野生建蘭根際與根內(nèi)共生細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)差異分析

謝泰祥 張清華 周杰 陳娟 馬山虎 艾葉

摘要：[目的]比較野生建蘭根際和根內(nèi)細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)差異，為研究根共生細(xì)菌與建蘭的營養(yǎng)關(guān)系奠定理論基礎(chǔ)。[方法]采用高通量測序技術(shù)鑒定福州鼓山野生建蘭根際和根內(nèi)共生細(xì)菌，分析其種類多樣性和種群結(jié)構(gòu)。[結(jié)果]建蘭根際、根內(nèi)擁有種類多樣的細(xì)菌，辛普森指數(shù)分別為0.99、0.95;香農(nóng)指數(shù)比較顯示建蘭根際細(xì)菌種類多樣性顯著高于根內(nèi)。建蘭根際擁有10門細(xì)菌，優(yōu)勢門為變形菌門（60。5%）、酸桿菌門（20.5%）、放線菌門（15.3%），根內(nèi)優(yōu)勢細(xì)菌門分別為變形菌門（75.3%）、酸桿菌門（7.3%）、放線菌門（14.6%）。根際與根內(nèi)豐度最高的10個細(xì)菌屬中，Solibacter、Acidipila僅在根際中，戴氏菌、新鞘氨醇菌和Granulicella僅存在于根內(nèi)。根際中酸桿菌門酸桿菌綱的豐度顯著高于根內(nèi)，11個差異顯著的目，僅腸桿菌目在根內(nèi)的豐度大于根際，根際有12個屬的豐度顯著高于根內(nèi)。[結(jié)論]建蘭根際與根內(nèi)細(xì)菌種類豐富度存在顯著性差異，其原因可能是不同生態(tài)位的細(xì)菌對建蘭的生物學(xué)功能存在較大差異。

關(guān)鍵詞：建蘭;根際細(xì)菌;根內(nèi)生細(xì)菌;種群結(jié)構(gòu);種類多樣性

中圖分類號：Q93;S682.31文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1008-0384（2020）05-0560-09

0 引言

（研究意義）建蘭（Cymbidium ens沁Bum）隸屬于蘭科蘭屬，為多年生草本植物。建蘭具有極高的觀賞與文化價值，被譽為國蘭七大類之一?，F(xiàn)有研究表明，蘭科植物共生菌根真菌在蘭花種子萌發(fā)、植株生長發(fā)育過程中起著重要的作用。蘭科植物的菌根屬于內(nèi)生菌根類，其最大的特征就是菌根真菌在蘭科植物原球莖細(xì)胞內(nèi)或成年植物根部皮層細(xì)胞內(nèi)形成特殊的菌絲團(tuán)結(jié)構(gòu)，為蘭科植物生長提供必要的營養(yǎng)元素。因此，在現(xiàn)代菌根類型中，蘭科植物的共生菌根真菌被獨立地劃分為：蘭科菌根。除此之外，蘭科植物還存在豐富的共生細(xì)菌，本試驗研究建蘭根共生細(xì)菌的種類多樣性和種群結(jié)構(gòu)對于揭示共生細(xì)菌與建蘭的營養(yǎng)關(guān)系，指導(dǎo)人工繁育技術(shù)滿足建蘭市場需求以及保護(hù)野生建蘭資源具有重要的意義。（前人研究進(jìn)展）蘭科共生細(xì)菌在蘭花的生長發(fā)育過程中也起到重要的作用，它們可以通過產(chǎn)生生長素類物質(zhì)、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、光合作用等機(jī)制促進(jìn)蘭科植物的生長。已有的研究發(fā)現(xiàn)，從春蘭Cvrubidium goeringii根部分離獲得多個根瘤菌屬（Rhizobium）的細(xì)菌種類，能直接產(chǎn)生IAA生長激素刺激植物生長。吳慶珊等利用不同培養(yǎng)基對金釵石斛Dendrobium nobile不同部位進(jìn)行分離培養(yǎng)，獲得芽孢桿菌屬（Bacillus）和短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）為優(yōu)勢屬，Bacillussubtilissubsp.sub～lis和Brevibacillus invocatus為優(yōu)勢種，且根內(nèi)生細(xì)菌豐富度明顯高于其他部位。同時研究者在對石斛屬（Dendrobium）種子進(jìn)行體外共生萌發(fā)實驗，藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、根際細(xì)菌（Rhizobacteria）在不添加菌根真菌的條件下能刺激種子體外共生發(fā)芽。同時從建蘭根內(nèi)分離出來的真菌有鐮刀菌屬Fusarium、肉座菌屬Hypocrea、小球腔菌屬Leptosphaeria、曲霉屬Aspergillus等真菌。（本研究切入點）目前從蘭科植物中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌已經(jīng)超過60個屬，分布最為廣泛的主要種類有革蘭氏陽性菌的芽孢桿菌（Bacillus）和革蘭氏陰性菌的假單胞菌（Pseudomonas）;另外，鏈霉菌屬（streptomyces）、腸桿菌（Erwinia）、黃桿菌屬（Flavobacterium）也是常見的蘭科植物共生細(xì)菌。但是建蘭根際以及根內(nèi)共生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)尚未見相關(guān)研究報道。（擬解決的關(guān)鍵問題）本研究以福州市鼓嶺山脈的3叢野生建蘭為材料，基于高通量測序技術(shù)分析了建蘭根際土壤（Rhizosphere，Rhiz）及根內(nèi)（Endosphere，Endo）細(xì)菌的種類多樣性、種群結(jié)構(gòu)，同時比較了3叢野生建蘭根共生細(xì)菌種類的異同，篩選出共有細(xì)菌種類。研究結(jié)果將豐富人們對建蘭根際與根內(nèi)細(xì)菌的認(rèn)知，為建蘭人工快速繁育技術(shù)的開發(fā)提供相關(guān)理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 樣品采集

