金銀花水煎液抗流感病毒作用的研究※

朱明珠　毛淑敏　劉玉紅王立娜陳田雨秦樂(lè)邢佰穎

（山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南250355）

金銀花水煎液抗流感病毒作用的研究※

朱明珠毛淑敏劉玉紅*王立娜陳田雨秦樂(lè)邢佰穎

（山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南250355）

目的探究金銀花水煎液對(duì)小鼠體內(nèi)抗流感病毒的作用效果。方法將小鼠隨機(jī)分成四組，每組12只小鼠，包括正常組、模型組、水煎液組、利巴韋林組。鼻腔接種甲型H1N1流感病毒制備小鼠病毒模型，檢測(cè)肛溫，胸腺、脾臟、肺指數(shù)，血清IFN-γ含量，計(jì)算死亡率。結(jié)果金銀花水煎液可以提高病毒小鼠的胸腺、脾臟、肺指數(shù)抑制率，增加血清IFN-γ含量，降低肺指數(shù)，有助于肛溫回升，降低死亡率。結(jié)論金銀花水煎液對(duì)小鼠體內(nèi)抗流感病毒的作用效果顯著。

流感病毒；金銀花水煎液；實(shí)驗(yàn)研究

流行性感冒（inf1uenza，簡(jiǎn)稱流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，具有傳染性強(qiáng)、發(fā)病率高、流行面廣及死亡率高等特點(diǎn)，是人類至今尚不能有效控制的世界性傳染病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，流感每年的發(fā)病率為10%～30%，全球每年約有50萬(wàn)人死于流感，主要死于呼吸系統(tǒng)的并發(fā)癥，特別是重癥肺炎和呼吸窘迫綜合征［1］。因此，重癥流感的治療仍是臨床的重點(diǎn)和難點(diǎn)，急需有效的藥物進(jìn)行治療。金銀花為常用傳統(tǒng)中藥，具清熱解毒、涼散風(fēng)熱之功，臨床上廣泛用于治療上呼吸道病毒感染，療效顯著。為進(jìn)一步確定金銀花的抗流感病毒作用，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，建立甲型H1N1流感病毒感染小鼠模型，研究金銀花水煎液的體內(nèi)抗流感病毒作用。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1儀器EL340i型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Mo1ecu1ar De-vices）；AL204電子天平（精密度：0.0001g，梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司）；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；LGJ-18A冷凍干燥機(jī)（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠）；CT15RT型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司）。

1.1.2試藥甲型H1N1流感病毒鼠肺病毒毒株FM1；金銀花購(gòu)自山東平邑，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)生藥系李佳教授鑒定為忍冬科植物忍冬Lonicera jaPonica Thumb.的帶初開(kāi)的花或干燥花蕾；利巴韋林顆粒（湖南千金湘江藥業(yè)股份有限公司）；干擾素-γ（IFN-γ）（北京四正柏生物科技有限公司）；生理鹽水。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明小鼠，體重（20±2）g，潔凈級(jí)，雌雄小鼠各半，來(lái)自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

12.1試藥制備取金銀花藥材100g，加入30倍量的水，85℃提取3次，90min/次，過(guò)濾，60℃減壓濃縮，凍干，得黃色粉末，即水煎液樣品。

1.2.2實(shí)驗(yàn)小鼠造模與分組昆明小鼠48只，隨機(jī)分成4組，分別為正常組、模型組、水煎液組（300mg/kg）、利巴韋林組（58.5mg/kg，相當(dāng)于人臨床等效劑量），飼養(yǎng)2天后開(kāi)始接種病毒。第0天為接種病毒前，第1天為接種流感病毒，正常組鼻腔滴注生理鹽水，其余各組小鼠滴鼻接種50μL流感病毒，24小時(shí)后灌胃給藥，第2～8天為藥物干預(yù)治療，正常組和模型組以10m1/kg的體積灌喂蒸餾水，水煎液組灌喂同體積的金銀花水煎液，利巴韋林組灌胃同體積的利巴韋林，連續(xù)給藥8天。逐日觀察各組小鼠感染病毒后全身的反應(yīng)，包括進(jìn)食量、呼吸、活動(dòng)狀態(tài)等，記錄小鼠每天的肛溫、體重和死亡情況。

1.2.3肺部病變程度的測(cè)定小鼠病毒感染后第9天，處死小鼠，稱其質(zhì)量，取出全肺，用生理鹽水洗凈，剝離結(jié)締組織、表面脂肪，觀察并記錄肺組織外觀情況。對(duì)小鼠肺的病變程度進(jìn)行分級(jí)。無(wú)病變記為0，病變面積在全肺的1/4以下記為1，病變面積占全肺的1～4/1～2記為2，病變面積占全肺的1～2/3～4記為3，病變面積占全肺的3～4/4～5記為4；病變面積幾乎占肺的全部記為5，計(jì)算肺病變減輕率［2］。

