豬流行性腹瀉病毒jiaozuo1012/2019 株的分離鑒定及遺傳進(jìn)化分析

王曉斐，王 青，王玲彩，杭柏林，孫亞偉，王 磊，胡建和，徐彥召

（河南科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

河南省地處中原地區(qū)，2017 年生豬出欄量達(dá)到6 220 萬頭，成為中國(guó)第一養(yǎng)豬大省。除了2018 年席卷全國(guó)的非洲豬瘟，河南豬群中還存在相對(duì)嚴(yán)重的豬病毒性傳染病，尤其是仔豬的消化系統(tǒng)疾病是導(dǎo)致仔豬大量死亡的主要原因[1]。這些危害仔豬胃腸道健康的主要疾病有：以豬流行性腹瀉（PED）、豬傳染性胃腸炎（TGE）、豬輪狀病毒病（PoR）、豬細(xì)環(huán)病毒病等為代表的病毒性疾病，以大腸桿菌病、沙門氏菌病、魏氏梭菌、豬痢疾等為代表的細(xì)菌性疾病，以及以弓形體病和球蟲病等為代表的寄生蟲病。在這些疾病中以豬流行性腹瀉為代表的病毒性疾病是導(dǎo)致仔豬病情快速、群發(fā)、難控的主要疾病[2-4]。因此，在某種程度上，控制好仔豬的腹瀉性疾病是決定豬場(chǎng)出欄數(shù)的關(guān)鍵指標(biāo)。

豬病毒性流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、TGEV、PoRV 以及豬細(xì)小病毒等引起豬的一種高度接觸性腸道病毒性傳染病。盡管目前針對(duì)部分病原已有相對(duì)應(yīng)的商品化疫苗，但該病在豬群中仍有發(fā)生[5-7]。其中，PEDV 可感染各年齡段的豬，導(dǎo)致其出現(xiàn)嘔吐、水樣腹瀉等癥狀，其對(duì)新生仔豬的致病率和致死率可達(dá)100%[7]。

PEDV 屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，為單股正鏈RNA 病毒，其基因組含有約28 000 nt，編碼7 個(gè)ORF，可翻譯出2 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白和5 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白[8]。其中，纖突蛋白（S 蛋白）在病毒與宿主（細(xì)胞）受體結(jié)合、侵入、誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體以及病毒抗原和毒力變異等方面都發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。同時(shí)，S 基因變異性較高，不同PEDV S 基因存在核苷酸的插入、刪減等現(xiàn)象，因此S 基因常被用來分析不同時(shí)間和不同地區(qū)PEDV 流行株的親緣關(guān)系[9]。

ORF3 蛋白由位于E 蛋白基因和S 蛋白基因之間的ORF3 基因編碼。研究表明缺失ORF3 蛋白可以導(dǎo)致病毒在宿主體內(nèi)的毒力降低或者弱化，但缺失該蛋白后并不影響病毒在體內(nèi)的增殖與復(fù)制[8]。有研究者對(duì)PEDV 野毒株和致弱株的ORF3 基因序列的比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，致弱株的ORF3 基因序列中存在51 個(gè)核苷酸的缺失[10-11]。因此，對(duì)新分離株進(jìn)行ORF3 基因的序列分析，可以間接分析該病毒株毒力的強(qiáng)弱。

本研究對(duì)2019 年2 月來自河南省焦作地區(qū)某豬場(chǎng)送檢的臨床腹瀉病豬的腸道內(nèi)容物樣品進(jìn)行RTPCR 檢測(cè)，并對(duì)其中的1 份PEDV 陽性樣品進(jìn)行了病毒的分離鑒定，并對(duì)該分離株的S 基因和ORF3 基因進(jìn)行同源性及遺傳進(jìn)化關(guān)系分析，為該病在河南地區(qū)的分子流行病學(xué)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料樣品與主要試劑 5 份病料樣品采自2019年河南焦作地區(qū)某豬場(chǎng)腹瀉仔豬腸道內(nèi)容物，置于-70 ℃保存?zhèn)溆?。PEDV N 蛋白單克隆抗體（MAb）購(gòu)自Mybiosource 公司；FITC 標(biāo)記的兔抗鼠IgG-FTIC購(gòu)自Solarbio 公司；Hoechst33342 購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RNA 提取試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega 公司；反轉(zhuǎn)錄相關(guān)試劑、PCR 相關(guān)試劑、DL15000 DNA Marker、pMD19-T 載體及T4 DNA連接酶均購(gòu)自TaKaRa 公司。

