基于GB 4789.10-2016的銀白色葡萄球菌鑒定方法的改進(jìn)

金方寧 張道鋒 區(qū)楚君 史賢明 施春雷

（上海交通大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院中美食品安全聯(lián)合研究中心 上海200240）

銀白色葡萄球菌 （Staphylococcus argenteus，簡稱銀葡菌）是金黃色葡萄球菌（S.aureus，簡稱金葡菌）的遠(yuǎn)源分化譜系之一，于2015年正式鑒定為新物種[1]。由于銀葡菌基因組中缺少操縱子crtOPQMN，導(dǎo)致無法合成葡萄球菌黃素（Staphyloxanthin），其細(xì)菌菌落為乳白色[2]，易與菌落表型為白色的金葡菌相混淆，因此無法通過菌落顏色將二者區(qū)分。銀葡菌和金葡菌雖然在表型和基因型上有諸多相似之處，但是與金葡菌在核心基因組上存在約10%的差異[2]。常規(guī)的生化分析很可能將銀葡菌錯誤地鑒定為金葡菌，16S rRNA 測序分子鑒定方法也無法區(qū)分銀葡菌和金葡菌[1]。多位點序列分型（Multilocus sequence typing，MLST）雖可明確區(qū)分金葡菌和銀葡菌，但金葡菌的7 個MLST基因位點中，aroE 和glpf 很難擴(kuò)增，需重新設(shè)計引物才能完成MLST 分型，這可能導(dǎo)致很多銀葡菌分離株在早期研究中未被報道或被忽略[3-4]。

迄今為止，已有20 多個國家和地區(qū)相繼報道從醫(yī)院或社區(qū)獲得銀葡菌，證實了銀葡菌為全球分布，且多與嚴(yán)重的發(fā)病率、死亡率以及醫(yī)院感染有關(guān)[5]。產(chǎn)毒性銀葡菌的無癥狀攜帶者往往是疾病的潛在來源，也是食品污染的主要風(fēng)險，可能導(dǎo)致食物中毒。緬甸報道了5 株定植于健康食品加工者的銀葡菌分離株[6]。在最近的一次中國零售即食食品金葡菌流行性調(diào)查中獲得的8 株金葡菌分離株（分離自三亞、廣州、成都、湛江、廈門），根據(jù)其MLST 分型結(jié)果[7]來看，很可能是銀葡菌。本課題組報道了6 株在上海和寧波分離得到的銀葡菌，其中1 株分離自食物中毒患者肛拭子，1 株分離自五花肉[8]。這些研究表明銀葡菌很可能會污染食品，并導(dǎo)致食物中毒。日本報道了3 起與銀葡菌相關(guān)的食物中毒事件（2010年、2014年和2015年）[9-10]。研究結(jié)果表明，這些銀葡菌分離株獲得攜帶腸毒素（Staphylococcal enterotoxins）基因的可移動遺傳元件（Mobile genetic elements），通過基因水平轉(zhuǎn)移，使得銀葡菌高度產(chǎn)毒，提高了食物中毒風(fēng)險，成為食品安全的新威脅[10]。

由于銀葡菌無法合成葡萄球菌黃素，在體外對氧化應(yīng)激和嗜中性粒細(xì)胞殺傷更為敏感[11-12]，因此人們認(rèn)為銀葡菌是一種低毒力細(xì)菌[2]。然而，基因組學(xué)分析表明，銀葡菌與金葡菌之間的毒力基因含量沒有差異[13-14]，而且最近幾項研究表明，銀葡菌具有與金葡菌相類似的致病能力，也可引起嚴(yán)重的臨床感染癥狀，甚至導(dǎo)致死亡[15-17]。在已報道的菌株中部分分離株表現(xiàn)出較高的耐藥性[18-19]。綜上，銀葡菌是一種新型病原體，需高度重視。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，金葡菌在一個假定的非核糖體肽合成酶（Nonribosomal peptide synthetase，NRPS） 基因序列中存在60 個氨基酸的缺失，而銀葡菌不發(fā)生該缺失，基于此可有效鑒定銀葡菌[8]。由于銀葡菌和金葡菌在表型和基因型上高度相似，易于發(fā)生混淆，而我國目前尚未建立銀葡菌檢驗的標(biāo)準(zhǔn)方法，因此本研究使用我國金葡菌檢驗標(biāo)準(zhǔn)（GB 4789.10-2016 第一法）流程對本室保有的金葡菌和銀葡菌分離株進(jìn)行驗證和比較，以探討該法對檢驗銀葡菌的適用性和局限性，進(jìn)而對我國金葡菌和銀葡菌的檢驗方法提供補(bǔ)充建議。

