PM 2.5對大鼠肺組織Nrf2/HO-1通路的影響及維生素C的干預(yù)作用

韓書芝 李海月 尹航 平芬

1河北省人民醫(yī)院老年病三科,石家莊050051;2承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸科067000

隨著社會工業(yè)化的發(fā)展,空氣污染問題已成為公眾關(guān)注的焦點。近年來,頻發(fā)的霧霾天氣已成為我國空氣污染的主要原因。而霧霾中的細顆粒物(PM2.5)已成為危害人類健康最嚴(yán)重的且危害正在進一步加深的空氣污染因素之一[1]。流行病學(xué)研究表明,大氣細顆粒物與多種呼吸系統(tǒng)疾病及心腦血管疾病的發(fā)病率與死亡率密切相關(guān)[2]。PM2.5對健康的不利影響首先表現(xiàn)在呼吸系統(tǒng),PM2.5長期吸入可以導(dǎo)致氣道上皮纖毛粘連、紊亂、倒伏和缺失;影響杯狀細胞和漿液細胞的分泌功能[3];降低自然殺傷細胞和肺泡巨噬細胞的數(shù)量和活性,降低氣道的防御功能[4]。不僅如此,PM2.5進入肺泡后,肺泡表面活性物質(zhì)吸附在PM2.5表面,使得肺泡表面活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,破壞了其正常物理性質(zhì),增加哮喘加重及呼吸道感染、肺結(jié)核、肺癌等呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率[5]。因此,研究PM2.5肺損傷機制,為臨床提供有效的防御措施具有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性Wistar大鼠40只,體質(zhì)量150～200 g,均購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,飼養(yǎng)于河北省人民醫(yī)院動物飼養(yǎng)室。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組 健康雄性Wistar大鼠40只,在動物飼養(yǎng)室內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)一周,自由進食、飲水,飼養(yǎng)溫度為22～24 ℃,濕度為45%～55%,晝夜節(jié)律為12 h。采用隨機數(shù)字表法隨機分為5組。(1)空白對照組 (C 組,n=8):不予處理。(2)生理鹽水對照組 (NS組,n=8):給予氣管插管滴生理鹽水1 ml/kg,每周1次,共4次。(3)PM2.5染毒組 (PM2.5組,n=8):給予氣管插管滴PM2.5(提前用生理鹽水配成7.5 g/L)1 ml/kg,每周1次,共4次。(4)維生素C 低劑量組(LVC組,n=8):染毒同PM2.5組,實驗開始后給予10 ml/kg維生素C (提前用蒸餾水配成10 g/L)灌胃,每天1次,共4周。(5)維生素C高劑量組(HVC組,n=8):染毒同PM2.5組,實驗開始后給予10 ml/kg維生素C (提前用蒸餾水配成30 g/L)灌胃,每天1次,共4周。5組動物均自由進食水,于最后一次染毒24 h后處死動物,取材檢測。本研究符合《赫爾辛基宣言》的原則。

1.2.2 標(biāo)本留取 用10%水合氯醛 (4 ml/kg)腹腔注射麻醉,抽取5 ml腹主動脈血后處死。取右下肺組織,甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,切片、HE染色,光鏡下觀察肺組織病變。余肺-80 ℃保存待測。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡檢測HO-1、Nrf2的表達 取少量肺組織稱量,記錄;按試劑盒要求加裂解液、PMSF和蛋白酶抑制劑于2 ml EP管中混勻。提取肺組織細胞蛋白并用BCA 法測蛋白濃度;取40μg蛋白上樣,SDS-PAGE 電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上。將膜放入25 ml封閉液,室溫搖2 h;一抗4 ℃孵育過夜;TBST 洗滌3次×10 min;二抗常溫孵育1.5 h,TBST 洗滌3 次×10 min。將膜置于發(fā)光混合液 (A、B 試劑各0.1 ml),放入蛋白質(zhì)印跡成像儀照相。用目的條帶與β-actin的灰度值的比來表達目的蛋白的相對表達量。

