左卡尼汀對(duì)自然衰老模型大鼠的心臟保護(hù)作用及其分子機(jī)制研究

張珍，張霞，劉春，蔡文升，李雪輝，邢艷秋

隨著我國社會(huì)老齡化加劇，增齡相關(guān)的心血管疾病、代謝疾病已成為影響老年人生活和健康的主要疾?。?］。增齡不僅是心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素，同時(shí)也是增加患者死亡率的重要原因，給家庭和社會(huì)造成極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［2］。因此，深入研究心臟衰老的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，探索延緩衰老的有效策略具有積極深遠(yuǎn)的社會(huì)意義。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，左卡尼汀具有強(qiáng)大的抗氧化和抗炎作用，可以通過調(diào)控c-Jun氨基末端激酶（JNK）/P53/衰老相關(guān)分泌表型（SASP）信號(hào)通路抑制衰老大鼠脂肪組織的慢性炎性反應(yīng)［3］。但是左卡尼汀是否可以保護(hù)自然衰老的心臟及其可能的分子機(jī)制目前尚不清楚。因此，本研究以自然飼養(yǎng)的24月齡大鼠來構(gòu)建自然衰老動(dòng)物模型，旨在揭示左卡尼汀對(duì)衰老心臟的保護(hù)作用及其分子機(jī)制。

本研究價(jià)值：

本研究以自然衰老大鼠為模型，模擬在自然衰老狀態(tài)下心臟結(jié)構(gòu)和功能的變化，發(fā)現(xiàn)心臟線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變及能量代謝紊亂早于心臟功能病理性改變；左卡尼汀灌胃可提高自然衰老模型大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS），改善其心臟收縮功能；降低丙二醛（MDA）水平，增加超氧化物歧化酶（SOD）活性，進(jìn)而改善大鼠機(jī)體抗氧化能力，同時(shí)可保護(hù)衰老心肌線粒體結(jié)構(gòu)和增加衰老心肌三磷酸腺苷（ATP）的生成，其機(jī)制可能與調(diào)控磷酸化-AMP依賴的蛋白激酶（p-AMPK）/肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1（CPT-1）信號(hào)通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間 本實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2017年1月—2019年6月。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本研究按照《山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用規(guī)范》執(zhí)行所有動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)程序。本實(shí)驗(yàn)選取3月齡SPF級(jí)雄性大鼠30只，購于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)環(huán)境統(tǒng)一為室溫（22.0±1.5）℃，濕度（55±5）%，自然晝夜光線。所有大鼠維持自由飲水和飲食。

1.3 試劑與儀器 左卡尼汀由美國Sigma公司提供，純度為99%以上；磷酸化-AMP依賴的蛋白激酶（p-AMPK）抗體、肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1（CPT-1）抗體和GAPDH抗體由英國Abcam公司提供；實(shí)驗(yàn)所需儀器如離心機(jī)、高效液相色譜儀等由山東省心血管疾病蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方法 將在標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)環(huán)境下自然飼養(yǎng)至4月齡的大鼠（體質(zhì)量為350～400 g）作為青年對(duì)照組（n=10）。將在標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)環(huán)境下自然飼養(yǎng)至24月齡的大鼠（體質(zhì)量為480～590 g）隨機(jī)分為左卡尼汀組（n=10）和老年對(duì)照組（n=10）。左卡尼汀組大鼠給予左卡尼汀300 mg·kg-1·d-1，老年對(duì)照組大鼠給予等量0.9%氯化鈉溶液，均連續(xù)灌胃4周。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 心臟收縮、舒張功能指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)所有大鼠稱重；按照40 mg/kg的劑量腹腔注射3%戊巴比妥麻醉各組大鼠。參照文獻(xiàn)［4］中的操作方法進(jìn)行M型超聲心動(dòng)圖檢查，超聲參數(shù)設(shè)定如下：探頭頻率為9 MHz，掃描深度為4 cm。記錄各組大鼠心臟收縮、舒張功能指標(biāo)，包括左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左心室舒張末期容積（LVEDV）、左心室收縮末期容積（LVESV）、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS）。