1 材料

1.1 菌株

金葡菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 8095、金葡菌分離株193 株 （113 株為上海市疾病預(yù)防控制中心于2011-2014年按GB 4789.10-2016 第一法分離自食品、健康人或門診病人；80 株為本室于2014-2015年按GB 4789.10-2016 第一法分離自上海市售速凍米面制品）、銀葡菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DSM 28299、銀葡菌分離株6 株（SJTU F20124，F(xiàn)20419，F(xiàn)20420，F(xiàn)21164，F(xiàn)21224 和F21285[8]）、不具有血漿凝固酶活性的溶血性葡萄球菌SJTU F21469（于2015年分離自上海市售速凍米面制品） 均由上海交通大學(xué)食品安全與微生物實驗室保藏。

1.2 主要試劑和儀器

Baird-Parker 培養(yǎng)基、豆粉瓊脂、亞碲酸鉀卵黃增菌液，北京陸橋；脫纖維綿羊血、新鮮兔血漿，廣州未來；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）、腦心浸出液肉湯（BHI），英國Oxoid；TIANamp 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒，北京天根；溶菌酶，美國Sigma；Premix TaqTM（TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye），大連寶生物。

ES-315 型高壓蒸汽滅菌鍋，日本TOMY；DHP-9162 型恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒；CX31 RTSF型光學(xué)顯微鏡，日本Olympus；HMI-60 型細(xì)胞多點接種儀，天津恒奧；PCR 擴(kuò)增儀、微量臺式離心機(jī)5424D，德國Eppendorf；Nano Drop 2000 超微量分光光度計，美國Nano Drop；DYY-6C 型電泳儀，北京六一；Tanon-3500 型凝膠圖像處理系統(tǒng)，上海天能。

2 試驗方法

2.1 菌株的活化

從-80 ℃超低溫冰箱中取出菌株的甘油保藏管，無菌條件下用接種環(huán)蘸取菌液劃線接種至胰蛋白胨大豆肉湯瓊脂培養(yǎng)基（TSA）。于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，挑取單菌落接種于新的培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h 后用于后續(xù)試驗。

2.2 初步鑒定

挑取細(xì)菌單菌落接種到5 mL TSB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床200 r/min 過夜培養(yǎng)。根據(jù)GB 4789.10-2016 方法，用無菌接種環(huán)蘸取菌液劃線接種到Baird-Parker 平板，37 ℃培養(yǎng)36 h。溶血性檢測方法將劃線法改進(jìn)為點接法，將過夜培養(yǎng)的菌液用TSB 液體培養(yǎng)基1∶100 稀釋至約106CFU/mL，吸取200 μL 至96 孔板，用細(xì)菌多點接種儀接種至血平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h 后用電子游標(biāo)卡尺測量溶血圈直徑，以金葡菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 8095 作為陽性對照，做3 次生物學(xué)重復(fù)并取平均值。

2.3 確證鑒定

2.3.1 染色鏡檢 用接種環(huán)挑取待檢菌株菌懸液2～3 環(huán)涂于潔凈載玻片上，待干燥后，熱固定涂片。滴加草酸銨結(jié)晶紫染液初染約1 min，用水沖洗；加盧戈氏碘液覆蓋涂面媒染約1 min，用水沖洗。加95%乙醇數(shù)滴，并輕輕搖動脫色，后用水沖洗；用番紅染液復(fù)染約2 min，用水沖洗。干燥后，用油鏡觀察。

2.3.2 血漿凝固酶試驗 挑取細(xì)菌單菌落接種到5 mL BHI 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。取新鮮配制兔血漿0.5 mL，放入1.5 mL 無菌離心管中，加入BHI 培養(yǎng)物0.25 mL，振蕩搖勻，置于37 ℃水浴箱內(nèi)，每0.5 h 觀察1 次是否出現(xiàn)凝固現(xiàn)象，持續(xù)6 h。同時以金葡菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 8095 和無血漿凝固酶活性的溶血性葡萄球菌SJTU F21469的肉湯培養(yǎng)物分別作為陽性和陰性對照。

2.4 DNA 提取

取2 mL 過夜培養(yǎng)的菌液10 000 r/min 離心2 min，棄上清。向菌體沉淀中加入180 μL 終質(zhì)量濃度為20 mg/mL 的溶菌酶，37 ℃處理45 min。之后按基因組提取試劑盒說明提取DNA。

2.5 目的基因鑒定

以金葡菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 8095 和銀葡菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DSM 28299 為陽性對照，無菌水為陰性對照，分別對193 株金葡菌分離株和6 株銀葡菌分離株進(jìn)行nuc1 和NRPS 基因的PCR 鑒定，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，序列如表1所示。

