細菌VIII 型分泌系統(tǒng)的研究進展

王奕婷 ，張 東 ，許 姝 ，段強德 *，朱國強 *

（1. 揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇 揚州 225009；2. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009；3. 教育部農業(yè)與農產品安全國際合作聯(lián)合實驗室，江蘇 揚州 225009）

細菌為了促進生物被膜（Biofilm，BF）的形成、提高對宿主細胞的黏附和定植能力，進化出了許多簡潔的機制，用來加工、組裝和分泌相應的功能性蛋白[1]。目前已經在細菌中發(fā)現(xiàn)了9 種分泌系統(tǒng)，包括：I 型分泌系統(tǒng)（Type I secretion system，TISS）由3種蛋白（內膜ABC 轉運蛋白、周質膜融合蛋白和外膜孔蛋白）組成跨細胞雙層膜的復合物，使分泌的蛋白一次性穿過內外膜分泌到胞外[2]；II 型分泌系統(tǒng)（T2SS），與V 型分泌系統(tǒng)（T5SS）的蛋白均依賴內膜上的Sec 轉位酶進入細胞周質，再利用β 折疊桶實現(xiàn)跨外膜分泌[3]；III 型分泌系統(tǒng)（T3SS）較復雜，效應蛋白利用針狀復合體以注射的方式注入宿主細胞內[4]；IV 型分泌系統(tǒng)（T4SS）依賴接觸效應分子分泌到宿主細胞中[5]；VI 型分泌系統(tǒng)（T6SS）被稱為噬菌體樣結構，蛋白首先穿過細菌自身的細胞膜，再將分泌物質注射到宿主細胞內[6]；VII 型分泌系統(tǒng)（T7SS）僅存在革蘭氏陽性菌中，分泌的毒力相關蛋白主要是ESAT-6/WXG100 蛋白家族[7]；Ⅸ型分泌系統(tǒng)（T9SS）是在一些擬桿菌門細菌中新發(fā)現(xiàn)的蛋白分泌系統(tǒng)，也稱為PorSS（Porsecretion system，PorSS）[8]。

研究發(fā)現(xiàn)，腸桿菌科和其他菌屬的胞外卷曲菌毛Curli，是一種能促進細胞黏附、定植、侵襲、釋放毒力等功能的淀粉樣蛋白[9]。與其他菌毛形成不同，Curli的生物合成需要特定組裝機制，因此它的分泌機制代表了一個蛋白形成、分泌和組裝的獨特系統(tǒng)，這個系統(tǒng)被稱為成核沉淀途徑或VIII 型分泌系統(tǒng)（T8SS）[10]。本文就T8SS 的結構、分泌途徑以及其與病原菌致病相關性的最新研究進展進行綜述。

1 Curli 的生物起源

腸桿菌科中許多細菌都能表達Curli，其中在大腸桿菌E. coli和沙門氏菌最為常見[11]。Curli最初是在牛乳腺炎病例中分離的E.coli上發(fā)現(xiàn)的[12]，隨后Collin?son 和同事在腸炎沙門氏菌中鑒定了Tafi（沙門氏菌細聚集菌毛）[13]，因Tafi和Curli高度同源，于是統(tǒng)稱為Curli。雖然是從E. coli感染病例中分離出來的，但后經研究表明，Curli廣泛存在于40 多個細菌屬中。

早期人們通過電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，Curli纏繞在細菌周圍的基質中。隨后證明Curli存在于細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）里，是ECM 眾多纖維蛋白的一種[14]。ECM 的功能極為豐富，不僅可以發(fā)揮連接、支持、保水、抗壓等基本生命活動功能，還能促進細胞增殖、分化、黏附。ECM 作為細菌與宿主細胞黏附的介質，介導Curli與細胞的結合，有利于Curli對宿主細胞行使黏附侵襲、定植、釋放毒力和引發(fā)宿主免疫的功能[15]。

生物物理學、生物化學結合圖像分析等研究表明，Curli是一種淀粉樣蛋白[16]。和其他淀粉樣蛋白一樣，Curli能被剛果紅（Congo red，CR）染成紅色、與染料硫磺素-T 反應發(fā)出熒光。Curli有較高的穩(wěn)定性，能抵抗各種物理和化學刺激，抵抗蛋白酶消化和1%的十二烷基硫酸鈉作用，只有在90%的甲酸中才能解聚，為細菌在體內的定植奠定了基礎。

