表達(dá)禽β-防御素6 重組乳酸菌的構(gòu)建及其免疫調(diào)節(jié)活性檢測(cè)

王婷婷，王志浩，米潔蘭，王文騫，高玉龍，劉長(zhǎng)軍，祁小樂，張艷萍，李 凱，高 立，潘 青，王笑梅，崔紅玉

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069）

禽β-防御素6（AvBD6）是一類廣泛存在于禽體內(nèi)的宿主防御蛋白，屬于禽β-防御素（AvBDs）的一種，該基因完整的核苷酸序列包含204 bp 開放閱讀框，編碼67 氨基酸，包括20 氨基酸的信號(hào)肽，5 個(gè)前體氨基酸和42 個(gè)氨基酸的成熟肽。AvBD6 是具有廣譜抗菌活性的陽離子小肽[1]，除抗菌功能外，β-防御素還表現(xiàn)出多種免疫調(diào)節(jié)活性，是先天性免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。AvBD 對(duì)免疫系統(tǒng)具有重要的調(diào)節(jié)作用[2]，β-防御素可由吞噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，可啟動(dòng)、動(dòng)員并增強(qiáng)宿主適應(yīng)性免疫防御[3]。β-防御素不僅具有增強(qiáng)巨噬細(xì)胞活性、趨化性單核細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞和未成熟樹突細(xì)胞的吞噬作用，還能夠誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生[4]。

在免疫調(diào)節(jié)方面，研究表明β-防御素顯示出強(qiáng)大的免疫佐劑潛力，可以顯著提高疫苗的免疫效力[5]。盡管已報(bào)道利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)能夠表達(dá)重組AvBD[6]，但表達(dá)產(chǎn)物均以包涵體形式存在，而將包涵體形式的AvBD6 經(jīng)過變性再?gòu)?fù)性最終形成具有生物活性的AvBD6 過程復(fù)雜[7]，且殘留有種類繁多的內(nèi)毒素。因此，研究開發(fā)出一種無內(nèi)毒素、食品安全級(jí)、高效、簡(jiǎn)便和低成本的蛋白表達(dá)和生產(chǎn)方式是一個(gè)亟待解決的問題。

益生乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）被定義為當(dāng)以適當(dāng)?shù)牧拷o予宿主時(shí)會(huì)給宿主帶來健康益處的微生物，并且已經(jīng)證明它們?cè)谒拗髦斜憩F(xiàn)出各種生理功能，例如改善腸道環(huán)境，調(diào)節(jié)免疫功能和能量代謝等[8-9]。近年的研究表明，乳酸菌尤其是腸道乳酸菌是機(jī)體免疫系統(tǒng)的最大免疫調(diào)節(jié)信使，益生乳酸菌菌體較大，表面積大，不存在內(nèi)毒素，可以粘附黏膜細(xì)胞并短暫定居黏膜表面，對(duì)黏膜免疫系統(tǒng)和全身免疫系統(tǒng)具有重要的調(diào)節(jié)作用，組成腸道菌-腸-腦免疫軸、腸-肝免疫軸和腸-肺免疫軸等。此外，LAB 細(xì)胞壁和核酸等成分本身就具有一定的免疫佐劑活性，重組乳酸菌作為表達(dá)和遞送治療性和預(yù)防性外源藥物的活載體，是激活免疫應(yīng)答的理想制劑[7]。本研究采用食品級(jí)乳酸菌表達(dá)載體，構(gòu)建了表達(dá)AvBD6 的重組乳酸菌，并檢測(cè)了重組乳酸菌表達(dá)的重組禽防御素的免疫調(diào)節(jié)活性，為食品安全級(jí)疫苗佐劑或免疫增強(qiáng)劑的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 乳酸菌表達(dá)骨架質(zhì)粒pPG612和乳酸乳球菌NZ3900 感受態(tài)細(xì)胞、雞巨噬細(xì)胞系、J774-DualTM報(bào)告細(xì)胞系等由本實(shí)驗(yàn)室保存； SPF 雞由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供，抗凝血采自6 周齡～7 周齡SPF 雞。