表1 金黃色葡萄球菌和銀白色葡萄球菌的鑒定引物Table 1 Primers used to identify S.aureus and S.argenteus isolates

PCR 反應(yīng)體系25 μL，包括Premix TaqTM12.5 μL，引物上、下游（10 μmol/L）各0.5 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR 循環(huán)參數(shù)：nuc1 反應(yīng)為94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35 個循環(huán)；NRPS 反應(yīng)為94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35 個循環(huán)。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓為125 V，電泳結(jié)束后使用紫外凝膠成像系統(tǒng)成像并觀察結(jié)果。

2.6 統(tǒng)計分析

本研究使用GraphPad Prism 7 軟件進(jìn)行試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。采用t-test 方法，對金葡菌和銀葡菌溶血圈直徑的差異進(jìn)行顯著性分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 生化鑒定結(jié)果

所有受試菌株 （193 株金葡菌分離株和6 株銀葡菌分離株） 在Baird-Parker 平板上均呈典型菌落狀態(tài)，即所形成菌落圓形凸起，表面光滑且有光澤，顏色呈灰黑色或黑色，邊緣為淡色，周圍繞以渾濁帶，在其外層有一清晰的透明圈，接種針接觸菌落有似奶油至樹膠樣的粘稠感，銀葡菌與金葡菌菌落大小和形態(tài)無明顯差異。

在血平板上，3.6%（7/193）的金葡菌分離株無明顯溶血現(xiàn)象，96.4%（186/193） 的金葡菌分離株呈典型菌落狀態(tài)，即所形成菌落較大，光滑凸起、濕潤，菌落顏色呈金黃色或白色，菌落周圍繞以溶血圈，特別的是，溶血圈狀態(tài)有3 種類型：邊緣模糊的完全透明圈，邊緣清晰的暗紅色圈，內(nèi)圈暗紅色外圈完全透明（圖1）。也有研究報道表明一些金葡菌株雖攜帶溶血基因，但未表現(xiàn)溶血[21]，這可能是因為溶血基因中整合了攜帶免疫逃逸簇（Immune evasion cluster，IEC）的原噬菌體，導(dǎo)致溶血基因被破壞，無法正常表達(dá)[22]。6 株（100%）銀葡菌分離株菌落均呈典型的完全透明溶血圈 （β 溶血），菌落顏色呈白色。本研究顯示銀葡菌平均溶血圈直徑顯著高于金葡菌的平均水平 （圖2），由于銀葡菌菌株數(shù)相對較少，兩者樣本量不對等，因此對銀葡菌溶血能力與金葡菌相比具有顯著差異這一結(jié)論，需要進(jìn)一步驗證。

染色鏡檢結(jié)果顯示金葡菌和銀葡菌都為革蘭氏陽性球菌，菌體排列呈葡萄串簇狀，無芽孢，無鞭毛，無莢膜，直徑約為0.5～1 μm。血漿凝固酶試驗中，發(fā)現(xiàn)2.1%（4/193）的金葡菌分離株試驗6 h后，血漿結(jié)果呈半流質(zhì)絮狀，未能達(dá)到陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)（血漿凝固或凝固體積大于原體積的一半），陽性率為97.9%（189/193）。6 株銀葡菌分離株中，有1 株結(jié)果也呈半流質(zhì)絮狀，未能到達(dá)陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，陽性率為83.3%（5/6）。之前有研究報道表明少數(shù)金葡菌需要超過6 h 乃至24 h 才能形成凝塊，這與試驗條件和菌株特性有關(guān)[23]；此外，極少數(shù)金葡菌菌株在凝固酶試驗為陰性，可能由于莢膜多糖掩蔽了凝聚因子[24]或菌株為天然的凝固酶基因缺失突變株[25]。

圖1 金葡菌和銀葡菌分離株在血平板上的菌落形態(tài)（多點接種法）Fig.1 The colony morphology of S.aureus and S.argenteus isolates on blood plate using multipoint method

從生化鑒定結(jié)果可知，本室保存的6 株銀葡菌分離株在生化表型上與金葡菌無明顯差異，因此在GB 4789.10-2016 的檢驗標(biāo)準(zhǔn)下，銀葡菌也會被檢出，被判斷為金葡菌。銀葡菌已經(jīng)被證明可以污染食品，并導(dǎo)致食物中毒[8-10]，因此GB 4789.10-2016 也可以對食品中的銀葡菌起到監(jiān)測作用。