2 T8SS 的結構及分泌途徑

2.1 結構組成Curli是由csgBAC 操縱子編碼，分別編碼csgA、csgB 和csgC 3 種蛋白，其中csgA 和cs?gB 是Curli的主要結構組成部分，csgC 是周質蛋白[17]。csgDEFG 操縱子編碼的csgE 和csgF 是分泌-裝配中不可缺少的輔助因子，csgD 是csgBAC 操縱子的轉錄激活因子，csgG 是一種脂質蛋白，在外膜周質形成分泌通道。Curli的分泌需要借助以上7 種csg亞基，它們分別在蛋白從胞內到胞外的分泌中發(fā)揮不同的作用。

2.1.1 csgA csgA 又稱為“curlin”，是Curli的主要結構組成部分[18]。它在細胞表面與csgB 蛋白相互作用，聚集成高度不溶的淀粉樣菌毛。csgA 至少可分為3 個結構域，分別是N 末端Sec 依賴性信號序列（前22 個氨基酸）、載客結構域以及被預測是Curli核心的C 末端結構域。N 末端的前22 個氨基酸是維持csgA 的分泌和穩(wěn)定性，并引導csgA 通過csgG 蛋白通道。csgA 具有5 個重復單元R1～R5，R2～R4 包含的保守Asp 和Gly 殘基，調節(jié)csgA 以非聚合形式向外膜分泌[19]。

2.1.2 csgB csgB 與csgA 同源性可達30%～40%，是Curli的次要組成成分。它位于細菌表面，作為csgA單體的成核劑，介導Curli聚合[20]。csgA 缺失時，cs?gB 能夠在細菌表面自組裝成短聚合物；在csgB 突變體中，csgA 不能正確組裝成Curli，但能以可溶性蛋白形式分泌到細胞培養(yǎng)基中，證明纖維組裝不是分泌的先決條件；而當兩種天然蛋白都表達時，csgB通過蛋白質-蛋白質相互作用對csgA 進行構象改變，促進Curli的產生。研究發(fā)現(xiàn)可溶性csgA 通過接觸表達csgB 成核劑（并且不表達csgA）的細胞，會重新聚合成Curli[21]。使用純化的csgA 和csgB 進行的體外聚合實驗進一步表明，這些蛋白質之間的物理接觸可促進它們有效的聚合[22]。

2.1.3 csgC csgC（圖1 綠色圖形標記）是一種周質蛋白，可以阻止周質中淀粉樣中間體的形成，避免淀粉樣中間體產生細胞毒性[23]。目前關于csgC 的抑制中間體形成機制還不明晰，研究者推測是csgC 的β-鏈（β4-β5 邊緣）發(fā)揮作用，上面帶正電荷的保守片段介導csgA 和csgC 之間的靜電相互作用，從而驅動抑制作用。

2.1.4 csgD csgD 是csgDEFG 操縱子中的一個正向調節(jié)轉錄因子，它能正向調節(jié)csgBAC 操縱子的表達[24]。csgD 自 身 的 表 達 受 兩 個sigma 因 子（rpoS 和rpoD）、小調控RNA、多種DNA 結合蛋白和幾種通過c-di-GMP 作用的蛋白調節(jié)。與野生菌株不同的是，csgD 突變株無論何種溫度都表達Curli，而野生株受溫度影響較大（<30 ℃）。最近研究顯示，csgD也能影響Curli操縱子之外基因的轉錄，包括與促進生物膜產生、糖異生代謝和肽導入相關的基因[25]。

2.1.5 csgE csgE 的缺失會導致Curli失去與CR 指示劑的結合能力，生成白色菌落，并且?guī)缀鯔z測不到csgA、csgB、csgF 和csgG 分泌蛋白[26]。研究發(fā)現(xiàn)在體外csgG/csgE 復合物處于可逆的平衡，表明csgE可能處于周質狀態(tài)與csgG 結合形式二者之間循環(huán)，當csgG 過表達時，可以恢復csgE 突變體的CR 結合能力，能檢測到Curli[27]。

2.1.6 csgF csgF 可以協(xié)調亞基的分泌和聚合。cs?gF 以csgG 依賴性方式定位于細胞外表面（圖1 紅色圖形），csgF 對于Curli亞基的分泌不是必要的，但對于Curli的形成是必不可少的，在csgF 突變體中，csgB 不再與細胞表面相連，并且不能發(fā)揮其成核功能[28]，這與csgF 的3 個獨立結構域有關：N-末端非結構化區(qū)域、21 殘基α-螺旋和由4 條鏈組成的C-末端反向β-折疊。