1.2.4 實時PCR 檢測HO-1 m RNA 的表達 提取RNA:取約100 mg肺組織于2 ml EP管中,加1 ml 的RNAiso Plus 勻 漿,室 溫 靜 置5 min;12 000×g,4 ℃,離心5 min,取上清放入另一1.5 ml EP管中。采用Trizol方法經(jīng)分離、沉淀、洗脫和再溶解獲取RNA。測RNA 濃度,并記錄。電泳鑒定RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成c DNA。采用實時PCR檢查HO-1 m RNA 的表達。在熒光定量PCR運行過程中,借助軟件實時觀察PCR 熒光擴增曲線,采集分析數(shù)據(jù)。熔解曲線:Tm＞85 ℃,并呈單峰認(rèn)為擴增為特異性;相對定量結(jié)果計算2-ΔΔCt:ΔCt=Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因,ΔΔCt=ΔCt實驗樣本-ΔCt對照樣本。計算表達水平比值,比值=2-ΔΔCt。HO-1正向引物:5'-GCTCTATCGTGCTCGCATGA-3',反向引物:5'-AATTCCCACTGCCACGGTC-3';β-actin 正 向 引 物:5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3',反向引物:5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'(由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司提供)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s 表示,采用單因素方差分析比較各組間指標(biāo)的差異,兩組間比較采用LSD-t檢驗。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織病理表現(xiàn) 光鏡下可見,C組和NS組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整,間質(zhì)無水腫,肺泡間毛細血管無擴張充血。PM2.5組大鼠肺泡間隔明顯增厚或融合,肺泡間隔斷裂,可見明顯的間質(zhì)水腫,毛細血管擴張,小氣道及間質(zhì)內(nèi)大量炎性細胞浸潤。維生素C 干預(yù)組大鼠肺泡破壞及炎性細胞浸潤較PM2.5組大鼠減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理表現(xiàn) A:空白對照組;B:生理鹽水對照組;C:PM 2.5染毒組;D:維生素C 低劑量組;E:維生素C高劑量組 HE ×100

2.2 各組大鼠肺組織中Nrf2、HO-1蛋白表達 與C組及NS組比較,PM2.5組Nrf 2(總蛋白及核蛋白)及HO-1 表達明顯降低 (P 值均＜0.05);PM2.5組Nrf2 核 蛋 白 及HO-1 蛋 白 與LVC 組 及HVC組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P 值均＜0.05);PM2.5組Nrf2總蛋白與HVC組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05),與LVC 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。各蛋白表達在維生素C 不同劑量組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織中HO-1蛋白、Nrf2總蛋白及核蛋白表達的比較 A:電泳圖;B:柱狀圖

2.3 各組大鼠肺組織中HO-1 m RNA 表達 與C組 及NS 組 比 較,PM2.5組 大 鼠 肺 組 織HO-1 m RNA 表達下降 (P 值均＜0.05);維生素C 各劑量組HO-1 m RNA 表達較PM2.5組升高 (P 值均＜0.05),維生素C 低、高劑量組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3。

3 討論

目前在我國PM2.5污染狀況十分嚴(yán)峻。大氣PM2.5的主要來源為汽車尾氣和煤炭燃燒。相比大氣PM2.5,煤炭燃燒所產(chǎn)生的PM2.5中含有更多的有機物(如多環(huán)芳烴)及砷、鎳等重金屬成分,其組成復(fù)雜,有害元素高度富集。研究發(fā)現(xiàn),相同劑量不同組分的PM2.5細胞毒性不同,其中水溶性成分的細胞毒性大于有機成分的細胞毒性[6]。

圖3 各組大鼠肺組織中HO-1 m RNA 的表達

流行病學(xué)資料提示PM2.5與呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7-9]。PM2.5通過呼吸道進入體內(nèi),首先對呼吸系統(tǒng)造成損害,導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率升高及肺功能的下降。一項針對北京市區(qū)門診呼吸道疾病就診的統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),PM2.5濃度每增加10μg/m3,總呼吸系統(tǒng)疾病的就診數(shù)增加0.23%,其中上呼吸道感染增加0.19%,下呼吸道感染增加0.34%,COPD 急性加重增加1.46%[10]。環(huán) 境PM2.5濃 度 每 上 升2 μg/m3,FEV1下降13.5 ml,并且下降速度每年增加2.1 ml[11]。

