重要意義。

關(guān)鍵詞：SARS-CoV-2;COVID-19;核酸檢測(cè);RT-PCR;ddPCR

【中圖分類號(hào)】R563.1 ?【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A ?【文章編號(hào)】1673-9026（2020）08-217-03

1.引言

2019年12月，湖北武漢爆發(fā)不明原因肺炎，并迅速在全國(guó)蔓延。目前，COVID-19的檢測(cè)主要有CT檢查[1]，核酸檢測(cè)[2，3]和抗體檢測(cè)[4-6]。熒光定量PCR已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)SARS-CoV-2病毒核酸的主要方式[7]，然而，核酸檢測(cè)結(jié)果受到樣本和取樣時(shí)間的影響，存在假陰性情況[3，8，9]，原因之一可能是樣本的病毒載量未達(dá)到試劑的最低檢出限。尋找具有更低檢出限的核酸檢測(cè)方法，成為了臨床檢測(cè)COVID-19的重要目標(biāo)。

微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）是一種將模板稀釋到單分子水平并結(jié)合泊松分布定量DNA分子的方法[10]。與實(shí)時(shí)熒光定量PCR相比，它提供了更高的靈敏度和特異性。因此，本研究基于ddPCR技術(shù)，評(píng)估了RT-PCR檢測(cè)與ddPCR檢測(cè)新冠病毒的靈敏度與特異性，確定一種高靈敏的檢測(cè)方法，以期降低臨床檢測(cè)的假陰性率。

2.材料方法

2.1材料

鼻咽拭子樣本共118份，其中陰性樣本101份，陽(yáng)性樣本9份，疑似樣本8份，由中國(guó)科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院提供;核酸提取或純化試劑（Ex-DNA/RNA病毒）、全自動(dòng)旋轉(zhuǎn)式核酸提取儀（GeneRotex 96）購(gòu)自蘇州天隆生物科技有限公司;數(shù)字PCR微滴式芯片（V2）、新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒（數(shù)字PCR法）、樣本制備儀（DG32）、PCR擴(kuò)增儀（TC1）、生物芯片閱讀儀（iScanner5）由領(lǐng)航基因科技（杭州）有限公司提供。新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）購(gòu)自上海伯杰醫(yī)療科技有限公司。全自動(dòng)定量PCR儀（SLAN-96S）購(gòu)自上海宏石醫(yī)療科技有限公司。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1核酸提取

取出-80℃冰箱保存的鼻咽拭子樣本，室溫融化，渦旋震蕩混勻。取出核酸提取和純化試劑，將深孔板顛倒混勻，重懸底部磁珠，輕甩孔板，使試劑及磁珠集中到底部，撕開(kāi)封口膜。深孔板第一孔加入20ul蛋白酶K和200ul鼻咽拭子樣本，第二孔放入攪拌套。加完樣本后的孔板放入全自動(dòng)旋轉(zhuǎn)式核酸提取儀中，按照說(shuō)明書(shū)的程序提取病毒核酸。取出最后一孔中的核酸樣本到1.5ml無(wú)RNA酶的EP管中，-80℃保存。

2.2.2數(shù)字PCR擴(kuò)增及芯片閱讀

預(yù)熱樣本制備儀、生物芯片閱讀儀。取出-20℃冰箱保存的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒（數(shù)字PCR法），冰上溶解ddPCR試劑。在生物安全柜中按照說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系，取14ul反應(yīng)體系加入到數(shù)字PCR微滴式芯片進(jìn)樣口的杯子中，加入16ul油相補(bǔ)滿。在進(jìn)出口杯子上蓋上硅膠帽，放入樣本制備儀制備微滴。微滴制備完成后，將芯片放入PCR擴(kuò)增儀中，按照程序擴(kuò)增。取出擴(kuò)增完成的芯片，放入生物芯片閱讀儀掃描并記錄結(jié)果。

2.2.3RT-PCR擴(kuò)增

取出-20℃冰箱保存的新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法），冰上溶解RT-PCR試劑。在生物安全柜中按照說(shuō)明書(shū)在八連管中配制反應(yīng)體系。將八連管放入全自動(dòng)定量PCR儀中，按照程序擴(kuò)增并觀察結(jié)果。

2.2.4陽(yáng)性樣本定量

挑選3個(gè)qPCR檢測(cè)結(jié)果為強(qiáng)陽(yáng)性的樣本，用陰性稀釋液稀釋陽(yáng)性樣本的核酸，梯度為1，10，100倍稀釋。取200ul樣本，使用核酸提取或純化試劑提取樣本核酸，重復(fù)2次。提取的核酸進(jìn)行數(shù)字PCR ORF1ab單基因定量，計(jì)算原始樣本病毒拷貝數(shù)。

計(jì)算公式：

Y：原始樣本病毒核酸拷貝數(shù);D：稀釋倍數(shù);S：提取樣本量;E提取后核酸體積;T：反應(yīng)核酸體積;R：反應(yīng)體系體積;Q：定量拷貝數(shù)。