1.5.2 血清丙二醛（MDA）水平、超氧化物歧化酶（SOD）活性 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，按照40 mg/kg的劑量腹腔注射3%戊巴比妥麻醉各組大鼠；經(jīng)腹主動(dòng)脈穿刺取血，3 000 r/min離心10 min（離心半徑10 cm），取血清；按照MDA和SOD檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)各組大鼠血清MDA水平、SOD活性。

1.5.3 線粒體超微結(jié)構(gòu) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死各組大鼠，取離體心臟，剪取心尖組織1～2 mm3；采用0.9%氯化鈉溶液反復(fù)沖洗心尖組織，而后置于4%戊二醛固定液中；常規(guī)制片后電鏡下（×15 000）觀察大鼠心肌細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)。

1.5.4 心肌組織三磷酸腺苷（ATP）水平 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死各組大鼠，取離體心臟，剪取心尖組織1～2 mm3；采用高效液相色譜法檢測(cè)各組心肌組織ATP水平。所用儀器為Hypersil ODS（C18）液相色譜分析柱（規(guī)格為250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為室溫，流動(dòng)相為pH值6.5的50 mmol/L磷酸鉀緩沖液。檢測(cè)參數(shù)設(shè)置如下：流速為1 ml/min，紫外線波長為254 nm。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算各組大鼠心肌組織ATP水平。

1.5.5 心肌組織p-AMPK、CPT-1水平 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死各組大鼠，取離體心臟，剪取心肌組織30～40 mg，按照文獻(xiàn)［3］的方法，以GAPDH為參照，采用Western blotting法檢測(cè)各組大鼠心肌組織p-AMPK、CPT-1水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心臟收縮、舒張功能指標(biāo)比較 各組LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV、LVEF、LVFS比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。老年對(duì)照組LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV大于青年對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；左卡尼汀組LVESD、LVESV小于青年對(duì)照組，LVEF、LVFS高于青年對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；左卡尼汀組LVEDD、LVESD、LVEVD、LVESV小于老年對(duì)照組，LVFS高于老年對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

2.2 各組血清MDA水平、SOD活性比較 各組血清MDA水平、SOD活性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。老年對(duì)照組血清MDA水平高于青年對(duì)照組，SOD活性小于青年對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；左卡尼汀組血清MDA水平高于青年對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；左卡尼汀組血清MDA水平低于老年對(duì)照組，SOD活性大于老年對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

2.3 線粒體超微結(jié)構(gòu) 青年對(duì)照組大鼠心肌線粒體排列整齊，形態(tài)呈圓形或卵圓形，整個(gè)線粒體腔充滿整齊、密集、均勻分布與排列的嵴；與青年對(duì)照組大鼠相比，老年對(duì)照組大鼠線粒體形態(tài)各異，部分線粒體腫脹明顯，基質(zhì)出現(xiàn)多個(gè)局灶性空泡；與老年對(duì)照組相比，左卡尼汀組大鼠心肌細(xì)胞線粒體體積明顯縮小，偶見空泡變性，線粒體嵴排列整齊致密（見圖1）。

表1 各組心臟收縮、舒張功能指標(biāo)比較（±s，n=10）Tabel 1 Comparison of systolic and diastolic function indexes in each group

表1 各組心臟收縮、舒張功能指標(biāo)比較（±s，n=10）Tabel 1 Comparison of systolic and diastolic function indexes in each group

注：與青年對(duì)照組比較，aP＜0.05；與老年對(duì)照組比較，bP＜0.05；LVEDD=左心室舒張末期內(nèi)徑，LVESD=左心室收縮末期內(nèi)徑，LVEDV=左心室舒張末期容積，LVESV=左心室收縮末期容積，LVEF=左心室射血分?jǐn)?shù)，LVFS=左心室短軸縮短率

組別 LVEDD（mm） LVESD（mm） LVEDV（ml） LVESV（ml） LVEF（%） LVFS（%）青年對(duì)照組 7.15±0.64 4.67±0.57 270.31±54.84 102.75±30.09 62.18±5.84 34.70±4.55老年對(duì)照組 8.47±0.59a 5.59±0.97a 393.45±60.32a 158.05±61.78a 60.89±9.82 34.33±7.04左卡尼汀組 6.59±1.84b 3.41±1.31ab 241.80±135.12b 54.37±43.59ab 77.67±8.84a 48.02±8.86ab F值 6.746 12.050 7.825 12.192 12.535 12.267 P值 0.004 ＜0.001 0.002 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