2.1.7 csgG csgG 的主要作用是負責Curli亞基在外膜上的轉運，是csgA、csgB、csgF 分泌到外膜必須的。研究發(fā)現(xiàn)csgG 表達增加了外膜通透性，允許抗生素進入細胞，證實了csgG 的孔狀結構（圖1 藍色圖形標記）[29]。在沒有csgG 時，csgA 和csgB 不穩(wěn)定且不會發(fā)生Curli 組裝，CR 平板上突變體菌株呈現(xiàn)白色。目前至少有兩種模型可以解釋為什么在沒有csgG 存在下，csgA 和csgB 不穩(wěn)定。一種是csgG 可以作為伴侶蛋白，在周質中穩(wěn)定csgA 和csgB，直到他們分泌到細胞表面；另一種是csgG 通過將csgA 和csgB 運送到細胞表面，避免周質蛋白酶的影響。綜上表明，csgG 的功能為穩(wěn)定csgA 和csgB 并促進Curli的組裝。

2.1.8 csgH 在α-變形菌中還發(fā)現(xiàn)了一個額外的基因，csgH。它與其它Curli基因的序列同源性很低，與csgH 最相似的是csgC[30]。有研究發(fā)現(xiàn)，來自沼澤紅假單胞菌的重組csgH 能以csgC 類似方式抑制csgA的過早聚合，抑制淀粉樣蛋白FapC（編碼淀粉樣蛋白的主要亞基）形成，且csgH 比csgC 更有效[31]。

2.2 分泌途徑 細菌經革蘭氏染色可分為兩大類，其中革蘭氏陽性菌的結構相對簡單，只有一層胞漿膜即內膜，胞漿膜外部是一層厚厚的肽聚糖成分的細胞壁，因此蛋白的分泌只需要穿過細胞質膜和肽聚糖層。而革蘭氏陰性菌具有內膜、外膜兩層膜，中間是一層薄的肽聚糖層和周質，蛋白的分泌需要通過兩個脂質雙層，這就使其分泌系統(tǒng)更加復雜多樣，分泌過程包括蛋白的內膜運輸、胞質轉運和外膜運輸。Curli分泌同樣需要經過內膜的加工、周質的運輸以及外膜的加工（圖1）。與導致退行性疾?。ㄈ绨柎暮Ｄ?、帕金森綜合征等）的淀粉樣蛋白錯誤折疊不同，Curli的折疊是有目的、有序的正確折疊[32]。如圖1 所示，Curli由操縱子csg（curli sub?unit genes）編碼和轉錄，csg 分為csgBAC 和csgDEFG兩類操縱子，沿兩個轉錄方向進行，前者包括cs?gA、csgB 和csgC 亞基，后者包括csgD、csgE、csgF和csgG 亞基。各個亞基首先通過內膜上的SecYEG轉運子穿過內膜（IM）進入周質后，周質內的csgC 和csgE 可以抑制csgA 過早聚合形成中間體，直到轉運到外膜的csgG 通道。該通道蛋白與csgE 相結合，協(xié)同促進csgA、csgB 及csgF 的通過。進入細胞表面后，csgB 以csgF 依賴性的方式（圖1 中綠色和紅色）向csgA 提供蛋白模板，采用交叉β 鏈聚合構象將可溶性csgA“成核”為卷曲纖維并延伸[33]。

圖1 Curli 分泌模型（根據文章[12, 53]匯總整理）

3 Curli 基因表達的調控

Curli基因的表達調控受到諸多因素影響，除了在低鹽濃度、營養(yǎng)條件充足以及微含氧環(huán)境中可以產生大量csgD，促進Curli表達以外[34]。Curli有復雜的基因表達調控網絡，由csgD、Rpos、3 個雙組份系統(tǒng)（OmpR/EnvZ、Rcs 和CpxA/R）組成。

蛋白csgD 是調控中樞，一些調控因子通過調控csgD 來控制粘附和生物膜的形成。csgD 正向調節(jié)cs?gBAC 的啟動子，是csgBAC 啟動子活化所必需的，而csgBAC 正是Curli表達的主要調控子，其在生物膜的形成中發(fā)揮重要作用[35]。