1.2.4肺指數(shù)與肺指數(shù)抑制率的測(cè)定用干凈濾紙吸掉肺組織周圍水分，稱肺重，計(jì)算肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率［3］。

1.2.5脾臟、胸腺指數(shù)的測(cè)定

1.2.6小鼠血清IFN-γ的測(cè)定末次給藥24小時(shí)后，摘眼球取血于離心管內(nèi)，靜置30min，于低溫高速離心機(jī)中離心15min，4000r/min，收集血清，-70℃保存?zhèn)溆?。采用酶?lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA）進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定血清IFN-γ含量，嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行［4］。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1小鼠形態(tài)觀察模型組小鼠感染病毒2天后逐漸飲食減少，毛松易脫落，嗜睡，畏寒發(fā)抖；正常組小鼠皮毛干爽有光澤，喜動(dòng)不喜臥，精神狀態(tài)良好，對(duì)外界環(huán)境反應(yīng)敏捷。

2.2小鼠肛溫變化

表1　小鼠肛溫變化（℃）

圖1　小鼠肛溫變化

結(jié)果見(jiàn)表1和圖1，各組小鼠前期肛溫?zé)o明顯變化；模型組與正常組比較，接種病毒后，小鼠肛溫明顯降低（P<0.05），表明造模成功；水煎液組與模型組比較，小鼠感染病毒降溫后出現(xiàn)體溫的回升，而且，可以看出金銀花水煎液回溫效果和利巴韋林水平相近，表明金銀花水煎液對(duì)抗流感病毒有一定的療效。

2.3肺組織外觀觀察

圖2　各組小鼠肺組織觀察

結(jié)果見(jiàn)圖2，經(jīng)肉眼觀察，正常組小鼠肺組織顏色粉紅，表面比較光滑，無(wú)病變區(qū)；模型組小鼠肺組織顏色為暗褐色，水腫充血嚴(yán)重，存在病變區(qū)；利巴韋林組、水煎液組與模型組比較，均出現(xiàn)不同程度癥狀減輕。

2.4小鼠肺部病變程度

表2　小鼠肺部病變程度級(jí)別及減輕率［只（%）］

結(jié)果見(jiàn)表3，正常組死亡率為0%，模型組死亡率高達(dá)41.67%，與模型組比較，水煎液組和利巴韋林組可以降低病毒感染小鼠的死亡率。小鼠感染流感病毒后引發(fā)肺炎，肺部腫脹，肺指數(shù)相應(yīng)增加。所以，肺指數(shù)可作為指標(biāo)，用于評(píng)價(jià)藥物是否具有抗流感病毒作用。模型組較正常組肺指數(shù)明顯增加，說(shuō)明小鼠感染病毒成功；利巴韋林組肺指數(shù)明顯低于模型組，表明藥物治療有效；水煎液組肺指數(shù)較模型組顯著降低，說(shuō)明金銀花水煎液能抑制流感病毒所致肺病變。通過(guò)水煎液組的肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率與利巴韋林組相比，說(shuō)明金銀花水煎液與利巴韋林在抑制肺部病變上效果相似。

2.6小鼠脾臟、胸腺指數(shù)結(jié)果見(jiàn)表4，水煎液組與模型組比較，小鼠的胸腺指數(shù)顯著提高，脾臟指數(shù)沒(méi)有提高；水煎液組小鼠胸腺指數(shù)與正常組和利巴韋林組相似，胸腺是T淋巴細(xì)胞成熟的場(chǎng)所，它與免疫功能相關(guān)，說(shuō)明金銀花水煎液可以通過(guò)提高胸腺指數(shù)來(lái)提高免疫功能。

表4　金銀花水煎液對(duì)流感病毒感染小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響（m g·g-1）

2.7小鼠血清IFN-γ的含量

表5　金銀花水煎液對(duì)流感病毒感染小鼠IFN-γ含量的影響

表5　金銀花水煎液對(duì)流感病毒感染小鼠IFN-γ含量的影響

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

脾臟指數(shù)（mg·g-1）5.64±3.05#模型組1.55±0.46*3.70±1.17*利巴韋林組2.54±0.44#2.79±0.52水煎液組2.70±1.06#3.40±0.99組別胸腺指數(shù)（mg·g-1）正常組2.48±1.10#

結(jié)果見(jiàn)表5，模型組小鼠血清IFN-γ的含量顯著低于正常組（P<0.05），說(shuō)明造模成功。金銀花水煎液能夠顯著提高小鼠抗體水平（P<0.05），使其恢復(fù)至與利巴韋林組相當(dāng)水平，說(shuō)明金銀花水煎液具有免疫促進(jìn)作用。