1.2 主要試劑 Primer STAR Max DNA 聚合酶、DL2000 DNA Marker 購(gòu)自TaKaRa 公司；蛋白Marker購(gòu)自Thermo Fisher 公司；HA 單克隆抗體（MAb）購(gòu)自Biodragon 公司；山羊抗鼠IgG-HRP 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA 凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axy?gen；One Step Cloning Kit 購(gòu)自Vazyme 公司；雞外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液購(gòu)自天津TBD 公司；檢測(cè)IL-10、IL-12p70 的SYBY Green Ⅰ熒光定量PCR 試劑盒購(gòu)自Roche 公司；檢測(cè)IL-10、IL-2、IFN-γ 的ELISA 試劑盒購(gòu)自Solarbio 公司。

1.3 目的基因AvBD6 的優(yōu)化及合成 根據(jù)GenBank AvBD6 的參考序列（NM_001001193.1），去掉AvBD6分泌信號(hào)肽序列，利用編碼（G4S）3的蛋白Linker 基因序列（GGTGGCGGCGGATCT）將AvBD6 串聯(lián)起來，拼接成為AvBD6（G4S）3AvBD6（G4S）3AvBD6（G4S）3AvBD6（4×AvBD6）基因序列，由Genescript 公司根據(jù)乳酸菌密碼子偏嗜性進(jìn)行基因優(yōu)化并合成。

1.4 引物的合成及優(yōu)化 根據(jù)優(yōu)化合成后的4×AvBD6 序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增4×AvBD6 的引物4×AvBD6-F/R（注：?jiǎn)螜M線部分為同源臂，雙橫線部分為HA 標(biāo)簽）；設(shè)計(jì)載體pPG612 的擴(kuò)增引物pPG612-F/R；根據(jù)構(gòu)建后的重組質(zhì)粒設(shè)計(jì)測(cè)序引物tAvBD6-F/R；設(shè)計(jì)SYBY Green Ⅰ熒光定量PCR 檢測(cè)IL-10 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的引物IL-10-F/R 及檢測(cè)IL-12p70 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的引物IL-12p70-F/R（表1）。所有引物均由庫(kù)美科技生物有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.5 重組質(zhì)粒pPG612-AvBD6HA的構(gòu)建及鑒定 以4×AvBD6 為模板，4×AvBD6-F/R 為引物PCR 擴(kuò)增594 bp的帶有同源臂的AvBD6序列全長(zhǎng)（AvBD6HA），擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收目的片段。以pPG612 為模板，pPG612F/R 為引物，擴(kuò)增5 050 bp的pPG612 全長(zhǎng)序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA 凝膠回收試劑盒回收后按照One Step Cloning Kit 說明與AvBD6HA序列進(jìn)行同源重組，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPG612-AvBD6HA。采用電轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至乳酸乳球菌NZ3900 感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建重組乳酸菌pPG612-AvBD6HA/NZ3900。取重組乳酸菌pPG612-AvBD6HA/NZ3900 的培養(yǎng)物為模板，設(shè)置陰性對(duì)照（乳酸乳球菌NZ3900）和空白對(duì)照，利用引物tAvBD6-F/R PCR鑒定并由庫(kù)美科技生物有限公司測(cè)序。

1.6 重組蛋白AvBD6（rAvBD6）的表達(dá)與鑒定 將重組乳酸菌pPG612-AvBD6HA/NZ3900 及陰性對(duì)照菌株（乳酸乳球菌NZ3900）培養(yǎng)至OD600nm=0.4～0.5 時(shí)，加入終濃度為50 ng/mL 的Nisin，30 ℃靜止誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h～7 h，5 000 r/min 離心10 min 分離菌體和培養(yǎng)上清。利用PBS 稀釋菌體OD600nm值（光密度）為2 后超聲破碎，12000 r/min，離心10 min，上清經(jīng)0.45 μm 濾器過濾后保存于-80 ℃?zhèn)溆?。以HA MAb（1 5 000）為一抗，山羊抗鼠IgG-HRP（1 10 000）為二抗，經(jīng)western blot 鑒定上清液中rAvBD6 的表達(dá)，并利用BCA 法對(duì)重組蛋白進(jìn)行絕對(duì)定量。