RpoS，穩(wěn)定期δ 因子，直接或間接的參與了Curli基因的表達的調控。Curli基因的表達主要集中在穩(wěn)定期并依賴于RpoS 因子，Crl 調控因子與RpoS相互作用，促進RpoS 與csgBAC 啟動子區(qū)域結合，因此Crl 是大部分腸桿菌Curli基因表達所需要的[36]。除此之外，RpoS 也可以通過MlrA 蛋白的表達來調控Curli基因，MIrA 蛋白正向調控轉錄因子cs?gD，參與Curli的表達[37]。

在OmpR/EnvZ，CpxA/R 和Rcs 3 個雙組份系統(tǒng)中，OmpR/EnvZ 對Curli基因的表達調控起主要作用[38]。OmpR/EnvZ 調控外膜蛋白OmpF 和OmpC 的濃度，EnvZ 是激酶感受器，其將信號傳遞給OmpR，OmpR 進而正向調控csgD 的表達，上調Curli基因的表達量。CpxA/r 雙組份系統(tǒng)只有在細胞壁感受到壓力或者周質蛋白發(fā)生錯誤折疊時被激活，導致周質分子伴侶和蛋白酶表達上調，錯誤折疊的周質蛋白被CpxA/r 識別，蛋白酶將其迅速降解[39]，避免周質中間體的產生，對細胞造成毒性作用。與Cpx 相似，Rcs 和Cpx 途徑都是負向調控Curli操縱子表達，Rcs 途徑負責感應膜的壓力，特別是外膜壓力，負向調控csgD 的表達[40]。

集成宿主因子（IHF）和組蛋白類似蛋白（HN-S）兩個全組織調控蛋白，也參與了Curli基因的表達。在沙門菌中敲除IHF基因會減少csgD 的轉錄并且影響到Curli的表達[41]。HN-S 作用比較復雜，在不同種屬的細菌中發(fā)揮不同的作用。在沙門菌中敲除HN-S基因會減少csgD 的轉錄，表明HN-S 可正向調控Curli基因的表達。在E. coliK-12 菌中HNS基因突變會增加csgA 的轉錄，表明HNS 負性影響Curli表達[42]。進一步證實了Curli基因表達調控的復雜性。正是在這種嚴密的調控網絡下進行的表達，才保證了Curli亞基在時間和空間上的高度協(xié)調。

4 Curli 在細菌致病機制中的作用

Curli的表達可以促進病原菌附著、侵入細胞膜并逃避宿主免疫反應，從而引起敗血癥、感染性休克、膿毒癥、全身炎癥反應綜合征（Systemic inflam?matory response syndrome，SIRS）及自身免疫病等疾病[43]。近年來多種疾病被發(fā)現(xiàn)均與Curli的表達有關。Curli的致病作用，主要體現(xiàn)在以下幾個方面。

4.1 促進BF 形成 許多感染常常與細菌形成BF 有關，Curli能促進細菌BF 的形成[44]。Curli相互連接，把臨近的細菌聚集成群落，逐漸發(fā)育成BF。BF 一旦形成，即可使Curli對消毒劑、殺菌劑的抵抗力增強；同時，導致細菌對抗生素及機體免疫敏感性降低, 用抗生素難以徹底清除，使病程延長。Curli形成BF 的能力似乎與表達系統(tǒng)的調節(jié)功能密切相關，例如Rcs 途徑能感知外膜的壓力，負向調控cs?gD 的表達，減少BF 的形成[45]。有趣的是，Curli只在BF 形成的最初階段起重要作用，然后隨著Cpx 和Rcs 途徑在BF 形成期間其變得活躍而被關閉。

4.2 促進細菌的黏附和侵襲Curli是一些病原菌重要的毒力因子，能促進病原菌對機體的黏附和定植。與不產生Curli的E. coliO157 H7 相比，產生Curli的E. coli侵襲HEp-2 細胞的能力更強[46]。在尿路感染中，Curli可促進EPEC 與上皮細胞的粘附，使菌體對抗菌肽的抵抗力加強，增加促炎細胞因子IL-8 的釋放，促進疾病的發(fā)展[47]。Curli介導的黏附侵襲機制是通過與宿主的相應成分（纖維連接蛋白、纖溶酶原、層粘連蛋白和人接觸時相蛋白、主要組織相容性復合體等）結合，介導細菌粘附并進入宿主細胞，增強在宿主細胞內的傳播。例如，Curli同時結合纖溶酶原和纖溶酶原激活物，纖溶酶原被激活為纖溶酶，導致組織的降解，細菌就會對細胞造成更深層次的侵入[48]；與接觸相蛋白（激肽原、纖維蛋白原等）結合，釋放促炎性激肽和緩激肽，激活接觸相系統(tǒng)，大大增加了細菌在全身擴散方面的優(yōu)勢[49]。