目前認(rèn)為PM2.5所致肺損傷的主要機制包括氧化應(yīng)激、炎癥損傷、免疫損傷,各個機制之間并不是完全獨立存在的,氧化應(yīng)激可導(dǎo)致炎性損傷,炎性損傷也可導(dǎo)致體內(nèi)氧化/抗氧化平衡失調(diào)。細胞染毒實驗發(fā)現(xiàn),PM2.5吸附的重金屬離子可通過促進NADPH 氧化酶形成大量自由基,進而使人肺上皮細胞遺傳物質(zhì)發(fā)生斷裂、脂質(zhì)過氧化,并可以參與調(diào)節(jié)一些與細胞活力相關(guān)的信號通路。機體細胞本身具有復(fù)雜的抗氧化系統(tǒng),包括Akt/STAT3/NF-κB 系 統(tǒng)、Nfr2/HO-1 信 號 通 路[12-13]等。本文對Nrf2/HO-1抗氧化酶通路在PM2.5所致肺氧化損傷過程中的作用進行了觀察。Nfr2/HO-1信號通路具有抗炎、抗氧化、減少線粒體損傷、調(diào)節(jié)Ca2+內(nèi)流、調(diào)控細胞死亡等作用,是抗氧化應(yīng)激反應(yīng)不可或缺的信號通路。生理狀態(tài)下,在胞質(zhì)內(nèi)的Nrf2 與細胞骨架相關(guān)性抑制蛋白Keap1結(jié)合形成一個復(fù)合體,使Nrf2經(jīng)泛素蛋白酶途徑降解。PM2.5可刺激機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激,引起Keap1的修飾,從而使Keap1募集Nrf2的功能發(fā)生改變,Keap1-Nrf2復(fù)合體解離,Nrf2從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細胞核,與受其調(diào)控的抗氧化酶基因的ARE結(jié)合,從而啟動編碼解毒和抗氧化的基因表達,使其表達上調(diào),促進細胞存活。HO-1即是受其調(diào)控的一個非常重要的酶類,形成一個Nrf2/HO-1通路[13]。

Nrf2誘導(dǎo)HO-1等Ⅱ相酶的合成在抗氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用,甚至可以預(yù)防突變和癌癥。Nrf2雖然可被外界刺激物誘導(dǎo),但有一定界限,當(dāng)刺激的濃度和時間延長時,Nrf2的表達下降[14]。HO-1作為機體內(nèi)保護性誘導(dǎo)蛋白可以通過抗氧化、抗炎、抗凋亡等發(fā)揮器官保護作用。其分解血紅素產(chǎn)生的降解產(chǎn)物CO、Fe2+、膽綠素也具有抗氧化、自由基清除等極強的肺保護作用。

本實驗中給予大鼠PM2.5氣管滴藥4次后,肺組織中Nrf2 總蛋白及核蛋白表達均明顯下降,HO-1蛋白及m RNA 表達也減少,給予維生素C干預(yù)后大鼠肺組織中Nrf2及HO-1表達較PM2.5染毒組升高。通過蛋白質(zhì)印跡、PCR 檢測均證實了這一點。推測維生素C干預(yù)后可使PM2.5暴露大鼠肺組織Nrf2總蛋白表達上調(diào),并促進Nrf2的活化轉(zhuǎn)位入核促進其下游抗氧化酶HO-1及其降解產(chǎn)物膽紅素(主要是間接膽紅素)共同發(fā)揮抗氧化作用。不同劑量維生素C 干預(yù)組差異無統(tǒng)計學(xué)意義,提示低劑量維生素C 可發(fā)揮抗氧化作用。有研究提示高劑量維生素C可加重氧化損傷[15]。

以 上 結(jié) 果 表 明,PM2.5可 引 起Nrf2/HO-1 信號通路表達異常導(dǎo)致肺臟氧化損傷,維生素C 對PM2.5所引起的損傷有一定程度的改善,其確切機制有待進一步研究。

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