金葡菌是導(dǎo)致食源性疾病高發(fā)的重要病原菌之一，其產(chǎn)生的腸毒素可引起食物中毒[26]?；跈z驗效率和成本的考慮，大多數(shù)有關(guān)食品中金葡菌污染調(diào)查都采用GB 4789.10-2016 的檢驗流程。本研究結(jié)果表明，并非所有金葡菌和銀葡菌都具備溶血能力或能表達(dá)血漿凝固酶活性，因此，這部分分離株在檢驗鑒定過程中容易被排除。

圖2 金葡菌和銀葡菌分離株溶血圈直徑的差異Fig.2 The diameter comparison of hemolysis zone of S.aureus and S.argenteus isolates

3.2 目的基因鑒定結(jié)果

193 株金葡菌分離株nuc1 陽性率為100%，短片段NRPS 陽性率為100%；6 株銀葡菌長片段NRPS 陽性率100%，nuc1 陽性率為100%（圖3、圖4）。而銀葡菌nuc1 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶明顯淡于金葡菌，且有明顯的引物二聚體，可能所擴(kuò)增的nuc1 序列與金葡菌存在差異（圖3）。

圖3 金葡菌和銀葡菌nuc1-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜（部分菌株）Fig.3 nuc1-PCR amplification from partial S.aureus and S.argenteus isolates

圖4 金葡菌和銀葡菌NRPS-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜（部分菌株）Fig.4 NRPS-PCR amplification from partial S.aureus and S.argenteus isolates

nuc1 基因編碼的是金葡菌特有的耐熱核酸酶，該基因高度保守，是廣泛用于檢測金葡菌的靶點基因[27]。從擴(kuò)增結(jié)果來看，銀葡菌同樣能擴(kuò)增出相同大小的基因片段，因此以nuc1 作為檢測靶點會將銀葡菌誤檢為金葡菌。這與一些已報道的研究結(jié)果相同，雖擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果為陽性，但序列分析結(jié)果顯示銀葡菌nuc1 序列與金葡菌相比存在缺失和插入現(xiàn)象[1，10，28]，也有一些研究報道所獲得的銀葡菌分離株無法擴(kuò)增出nuc1[29]，可能與所用的引物不同有關(guān)，因此，以nuc1 為靶點檢驗銀葡菌所得的結(jié)果并不可靠，很可能造成誤檢或漏檢。而以NRPS 作為靶點則可以很好的區(qū)分銀葡菌和金葡菌，即金葡菌由于NRPS 存在基因序列上的缺失，擴(kuò)增出比銀葡菌更短的產(chǎn)物，可以根據(jù)PCR 產(chǎn)物片段大小將二者加以區(qū)分[8]。

3.3 檢測流程改進(jìn)

上述結(jié)果表明，金葡菌和銀葡菌的生理生化特征基本一致，說明GB 4789.10-2016 第一法可以檢出金葡菌和銀葡菌，并真實反映其在食品中的污染程度，然而該法無法區(qū)分兩者；常用的檢測靶點基因nuc1 同樣無法區(qū)分金葡菌和銀葡菌，而本室建立的靶點基因NRPS 可以準(zhǔn)確鑒定區(qū)分金葡菌和銀葡菌。另外，極少數(shù)金葡菌株不具備溶血能力或血漿凝固酶活性，第一法雖可滿足基本定性檢驗，但也存在漏檢的可能。該法需要進(jìn)一步完善。

因此，為提高金葡菌定性檢驗的準(zhǔn)確性以及準(zhǔn)確區(qū)分金葡菌和銀葡菌，本文基于GB 4789.10-2016 檢驗標(biāo)準(zhǔn)第一法，提出改進(jìn)流程（圖5）。此方法檢驗周期約3 d，耗時相對較短，適合一般微生物實驗室大批量分離鑒定金葡菌和銀葡菌菌株，缺點為Baird-Parker 選擇性分離這一步可能會存在較多的假陽性菌株，因此需要用標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行陽性對照，提高選擇典型菌落的準(zhǔn)確率；其次，DNA 提取較繁瑣，可用試劑盒法進(jìn)行提取，提高效率。

圖5 區(qū)分鑒定金葡菌和銀葡菌檢驗程序Fig.5 Protocol for discrimination between S.aureus and S.argenteus isolates

4 結(jié)論

本研究通過GB 4789.10-2016 第一法對金葡菌和銀葡菌進(jìn)行檢驗，發(fā)現(xiàn)該法無法區(qū)分金葡菌和銀葡菌。根據(jù)生化檢驗結(jié)果，結(jié)合本室建立的靶點基因NRPS 的PCR 檢測方法，提出了一種改進(jìn)檢驗流程，檢驗準(zhǔn)確度更高，能夠區(qū)分金葡菌和銀葡菌。