1.7 rAvBD6刺激雞外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）細(xì)胞因子的檢測(cè) 采集6周齡～11周齡SPF雞抗凝血，分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，接種于1 mL/孔到24 孔板細(xì)胞培養(yǎng)板，在細(xì)胞培養(yǎng)板孔中加入50 μL 上述制備的rAvBD6，設(shè)置陰性對(duì)照[加入50 μL 的乳酸乳球菌NZ3900 的菌體裂解上清（wt-lactis-control）]，陽性對(duì)照[分別加入10 μL 濃度為1 μg/mL 的LPS（LPS）或20 μL 濃度為100 μg/mL的ConA 和濃度為1 μg/mL 的PMA 混合溶液（ConA+PMA）]，每組樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。將細(xì)胞于37 ℃5% CO2培養(yǎng)24 h 后，提取細(xì)胞核酸，分別以L-12p70-F/R，IL-10-F/R 為引物，采用SYBY Green Ⅰ熒光定量試劑盒定量檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞中IL-12p70 和IL-10 mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平[9]。

1.8 rAvBD6刺激雞巨噬細(xì)胞系（HD11）細(xì)胞因子的檢測(cè) 將雞巨噬細(xì)胞于24 孔板中培養(yǎng)至1×106個(gè)/mL，在細(xì)胞培養(yǎng)板孔中加入50 μL rAvBD6，參照1.7 方法設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，每組樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。將細(xì)胞于37 ℃5% CO2培養(yǎng)24 h 后，提取細(xì)胞核酸，分別以IL-12p70-F/R，IL-10-F/R 為引物采用SYBY GreenⅠ熒光定量PCR 試劑盒定量檢測(cè)細(xì)胞中IL-12p70 和IL-10 的mRNA 的轉(zhuǎn) 錄水平。

1.9 rAvBD6 激活報(bào)告細(xì)胞系J774-DualTMIRF 信號(hào)通路的檢測(cè) J774-DualTM細(xì)胞是由小鼠J774a.1 巨噬細(xì)胞系通過穩(wěn)定整合誘導(dǎo)型報(bào)告基因（Lucia 螢光素酶基因）于IRF 干擾素信號(hào)通路激活元件中衍生而來的IRF 信號(hào)通路激活報(bào)告細(xì)胞系。該螢光素酶報(bào)告基因在ISG54 啟動(dòng)子的控制下，與5 個(gè)IFN 刺激的響應(yīng)元件結(jié)合在一起，該基因編碼的螢光素酶分泌于J774-DualTM細(xì)胞上清[10]。本試驗(yàn)將96 孔板中的J774-DualtmTM細(xì)胞培養(yǎng)至2.8×105個(gè)/mL，在細(xì)胞培養(yǎng)板孔中加入20 μL rAvBD6，參照1.7 設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，每組樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將細(xì)胞于37 ℃5%CO2培養(yǎng)24 h，并收取培養(yǎng)上清，利用微孔板化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀（LB 960）檢測(cè)培養(yǎng)上清中熒光素酶活性。

1.10 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證rAvBD6 的免疫增強(qiáng)劑活性將10日齡SPF雞隨機(jī)分為3組，分別設(shè)實(shí)驗(yàn)組（rAvBD6 100 μL）、PBS 對(duì)照組（PBS 100 μL，control），空菌對(duì)照組（野生乳酸乳球菌NZ3900 的裂解上清100 μL，wt-lactis-control），分別經(jīng)肌肉注射免疫后兩周采血分離血清，利用ELISA 試劑盒檢測(cè)血清中IL-10、IFN-γ 和IL-2 的含量。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 進(jìn)行單因素方差分析，其結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，p<0.001為差異極顯著，p<0.05為差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 重組乳酸菌pPG612-AvBD6HA/NZ3900 的鑒定 以構(gòu)建的重組乳酸菌pPG612-AvBD6HA/NZ3900細(xì)菌培養(yǎng)液為模板，利用引物tAvBD6-F/R 進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段大小與預(yù)期相符，陰性對(duì)照無目的條帶（圖1），經(jīng)測(cè)序鑒定序列正確。表明，正確構(gòu)建了重組質(zhì)粒pPG612-AvBD6HA和重組乳酸菌pPG612-AvBD6HA/NZ3900。