圖1 各組大鼠心肌細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)（×15 000）Figure 1 Mitochondrial ultrastructures in the cardiomyocytes of rats in each group

2.4 各組心肌組織ATP、p-AMPK、CPT-1水平比較 各組心肌組織ATP、p-AMPK、CPT-1水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。老年對(duì)照組心肌組織ATP、p-AMPK、CPT-1水平低于青年對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；左卡尼汀組心肌組織ATP、p-AMPK、CPT-1水平高于老年對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表3、圖2）。

3 討論

左卡尼汀作為哺乳動(dòng)物體內(nèi)天然存在的氨基酸衍生物，不僅參與機(jī)體能量代謝，還具有抗炎和抗氧化作用。本研究構(gòu)建自然衰老動(dòng)物模型，觀察左卡尼汀灌胃對(duì)衰老大鼠的心臟保護(hù)作用及其分子機(jī)制，結(jié)果證實(shí)，左卡尼汀灌胃處理可改善自然衰老大鼠心臟功能和心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)，具有保護(hù)衰老心肌的作用。

隨著年齡的增長，心臟逐漸發(fā)生心肌細(xì)胞纖維化和淀粉樣變等結(jié)構(gòu)重構(gòu)，同時(shí)伴隨心肌收縮和舒張功能減退等一系列增齡性改變，進(jìn)而增加冠心病、心力衰竭等心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)和死亡風(fēng)險(xiǎn)［5］。本研究結(jié)果顯示，老年對(duì)照組LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV大于青年對(duì)照組，老年對(duì)照組與青年對(duì)照組LVEF、LVFS比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明隨著年齡增長，自然衰老大鼠的心臟雖然在結(jié)構(gòu)上出現(xiàn)了與體質(zhì)量增加相關(guān)的生理性擴(kuò)大，但收縮和舒張功能尚未出現(xiàn)病理性減退，與既往研究結(jié)果一致［6］。左卡尼汀組LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV小于老年對(duì)照組，LVFS高于老年對(duì)照組，LVEF與老年對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示左卡尼汀主要作用是增強(qiáng)自然衰老大鼠心肌的收縮與舒張功能，這與既往在臨床上觀察到的補(bǔ)充左卡尼汀能夠明顯改善心力衰竭患者心功能的研究結(jié)果一致［7］。

圖2 Western blotting法檢測(cè)各組大鼠心肌組織p-AMPK、CPT-1水平的電泳圖Figure 2 Electrophoretogram of p-AMPK and CPT-1 in myocardial tissue of rats in each group detected by Western blotting method

表2 各組血清MDA水平、SOD活性比較（±s，n=10）Table 2 Comparison of serum MDA level and SOD activity in each group

表2 各組血清MDA水平、SOD活性比較（±s，n=10）Table 2 Comparison of serum MDA level and SOD activity in each group

注：與青年對(duì)照組比較，aP＜0.05；與老年對(duì)照組比較，bP＜0.05；MDA=丙二醛，SOD=超氧化物歧化酶

組別 MDA（nmol/ml） SOD（U/ml）青年對(duì)照組 6.4±0.9 167.8±28.6老年對(duì)照組 11.9±1.4a 122.3±14.8a左卡尼汀組 8.3±1.0ab 175.2±22.6b F值 62.095 15.905 P 值 ＜0.001 ＜0.001

表3 各組心肌組織ATP、p-AMPK、CPT-1水平比較（±s，n=10）Table 3 Comparison of the levels of p-AMPK and CPT-1 in myocardial tissue in each group

表3 各組心肌組織ATP、p-AMPK、CPT-1水平比較（±s，n=10）Table 3 Comparison of the levels of p-AMPK and CPT-1 in myocardial tissue in each group

注：與青年對(duì)照組比較，aP＜0.05；與老年對(duì)照組比較，bP＜0.05；ATP=三磷酸腺苷，p-AMPK=磷酸化-AMP依賴的蛋白激酶，CPT-1=肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1

組別 ATP（ng/g） p-AMPK CPT-1青年對(duì)照組 99.63±9.71 0.56±0.04 0.55±0.04老年對(duì)照組 56.79±11.84a 0.42±0.02a 0.44±0.02a左卡尼汀組 101.89±11.76b 0.55±0.02b 0.54±0.02b F值 51.968 76.250 46.250 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