1.2 引物設(shè)計(jì) 豬病毒性腹瀉相關(guān)病原PEDV、TGEV 及PoRV 的PCR 檢測(cè)引物參考王康等人[12]的研究；根據(jù)GenBank 中PEDV CV777 株（AF353511）的S基因和ORF3 基因序列設(shè)計(jì)引物。引物序列如下：S-UP： ATGAAGTCTTTAACTTACTTCTGGT/S-DP：TCACTGCACGTGGACCTTTTC；ORF3-UP：ATGTTTC TTGGACTTTTTCAAT/ORF3-DP：TCATTCACTAATTG TAGCATACTC。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 腹瀉樣品的檢測(cè) 腸道內(nèi)容物樣品經(jīng)滅菌PBS重懸后，12 000 r/min 離心5 min 后取上清液，利用試劑盒提取上清液中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，利用王康等人[12]報(bào)道的PEDV、TGEV及PoRV 的PCR 方法檢測(cè)與仔豬腹瀉相關(guān)的病毒。

1.4 病毒分離及間接免疫熒光（IFA）鑒定 隨機(jī)選取1 份PEDV 陽性的腸內(nèi)容物樣品上清液，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后，將其與胰蛋白酶混勻后接種于6 孔板中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單層Vero 細(xì)胞，每天均觀察接種細(xì)胞有無CPE 出現(xiàn)；無論接種細(xì)胞是否出現(xiàn)CPE，均收集細(xì)胞上清繼續(xù)接種Vero 細(xì)胞傳代培養(yǎng)，于接種病毒后72 h 收獲培養(yǎng)病毒[12]。收獲傳代到第3 代（F3）、第5 代（F5）的細(xì)胞上清液，提取其總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用1.2 中PEDV 的引物經(jīng)PCR 檢測(cè)。

分別將上述收獲的F3 和F5 代的病毒上清液接種于6 孔板中新鮮培養(yǎng)的Vero 細(xì)胞，24 h 后棄去上清液，PBS 洗滌后，用80 %的冷乙醇，4 ℃固定細(xì)胞1 h，然后以PEDV N 蛋白MAb（1 2 000）作為一抗，以兔抗鼠IgG-FITC（1 4 000）為二抗，經(jīng)Hoechst33342 細(xì)胞核染色后，對(duì)分離的病毒經(jīng)IFA鑒定，并在倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.5 分離病毒的S 基因和ORF3 基因的PCR 擴(kuò)增、同源性及遺傳進(jìn)化分析 提取分離病毒感染后細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用1.2 中的引物進(jìn)行全長(zhǎng)S 基因和ORF3 基因的PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物分別克隆至pMD19-T 載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-S 和pMD-ORF3，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

利用DNAStar 和MegAlign 等軟件將分離病毒的S基因和ORF3 基因與GenBank 中的已登錄的PEDV 相應(yīng)基因進(jìn)行同源性分析；利用MEGA-X 軟件構(gòu)建S基因和ORF3 基因的遺傳進(jìn)化樹，并分析該分離病毒的遺傳進(jìn)化特點(diǎn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 臨床樣品的RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果 按照文獻(xiàn)中的引物，利用RT-PCR 方法對(duì)送檢的5 份仔豬腹瀉腸內(nèi)容物樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，5 份樣品的PEDV 檢測(cè)結(jié)果均為陽性（從樣品中均擴(kuò)增出預(yù)期大小約為700 bp PEDV 基因片段）；而TGEV 和PoRV 的檢測(cè)結(jié)果均為陰性（圖略）。表明，引起該豬場(chǎng)仔豬發(fā)生腹瀉的病原主要是PEDV。

2.2 病毒的分離及IFA 鑒定結(jié)果 隨機(jī)選取1 份感染PEDV 的豬腸道內(nèi)容物樣品處理后的上清液接種單層Vero 細(xì)胞中盲傳至第3 代時(shí)（每個(gè)代次培養(yǎng)約72 h）可見感染細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞融合而產(chǎn)生核胞體的CPE（圖略）。收獲細(xì)胞上清液即為F3 代病毒，繼續(xù)對(duì)分離的病毒傳代至F5 代收獲細(xì)胞上清液，提取F3 代、F5 代細(xì)胞上清液中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cD?NA，利用1.2 中PEDV 的引物經(jīng)PCR 檢測(cè)。結(jié)果顯示，F(xiàn)3 代、F5 代的細(xì)胞上清液中均能擴(kuò)增出PEDV特異性核酸條帶。