圖1 重組乳酸菌的PCR 鑒定結(jié)果Fig. 1 Amplification of AvBD6HA fusion gene by PCR

2.2 rAvBD6 的鑒定和定量 重組乳酸菌pPG612-AvBD6HA/NZ3900 經(jīng)Nisin 誘 導(dǎo)后，western blot 鑒定 結(jié)果顯示，rAvBD6 大小約為21 ku，與預(yù)期相符，陰性對(duì)照無條帶（圖2）。BSA 法定量結(jié)果顯示，rAvBD6 含量為33 μg/mL。表明AvBD6 在重組乳酸菌pPG612-AvBD6HA/NZ3900 中得到了表達(dá)。

圖2 rAvBD6 融合蛋白表達(dá)的western blot 鑒定結(jié)果Fig. 2 Identification of rAvBD6 fusion protein expression by western blot

2.3 rAvBD6 刺激雞外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的檢測(cè) 利用rAvBD6 刺激雞外周血單個(gè)核細(xì)胞24 h，采用SYBY Green Ⅰ熒光定量PCR 對(duì)細(xì)胞中IL-10 和IL-12p70的mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示：rAvBD6 刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞24 h 后，與陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比產(chǎn)生了高水平的IL-10[mRNA轉(zhuǎn)錄水平為76.01，差異極顯著（p<0.0001）（圖3A）]和較高水平的IL-12p70[mRNA 轉(zhuǎn)錄水平為120.26，差異顯著（p<0.05）（圖3B）]，但I(xiàn)L-10/IL-12p70的比值rAvBD6組與對(duì)照組相比差異不顯著（圖3C），表明rAvBD6可以有效激活雞外周血單個(gè)核細(xì)胞，既能上調(diào)IL-10 的表達(dá)進(jìn)行免疫負(fù)調(diào)控，又能上調(diào)12p70 的表達(dá)進(jìn)行免疫激活，表明rAvBD6 刺激雞外周血單個(gè)核細(xì)胞可以激活免疫應(yīng)答，又能維持免疫穩(wěn)態(tài)。

圖3 rAvBD6 刺激PBMCs 后細(xì)胞因子mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)結(jié)果Fig. 3 Detection of the transcription levels of cytokines in PBMCs upon rAvBD6 stimulation

2.4 rAvBD6 刺激雞巨噬細(xì)胞系細(xì)胞因子的檢測(cè)rAvBD6 刺激雞巨噬細(xì)胞24 h ，采用熒光定量PCR對(duì)細(xì)胞中IL-10 和IL-12p70 的mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平定量分析結(jié)果顯示，rAvBD6可以刺激雞巨噬細(xì)胞產(chǎn)生較高水平IL-10（mRNA 轉(zhuǎn)錄水平為6.62）、IL-12p70（mRNA 轉(zhuǎn)錄水平為2.28），并且與陽性對(duì)照組差異顯著（*：p<0.05）（圖4A、4B）；rAvBD6刺激雞巨噬細(xì)胞IL-10/IL-12p70的比值與陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比差異顯著（p<0.05）（圖4C）。表明rAvBD6 對(duì)雞巨噬細(xì)胞同時(shí)具有免疫激活和免疫調(diào)節(jié)雙重活性。

圖4 rAvBD6 刺激HD11 細(xì)胞后細(xì)胞因子mRNA 轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)結(jié)果Fig. 4 Detection of the transcription levels of cytokines inHD11 cells upon rAvBD6 stimulation

2.5 rAvBD6 激活報(bào)告細(xì)胞系J774-DualTM細(xì)胞干擾素調(diào)節(jié)信號(hào)通路的檢測(cè) 通過rAvBD6 刺激J774-DualTM細(xì)胞24 h，結(jié)果顯示：rAvBD6 顯著激活報(bào)告細(xì)胞系J774-DualTM的IRF 信號(hào)通路（相對(duì)光子數(shù)為19619RLUs），并且與陽性對(duì)照組相比差異顯著（p<0.05）（圖5）。結(jié)果表明rAvBD6 可以顯著激活巨噬細(xì)胞的IRF信號(hào)通路，進(jìn)一步激活干擾素信號(hào)通路。