3　討論

流感病毒是一種對(duì)人類健康造成極大威脅的常見(jiàn)呼吸道傳染病毒，流感病毒導(dǎo)致機(jī)體抵抗力下降，肺組織受到感染，出現(xiàn)肺部嚴(yán)重充血和水腫，病變程度日益加重。目前，用于治療流感病毒感染的疾病多數(shù)是合成藥物，對(duì)機(jī)體的毒副作用比較大。金銀花水煎液作為傳統(tǒng)中藥，對(duì)機(jī)體的毒副作用較小，故采用金銀花水煎液來(lái)研究其抗流感病毒的作用。

研究表明，小鼠流感病毒感染致命的原因多是宿主的免疫病理?yè)p傷，并不是病毒所導(dǎo)致直接細(xì)胞病理的改變。IFN-γ主要是由活化的NK細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生的，是動(dòng)物機(jī)體重要的細(xì)胞因子，具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用、抗腫瘤和抗病毒作用［5］。細(xì)胞因子IFN-γ能增強(qiáng)MHC-4類和Ⅲ類抗原的表達(dá)，促進(jìn)T細(xì)胞和B細(xì)胞的分化，促進(jìn)CD4+T細(xì)胞分化成TH1亞群，抑制TH2細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性，激活單核-巨噬細(xì)胞方面的作用，具有抗病毒及免疫調(diào)節(jié)作用［6］。水煎液組小鼠血清中IFN-γ較模型組明顯增多，說(shuō)明金銀花水煎液能促進(jìn)IFN-γ的分泌，起到抗病毒作用，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。

實(shí)驗(yàn)證明，感染流感病毒后小鼠肛溫開(kāi)始下降，金銀花水煎液干預(yù)治療后，小鼠肛溫逐漸回升，體征有不同程度改善，肺部病變程度顯著減輕，肺指數(shù)在一定程度上降低，肺指數(shù)抑制率、胸腺指數(shù)在一定程度上提高，死亡率降低。

綜上所述，金銀花水煎液對(duì)防治流感病毒的感染有顯著作用，其進(jìn)入受流感病毒感染的機(jī)體后，抑制病變程度，使機(jī)體的免疫功能明顯增強(qiáng)，此結(jié)論為金銀花水煎液臨床應(yīng)用提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］馬月霞.常用中藥注射液不同配伍抗小鼠甲型H1N1流感重癥肺炎的療效研究［D］.北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2014：5.

［2］朱紅紅，尹鴻萍.鹽藻多糖抗病毒實(shí)驗(yàn)研究［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007（5）:310-312.

［3］彭紹忠，李耿，秦臻，等.廣藿香不同提取部位體內(nèi)抗流感病毒作用研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011（11）:2578-2579.

［4］田連起.大青龍湯抗甲型H1N1流感病毒及解熱的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究［D］.武漢：湖北中醫(yī)藥大學(xué)，2013：5.

［5］楊鴻，鄧樺，盧月媚，等.玉屏風(fēng)復(fù)合多糖對(duì)免疫低下小鼠血清IL-2和IFN-γ含量的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（12）:3571-3572.

［6］李榮榮，楊勇，容蓉，等.麻黃細(xì)辛附子湯對(duì)腎陽(yáng)虛外感模型小鼠的干預(yù)作用［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013（3）:226-230.

ZHu mingzhu MAO shUmin LIu yUhong WANG lina CHENtianyu QINle XING baiying
（College of Pharmacy， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Ji'nan 250355， China）

Objective To exP1ore the effect of Lonicera jaPonica Water decoction on inf1uenza virus infected mice.Methods The mice Were random1y divided into four grouPs，With 12mice in each grouP，inc1uding norma1grouP，mode1grouP，Water decoction grouPand ribavirin grouP.We PrePared mouse virus mode1by inf1uenza virus in nasa1cavity.The recta1temPerature，death rate，thymus index，sP1een index，1ung index and serum IFN-γ content Were measured.Results The 1onicera jaPonica Water decoction marked1y imProved the thymus index，sP1een index，1ung index inhibition rate，increased the serum IFN-γ content，reduced 1ung index，he1Ped to recover the recta1temPerature，and reduced death rate.Conclusion The antivira1effect of 1onicera jaPonica Water decoction on inf1uenza virus infection in mice is significant.

inf1uenza virus；1onicera jaPonica Water decoction；exPerienta1study

10.3969/j.issn.1672-2779.2016.09.059

1672-2779（2016）-09-0135-03

山東省自主創(chuàng)新專項(xiàng)項(xiàng)目（No：2013CXC20401）；山東中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生研究訓(xùn)練（SRT）計(jì)劃資助項(xiàng)目（No:2015349）

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（本文編輯：張文娟本文校對(duì)：張文娟2016-02-01）