利用PEDV 特異性MAb 對(duì)分離病毒的F3 和F5 代進(jìn)行IFA 鑒定。在倒置熒光顯微鏡下可見，感染兩個(gè)代次PEDV 后的Vero 細(xì)胞均出現(xiàn)特異性的綠色熒光（圖1）。進(jìn)一步表明分離的病毒為PEDV，將其命名為jiaozuo1012/2019 株。

圖1 分離病毒的IFA 鑒定結(jié)果Fig. 1 IFA detection of isolated PEDV

2.3 分離病毒S 基因和ORF3 基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果利用1.2 中引物對(duì)分離的PEDV 進(jìn)行S 基因和ORF3基因的PCR 擴(kuò)增。結(jié)果顯示，分別擴(kuò)增出大小約4 000 bp、600 bp 的目的基因，均與預(yù)期的S 基因和ORF3 基因大小一致（圖2）；測(cè)序結(jié)果顯示，分離的PEDV S基因全長(zhǎng)為4 161 bp，ORF3基因全長(zhǎng)為675 bp。表明，正確克隆了PEDV分離株的S基因和ORF3基因。

圖2 分離病毒的S 和ORF3 基因的RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2 Amplification results of S and ORF3 gene by RT-PCR

2.4 分離病毒S 基因和ORF 基因同源性及其遺傳進(jìn)化分析結(jié)果 S 基因的同源性分析結(jié)果顯示，PEDV 分離株與國(guó)內(nèi)外參考株的同源性為92.9%～99.3%。其中，與2015 年河南省分離的CH/HNLH/2015 株的同源性最高，為99.3%；與近年來河南分離株CH/HNYF/14、CH/HNZZ47/2016、CH/HNAY/2015 S基因的同源性分別為96.4%、98.4%和99.0%；與經(jīng)典株CV777 的同源性較低，為93.4%。利用DNAStar軟件分析該分離病毒的S 基因共編碼1 386 個(gè)氨基酸。S 基因編碼的氨基酸序列分析結(jié)果顯示，與CV777 株 相 比，jiaozuo1012/2019 株 在aa59～aa62 連 續(xù)性插入4 個(gè)氨基酸（59QGVN62）；在aa140 和aa163～aa164分別存在1個(gè)和2個(gè)氨基酸的缺失（140N和163NI164）。S 基因的進(jìn)化樹結(jié)果顯示，分離株jiaozuo1012/2019與目前河南省廣泛流行的PEDV 親緣關(guān)系最近，同處于一個(gè)分支（圖3A）。

ORF3 基因序列的同源性分析結(jié)果顯示，分離的PEDV 與國(guó)內(nèi)外參考株的同源性為92.8%～99.7%。其中，與2016 年江蘇省分離的JSCZ/1601 株的同源性最高，為99.7%；與近年來河南分離株的同源性為98.5%～99.6%；與經(jīng)典株CV777 的同源性較低，為96.6%。利用DNAStar 軟件分析該分離病毒的ORF3 基因共編碼224 個(gè)氨基酸。ORF3 基因的進(jìn)化樹結(jié)果顯示，分離株jiaozuo1012/2019 與2015 年以來國(guó)內(nèi)流行的PEDV 親緣關(guān)系最近，同處于一個(gè)分支（圖3B），與S 基因的進(jìn)化樹分析結(jié)果一致。

分離株與PEDV 經(jīng)典株進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，卻具有近年來國(guó)內(nèi)PEDV 流行株的分子特征，表明，分離的PEDV 為一株流行株。

本研究鑒定了2019 年河南某豬場(chǎng)發(fā)生仔豬腹瀉疫情的病原為PEDV，并利用Vero 細(xì)胞分離獲得了PEDV 自然感染株（jiaozuo1012/2019）。分離株經(jīng)S 基因和ORF3 基因的克隆、測(cè)序及分析，進(jìn)一步證實(shí)該株P(guān)EDV 與近年來河南地區(qū)PEDV 流行株突變特征一致，為PEDV 新的流行株[13]。本研究結(jié)果為深入探究PEDV 新流行株的致病性和致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

圖3 基于S 基因（A）和ORF3 基因（B）構(gòu)建的PEDV 進(jìn)化樹Fig. 3 Phylogenetic tree analysis based on S gene(A) and ORF3 gene (B) of the PEDV isolate