圖5 rAvBD6 刺激J774-DualTM細(xì)胞激活I(lǐng)RF 信號(hào)通路Fig. 5 Recombinant protein rAvBD6 activates IRF signaling pathway in J774-DualTM cells

2.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證rAvBD6 的免疫增強(qiáng)劑活性 免疫SPF 雞2 周后，ELISA 檢測(cè)雞血清中IFN-γ、IL-10 和IL-2 的含量。結(jié)果顯示：注射rAvBD6 兩周后雞血清中IFN-γ（mRNA 表達(dá)水平為42.36）、IL-10（mRNA 表達(dá)水平為8.28）和IL-2（mRNA 表達(dá)水平為58.72）的含量均顯著高于空白對(duì)照組和空菌對(duì)照組（p<0.05）（圖6）。結(jié)果表明，注射rAvBD6 可以有效激活SPF 雞機(jī)體的抗感染免疫應(yīng)答（產(chǎn)生較高水平的IFN-γ 和IL-2，圖6B、6C），激活免疫應(yīng)答的同時(shí)又可以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的平衡（同時(shí)產(chǎn)生較高水平的IL-10，圖6A）。

圖6 免疫兩周后雞血清中細(xì)胞因子表達(dá)量的檢測(cè)結(jié)果Fig. 6 Cytokine expression levels in serum after two weeks of immunization

3 討 論

生物安全和綠色食品安全對(duì)未來生物制劑尤其是預(yù)防性生物制劑提出了更高的要求，新型的疫苗、免疫佐劑和免疫增強(qiáng)劑等生物制劑也必須逐步符合綠色食品安全的基本要求。本研究制備了表達(dá)重組AvBD 的重組乳酸菌，采用了公認(rèn)的食品級(jí)安全級(jí)表達(dá)菌株（食品級(jí)乳酸乳球菌NZ3900 株）和食品級(jí)Nisin 誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，重組蛋白β-防御素6 也是天然AvBD6，并非人工設(shè)計(jì)的非天然蛋白，從表達(dá)系統(tǒng)到目的蛋白均完全符合綠色食品級(jí)安全的要求。AvBD6 是主要存在于天然黏膜系統(tǒng)的天然抗菌肽之一，是一種小的陽離子非糖基化的多肽（更適合于原核表達(dá)，無需糖基化），僅存于禽類中，主要分布于氣管、腸道等黏膜組織發(fā)揮抗感染作用，不僅具有廣譜的抗菌活性，還有廣泛的免疫調(diào)節(jié)活性，尤其是在天然免疫和適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)方面起重要作用[10]。并且本研究采用的食品級(jí)乳酸乳球菌NZ3900株的細(xì)胞壁成份以及其核酸均具有一定的天然免疫佐劑活性。因此，在食品安全和生物安全形勢(shì)十分嚴(yán)峻的今天，構(gòu)建安全和與益生功能相適應(yīng)的免疫佐劑和免疫增強(qiáng)劑的表達(dá)系統(tǒng)具有重要意義。