4.3 逃避補體系統(tǒng) 補體是人和脊椎動物血清與組織液中一類蛋白質，經活化后具有調理吞噬、免疫調節(jié)和清除免疫復合物等多種生物學效應。Curli可以抑制補體經典途徑而逃避補體介導的殺傷作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在含有補體的人血清中，Curli的產生增強了E. coli在體內和體外的存活[50]。進一步研究表明，Curli可以與補體成分C1q 結合，激活經典補體途徑，提供對經典補體途徑的抗性來保護E. coli免受補體介導的殺傷[51]。這一發(fā)現(xiàn)，為Curli的致病機制研究提供了有力的依據。

4.4Curli與相關疾病

4.4.1 炎癥反應 在Curli所致的疾病中，真正由菌體所致的損害很小，主要與細菌導致的高水平炎癥因子有關。TNF-a、IL-6、IL-8 等炎癥因子水平的升高是敗血癥、感染性休克、膿毒癥及SIRS 患者診斷的一項重要指標[52]。如圖2 所示，Curli被Toll 樣受體（Toll-Like receptors，TLRS）（藍色圖形標記）識別，激活機體先天性免疫系統(tǒng)，促進TNF-a、IL-6、IL-8 等細胞因子的表達，使局部組織細胞出現(xiàn)變性、壞死，引發(fā)組織細胞的損壞，導致嚴重疾病的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，與不表達csgA 蛋白的細菌相比，表達csgA 蛋白的細菌能誘導巨噬細胞產生更高水平的細胞因子，表明csgA 在細胞因子誘導中起一定作用[53]。

4.4.2 感染性休克 感染性休克病人的一個重要病因是一氧化氮（Nitric oxide，NO）引起的低血壓。表達Curli的細菌可以激活NO/2 型一氧化氮激酶（Type 2Nitric oxide synthase，NOS2）系統(tǒng)，產生大量的NO[54]。少量的NO 能抵抗病原菌的侵入，過量則會作用于機體各個器官、系統(tǒng)，導致血管平滑肌舒張、血壓下降、心動過速和體溫降低，誘發(fā)休克的發(fā)生。

圖2 Curli 致病機理模式圖（根據文章[25]匯總整理）

4.4.3 自身免疫病 在BF 中存在一種DNA（環(huán)境DNA，eDNA）可以與Curli結合，導致自身免疫性疾病發(fā)生。能抵抗DNase 處理的eDNA 與Curli結合形成復合物，被樹突狀細胞（DC）識別和吞噬，誘導細胞炎癥因子（IL-6，IL-12）和抗核抗體的產生（免疫球蛋白G 亞類2a 和2b）[54]?？购丝贵w是一組對細胞核內的DNA、RNA、蛋白或這些物質的分子復合物產生的自身抗體，它的存在可導致自身免疫性疾病，如紅斑狼瘡等。

綜上，Curli致病機制可能是一個重要的研究方向，可以針對其作用機理采取有效方案，控制相關臨床疾病的發(fā)生。

5 Curli 的研究方向與展望

BF 是病原侵入宿主的保護膜，Curli又是BF 重要組成部分，因此控制Curli組裝是防止BF 形成和進一步損害機體的有力策略之一。此外，Curli具有與疾病相關的淀粉樣蛋白相似的生化特性，它也是設計和開發(fā)通用淀粉樣蛋白抑制劑的合適模型。對于T8SS，目前還有一些假說沒有得到證實，比如Curli亞基在通過外膜通道蛋白時所需的能量如何提供；csgC 抑制淀粉樣中間體形成的確切機制；csgG與csgE 相互作用的位點和運輸CsgA 的工作機制等。T8SS 作為Curli淀粉樣蛋白分泌不可或缺的系統(tǒng)，它的深入研究為揭示淀粉樣蛋白發(fā)生過程，以及疾病診斷、疫苗開發(fā)和新藥研制提供更完善的理論依據。