本研究結(jié)果顯示，老年對(duì)照組血清MDA水平高于青年對(duì)照組，SOD活性小于青年對(duì)照組；左卡尼汀組血清MDA水平高于青年對(duì)照組；左卡尼汀組血清MDA水平低于老年對(duì)照組，SOD活性大于老年對(duì)照組；提示左卡尼汀可降低自然衰老大鼠血清MDA水平，恢復(fù)SOD活性。既往研究表明，左卡尼汀具有協(xié)助心肌細(xì)胞清除氧自由基、減少活性氧（ROS）的形成、增加抗氧化蛋白SOD2表達(dá)等抗氧化能力，其機(jī)制可能與激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3（STAT3）抗氧化信號(hào)通路、降低心肌細(xì)胞鈣離子/鈣調(diào)素依賴性的蛋白激酶Ⅱ3（CaMKⅡ3）有關(guān)［8］。因此，筆者推測(cè)左卡尼汀可能通過降低血清MDA水平、增加SOD活性來提高自然衰老大鼠的抗氧化能力，進(jìn)而保護(hù)大鼠的心臟。

本研究結(jié)果顯示，與青年對(duì)照組大鼠相比，老年對(duì)照組大鼠線粒體形態(tài)各異，部分線粒體腫脹明顯，基質(zhì)出現(xiàn)多個(gè)局灶性空泡；與老年對(duì)照組相比，左卡尼汀組大鼠心肌細(xì)胞線粒體體積明顯縮小，偶見空泡變性，線粒體嵴排列整齊致密，表明衰老心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)和功能受損，且這一病理改變?cè)谛呐K功能減退之前即已存在［9］。因此，筆者推測(cè)線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損可能是心臟衰老發(fā)生、發(fā)展的始發(fā)因素和早期表現(xiàn)，而左卡尼汀有效改善自然衰老大鼠的心臟功能可能與保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)。

AMP依賴的蛋白激酶（AMPK）是調(diào)控心肌能量的主要信號(hào)分子，磷酸化后可上調(diào)脂肪酸氧化中限速酶CPT-1的表達(dá)，參與脂肪酸氧化、能量合成和衰老的發(fā)生、發(fā)展［10］。左卡尼汀作為CPT-1的輔助因子，可協(xié)助長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)進(jìn)行脂肪酸的β-氧化，為機(jī)體提供能量。本研究結(jié)果顯示，老年對(duì)照組心肌組織ATP、p-AMPK、CPT-1水平低于青年對(duì)照組；左卡尼汀組心肌組織ATP、p-AMPK、CPT-1水平高于老年對(duì)照組。該結(jié)果說明衰老心肌中AMPK信號(hào)通路被抑制，CPT-1表達(dá)下降，且伴隨ATP生成的減少等代謝功能障礙［11-12］，而左卡尼汀可能通過上調(diào)p-AMPK、CPT-1的表達(dá)而增加ATP生成，進(jìn)而發(fā)揮抗心臟衰老的作用。

本研究雖然明確了左卡尼汀通過上調(diào)AMPK/CPT-1信號(hào)通路來發(fā)揮其心臟保護(hù)作用，但尚未明確其是否可同時(shí)通過增加脂肪酸氧化而實(shí)現(xiàn)該作用，這也是下一步的研究方向。

綜上所述，左卡尼汀可改善自然衰老模型大鼠心臟功能，提高其抗氧化能力，保護(hù)衰老心肌線粒體結(jié)構(gòu)和增加衰老心肌ATP生成，其機(jī)制可能與上調(diào)AMPK/CPT-1信號(hào)通路有關(guān)。本研究為深入研究衰老心臟的發(fā)生機(jī)制和探索有效延緩衰老的方法提供了新的視角和策略。

作者貢獻(xiàn)：張珍進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，撰寫論文并進(jìn)行英文的修訂；邢艷秋進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析、論文的修訂，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理；張霞、劉春、蔡文升、李雪輝進(jìn)行數(shù)據(jù)收集；張珍、張霞進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；張珍、邢艷秋進(jìn)行結(jié)果的分析與解釋。

本文無利益沖突。