本研究表達(dá)的rAvBD6 在體內(nèi)外均可誘導(dǎo)較高水平的IL-12、IL-2 和IFN-γ，同時(shí)又可誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的IL-10。其中IL-12、IL-2 和IFN-γ 屬于典型的Th1 型細(xì)胞因子，主要功能是促進(jìn)免疫應(yīng)答，促進(jìn)T、B、NK 和巨噬細(xì)胞的發(fā)育和分化，同時(shí)抑制免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞（Treg，主要是免疫負(fù)調(diào)控T細(xì)胞）發(fā)育和抑制免疫抑制性細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放；而IL-10是典型的Treg 型細(xì)胞因子，主要功能是抑制Th1 型免疫應(yīng)答，抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放，起到免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用[11]，并且現(xiàn)代免疫學(xué)表明，IL-10 的生物學(xué)作用具有驚人的多面性和兩面性，IL-10 抑制性作用的靶細(xì)胞包括胸腺細(xì)胞，T 細(xì)胞，B 細(xì)胞，NK 細(xì)胞，單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，肥大細(xì)胞，中性粒和嗜酸性細(xì)胞[12]。而最新的研究結(jié)果表明，IL-10 主要影響單核巨噬細(xì)胞：抑制釋放炎癥介質(zhì)，抑制IL-12 的合成，阻礙Th1 免疫反應(yīng)，因此抑制LPS 和IFN-γ導(dǎo)致的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、G-CSF 和GMCSF 分泌。因此，IL-10 在天然免疫中是十分重要的調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子。但是，IL-10 可以增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞的吞噬作用，它能增加各種受體表達(dá)，這些受體能夠與調(diào)理素或非調(diào)理素結(jié)合的病原微生物相結(jié)合并攝入細(xì)胞，IL-10 刺激的單核細(xì)胞還能夠增強(qiáng)IgG-Fc 受體表達(dá)（CD64、CD32、CD16），并且CD14樣分子的表達(dá)也會(huì)增加，這些分子在細(xì)胞攝取非調(diào)理素結(jié)合物質(zhì)中有重要的作用[13-14]。并且，IL-10 同時(shí)具有免疫刺激作用，研究發(fā)現(xiàn)，它又能增強(qiáng)抗炎性因子釋放，如增強(qiáng)IL-1 受體拮抗劑和溶解性TNF-α 受體的釋放；IL-10 還能夠在體外提高小鼠脾臟來源B 細(xì)胞的存活率，促進(jìn)B 細(xì)胞表面MHCⅡ類分子的表達(dá)，促進(jìn)已激活的B 細(xì)胞增殖并分化成為漿細(xì)胞，促進(jìn)IgG1 和IgG3 的類別轉(zhuǎn)換[14]。相關(guān)機(jī)制分析發(fā)現(xiàn)，IL-10 的這種作用很可能由DC 或巨噬細(xì)胞介導(dǎo)，通過促進(jìn)表達(dá)CXCL-13 及SLAM 來招募、激活B 細(xì)胞[14]。因此，IL-10 是抗炎因子，又是免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)劑。本研究結(jié)果顯示，rAvBD6 可以同時(shí)誘導(dǎo)雞外周血單個(gè)核細(xì)胞中促炎性細(xì)胞因子IL-12、IFN-γ 和抗炎性細(xì)胞因子IL-10 的表達(dá)；同時(shí)誘導(dǎo)雞巨噬細(xì)胞中促炎性細(xì)胞因子IL-12 和抗炎性細(xì)胞因子IL-10 的表達(dá)。巨噬細(xì)胞是調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的主要免疫細(xì)胞，研究者可以從外周血單個(gè)核細(xì)胞中分離單核細(xì)胞，誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)研究[15]。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)注射rAvBD6 兩周后可同時(shí)激活SPF 雞誘導(dǎo)其產(chǎn)生高水平的IL-10、IL-2 和IFN-γ。說明rAvBD6 可激活機(jī)體免疫應(yīng)答的同時(shí)又能維持免疫調(diào)節(jié)穩(wěn)態(tài)，這與現(xiàn)代免疫調(diào)節(jié)的理念和最新研究結(jié)果相一致。本研究驗(yàn)證了rAvBD6 作為免疫增強(qiáng)劑的潛力，rAvBD6 即可提高免疫應(yīng)答，又可維持免疫穩(wěn)態(tài)，因此為天然免疫增強(qiáng)劑的開發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ)。

免疫增強(qiáng)劑是單獨(dú)使用就可激活免疫系統(tǒng)和提高免疫應(yīng)答能力，是增強(qiáng)機(jī)體特異性和非特異性免疫功能的制劑；而免疫佐劑是必須與抗原結(jié)合使用，才可提高抗原的免疫應(yīng)答水平的制劑。本研究制備的rAvBD6 單獨(dú)使用可激活機(jī)體誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的IL-10、IL-2 和IFN-γ，并且驗(yàn)證了其在體內(nèi)外的免疫調(diào)節(jié)活性的一致性，即激活免疫應(yīng)答的同時(shí)又能維持免疫穩(wěn)態(tài)。因此，本研究表達(dá)的rAvBD6 有望成為一種新型的、有潛力的天然免疫佐劑或免疫增強(qiáng)劑。本研究為重組禽防御素作為疫苗佐劑和免疫增強(qiáng)劑的研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)新型免疫佐劑或免疫增強(qiáng)劑的開發(fā)具有重大意義。