2.2.5線性化驗(yàn)證

取2.2.5的陽(yáng)性核酸樣本，直接進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。通過(guò)GraphPad軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性分析，X為RT-PCR檢測(cè)的Ct值，Y為L(zhǎng)og10ddPCR定量的核酸數(shù)值，P < 0.05認(rèn)為有意義。

2.2.6最低檢出限確定

取1例定量后的陽(yáng)性樣本，用陰性稀釋液，采用倍比稀釋法將樣本核酸拷貝數(shù)稀釋到2000，1000，500，250 copies/ml，各三份。使用核酸提取或純化試劑提取各樣本核酸并收集。提取的核酸樣本使用數(shù)字PCR核酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行ORF1ab和N基因雙基因擴(kuò)增檢測(cè)。根據(jù)檢出結(jié)果，確定最低檢出限。

2.2.7最低檢出限驗(yàn)證

取3例定量后的陽(yáng)性樣本，用陰性稀釋液稀釋到最低檢出限的基因拷貝數(shù)，各20份。核酸提取或純化試劑提取樣本核酸并收集，使用數(shù)字PCR核酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行ORF1ab和N基因雙基因擴(kuò)增檢測(cè)。檢出率 > 90% 則認(rèn)為該拷貝濃度是最低檢出限。

2.2.8臨床樣本驗(yàn)證

取15例RT-PCR檢測(cè)后的樣本，1例為陰性，6例為陽(yáng)性，8例為疑似陽(yáng)性。樣本核酸使用ddPCR進(jìn)行OFR1ab和N基因雙基因擴(kuò)增檢驗(yàn)，觀察檢出效果。

2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1陽(yáng)性樣本定量結(jié)果

以10倍稀釋的樣本ORF1ab檢出數(shù)值預(yù)估原樣本的濃度。樣本A為7.5×106 copies/ml;樣本B為1.1×107 copies/ml;樣本C為3.0×107 copies/ml。

2.3.2線性化驗(yàn)證

提取的核酸進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，以Log10拷貝數(shù)和RT-PCR的Ct值進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)GraphPad軟件分析二者結(jié)果是否呈線性相關(guān)，如圖1所示。

從圖1可以看出，ddPCR定量的SARS-CoV-2病毒ORF1ab拷貝數(shù)與RT-PCR檢測(cè)的Ct值線性相關(guān)，且p值小于0.0001。

2.3.3最低檢出限確定及驗(yàn)證

樣本在2000，1000，500 copies/ml時(shí)，兩個(gè)基因的檢出率為100%，250 copies/ml，有一個(gè)樣本的ORF1ab基因未檢測(cè)到。因此最低檢出限在500copies/ml和250 copies/ml兩個(gè)濃度中產(chǎn)生。

取ABC三個(gè)樣本，用陰性稀釋液稀釋到250 copies/ml，各20份樣本，進(jìn)行核酸提取和數(shù)字PCR檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。N基因的檢出率為100%，ORF1ab的檢出率為93.3%?？梢源_定該試劑盒的最低檢出限為250 copies/ml。

2.3.4臨床樣本驗(yàn)證

取RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性，弱陽(yáng)性，陰性樣本共15例，進(jìn)行ddPCR檢測(cè)，見(jiàn)表2。樣本1 RT-PCR和ddPCR檢測(cè)都為陰性;樣本2-7，二者都為陽(yáng)性，樣本8-10 RT-PCR結(jié)果為疑似，ddPCR結(jié)果為陰性。樣本11-15 RT-PCR結(jié)果為疑似，ddPCR結(jié)果為陽(yáng)性，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4討論

本研究使用領(lǐng)航基因生產(chǎn)的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒（數(shù)字PCR法）以及相配套的儀器，對(duì)3例陽(yáng)性病人鼻咽拭子樣本進(jìn)行絕對(duì)定量。通過(guò)對(duì)比ddPCR定量結(jié)果和RT-PCR的Ct值確定二者呈線性相關(guān)（圖1）。隨后，選取1例陽(yáng)性樣本進(jìn)行梯度稀釋，測(cè)得ddPCR最低檢出限為250 copies/ml，并用其他2例樣本進(jìn)行驗(yàn)證，ORF1ab基因檢出率為93.3%，N基因檢出率為100%。目前市場(chǎng)上的RT-PCR試劑盒檢出限基本為1000 copies/ml[11]，但患者的許多樣本病毒含量達(dá)不到該檢出限[12]。另外，筆者對(duì)15例樣本進(jìn)行臨床樣本，表2的結(jié)果顯示有8例RT-PCR結(jié)果為疑似的樣本，其中5例樣本ddPCR的結(jié)果為陽(yáng)性，3例為陰性，這表明ddPCR在檢測(cè)低病毒載量樣本方面更具有優(yōu)勢(shì)，減少假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果。這也與Suo[13]和Yu[14]等人的研究結(jié)果一致。隨著新冠疫情在全球愈演愈烈，國(guó)際對(duì)于新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒需求急劇上升。

越來(lái)越多基于RT-PCR的SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑盒被開(kāi)發(fā)并上市，以滿足臨床大規(guī)模分子診斷的需要。目前為止，RT-PCR仍是COVID-19確診的金標(biāo)準(zhǔn)，但是，受限于檢測(cè)靈敏度不足，在檢測(cè)病毒含量低的樣本時(shí)無(wú)法檢出信號(hào)，常導(dǎo)致假陰性的診斷結(jié)果[15]。目前市面上新冠核酸數(shù)字PCR試劑盒僅限用于科研，還未用于臨床診斷。本研究中對(duì)比了RT-PCR和ddPCR兩種檢測(cè)方法對(duì)于SARS-CoV-2的檢測(cè)靈敏度，研究表明，ddPCR能夠檢出相對(duì)較低的病毒載量樣本，因此，在新冠病毒的檢測(cè)中，利用ddPCR技術(shù)，能夠有效降低樣本假陰性和假陽(yáng)性的產(chǎn)生，是核酸檢測(cè)的一個(gè)重要補(bǔ)充方法，對(duì)COVID-19的確診以及后續(xù)治療效果驗(yàn)證具有重要意義。

參考文獻(xiàn)

[1]H S，X H，N J，et al. Radiological findings from 81 patients with COVID-19 pneumonia in Wuhan，China： a descriptive study [J]. Lancet Infect Dis，2020，20（4）：425-434.

[2]VM C，O L，M K，et al. Detection of 2019 novel coronavirus （2019-nCoV） by real-time RT-PCR [J]. Euro Surveill.，2020，25（3）：

[3]J W，J L，S L，et al. Detection and analysis of nucleic acid in various biological samples of COVID-19 patients [J]. Travel Med Infect Dis，2020，101673.

[4]G S，G L，MJ K，et al. Rapid Detection of COVID-19 Causative Virus （SARS-CoV-2） in Human Nasopharyngeal Swab Specimens Using Field-Effect Transistor-Based Biosensor [J]. ACS Nano，2020，14（4）：5135-5142.

[5]R Z，M L，H S，et al. Early detection of SARS-CoV-2 antibodies in COVID-19 patients as a serologic marker of infection [J]. Clin. Infect. Dis.，2020.

[6]X M，HC L，KY D，et al. Artificial intelligence-enabled rapid diagnosis of patients with COVID-19 [J]. Nat. Med.，2020，

[7]Liu R，Han H，Liu F，et al. Positive rate of RT-PCR detection of SARS-CoV-2 infection in 4880 cases from one hospital in Wuhan，China，from Jan to Feb 2020 [J]. Clin Chim Acta，2020，505（172-175.

[8]Valent F，Doimo A，Mazzilis G，et al. RT-PCR tests for SARS-CoV-2 processed at a large Italian Hospital and false negative results among COVID-19 confirmed cases [J]. Infect Control Hosp Epidemiol，2020，1-6.

[9]Kucirka L M，Lauer S A，Laeyendecker O，et al. Variation in False-Negative Rate of Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction-Based SARS-CoV-2 Tests by Time Since Exposure [J]. Ann Intern Med，2020，

[10]PJ S，SH N，MJ B，et al. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution [J]. BioTechniques，1992，13（3）： 444-449.

[11]Visseaux B，Le Hingrat Q，Collin G，et al. Evaluation of the QIAstat-Dx Respiratory SARS-CoV-2 Panel，the first rapid multiplex PCR commercial assay for SARS-CoV-2 detection [J]. J Clin Microbiol，2020，

[12]Callahan C，Lee R，Lee G，et al. Nasal-Swab Testing Misses Patients with Low SARS-CoV-2 Viral Loads [J]. medRxiv，2020，

[13]Suo T，Liu X，F(xiàn)eng J，et al. ddPCR： a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens [J]. Emerg Microbes Infect，2020，9（1）： 1259-1268.

[14]Yu F，Yan L，Wang N，et al. Quantitative Detection and Viral Load Analysis of SARS-CoV-2 in Infected Patients [J]. Clin Infect Dis，2020，

[15]Arnaout R，Lee R A，Lee G R，et al. SARS-CoV2 Testing： The Limit of Detection Matters [J]. bioRxiv，2020，

作者簡(jiǎn)介：周陽(yáng)：碩士，中國(guó)科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院

*通訊作者：張順，蔡挺

資助項(xiàng)目華美基金，項(xiàng)目編號(hào)2020HMZD28;基于數(shù)字PCR技術(shù)的新型冠狀病毒（COVID-19）高靈敏診斷平臺(tái)，2020YJY0205