樣品于2018年5月在福建省福州市鼓嶺山脈采集。隨機(jī)選擇不同位置的3叢野生建蘭居群，輕輕地將土壤表面植物殘體，以及建蘭根周圍的土壤移除，僅保留根周圍0.5cm厚度的土壤。將除去殘體和根圍土壤的建蘭根剪下，用軟毛刷刷掉附著在根表面土壤顆粒，放人50ml無菌離心管，標(biāo)記為根際土壤（Rhizosphere，Rhiz），放人液氮罐中保存。

1.2 DNA提取野生建蘭根際與根內(nèi)共生細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)差異分析

樣品的處理參照Edwards等人的樣品處理方法將刷掉根表面土壤顆粒的根樣品放人無菌三角瓶中，加入100ml無菌PBS緩沖液，大力將根表面的殘余土壤洗滌下來;洗滌過后的根樣品繼續(xù)加入100ml無菌PBS緩沖液，在50～60Hz（輸出頻率42kHz，功率90w，Branson Unltrasonics）上超聲波處理30s，隨后大力搖晃并重復(fù)超聲波操作處理30s;重新加入100ml無菌PBS緩沖液，重復(fù)上述超聲波洗滌工作，以確保從根表面去除所有的微生物，清洗后的根標(biāo)記為根內(nèi)細(xì)菌（Endosphere，Endo）。使用離心柱型土壤DNA提取試劑盒（MoBio公司）提取建蘭根際土壤總DNA;根部總DNA的提取使用天根生活科技有限公司的DP305型DNA提取試劑盒。提取的DNA經(jīng)凝膠電泳檢測，合格DNA存入-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)菌16S區(qū)域擴(kuò)增及測序

將合格的DAN樣品稀釋到1ng·uL^-1，以稀釋的DNA為模板，使用引物515F（5.-GTGCC AGCMGCCGCG GTAA-3.）和806R（5-GGACT ACHVGGGTWT CTAAT-3′）擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的V4區(qū)域，PCR條件為98℃30s預(yù)變性，接下來98℃變性10s，65℃退火30s，72℃延伸30s，72℃延伸5min.將PCR產(chǎn)物純化以后送至北京諾禾致源科技股份有限公司，使用Ion Plus Fragment Library Kit 48ixns試劑盒（Thermofisher）構(gòu)建測序文庫，并根據(jù)所擴(kuò)增區(qū)域的特點，基于IonS5TMXL測序平臺，利用單端測序（Single-End）的方法，構(gòu)建小片段文庫進(jìn)行單端測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1OTU聚類和物種注釋 使用Uparse軟件對所測序樣品的全部Clean Reads進(jìn)行聚類分析，以一致性達(dá)到97%的序列聚為相同的可操作分類單位（Operational/axonomic Units，OTUs）。篩選OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列。用Mothur方法與SILVA（http：//www.arb-silva.de/）的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫對OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋（設(shè)定閾值為0.8～1.0），獲得序列指代的細(xì)菌分類地位，并在界、門、綱、目、科、屬、種水平統(tǒng)計樣品細(xì)菌的群落組成。

1.4.2種類多樣性分析使用Qiime 1.9.1對均一化處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行計算，獲得各個樣品的種類數(shù)量（Observed-species）、香農(nóng)指數(shù)（Shannon index）、Chaol指數(shù)、辛普森指數(shù)（Simpson index）;使用R軟件（Version2.15.3）繪制稀釋曲線，物種累積曲線。

1.4.3種群結(jié)構(gòu)比較分析 對3個不同居群建蘭根際、根內(nèi)細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，篩選3個不同地點樣品的共有根際、根內(nèi)細(xì)菌OTUs.根際（Rhiz）和根內(nèi)（Endo）差異顯著的物種分析利用R軟件做組間T-test檢驗并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1測序結(jié)果評價

通過對6個樣品16S rDNA V4區(qū)域進(jìn)行高通量測序共獲得430434條Clean reads，根際土壤樣品的平 均Clean reads數(shù)量為74848，根內(nèi)樣品的平均Cleanreads為68599（表1），所有樣品中最低的Cleanreads為57117.通過繪制建蘭3個樣品的根際及根內(nèi)細(xì)菌高通量測序結(jié)果的稀釋曲線（RarefactionCurve）檢測樣品的測序深度是否達(dá)到要求。稀釋曲線顯示，測序數(shù)據(jù)量達(dá)到50000條時，各樣品中呈現(xiàn)出的物種數(shù)量趨于平坦（圖1）;各樣品測序深度指數(shù)good'scoverage均等于0.998（表1）;表明該測序已經(jīng)獲得足量的測序數(shù)據(jù)，能夠有效覆蓋樣品中物種數(shù)量，測序數(shù)據(jù)量合理。

2.2 建蘭根際與根內(nèi)細(xì)菌種類多樣性分析

基于≥97%的相似度水平，通過聚類分析共獲得4412個有效OTU，根際土壤獲得（817±42）個OTU，多于根內(nèi)共的654-4-78個OTU（表1），二者不存在顯著性差異，但是香農(nóng)指數(shù)顯示根際土壤細(xì)菌的種類數(shù)量顯著高于根內(nèi)細(xì)菌種類（P=0.05）。建蘭的6個測序樣品中，End04的辛普森指數(shù)（Simpson）最低為0.90，另外2個根內(nèi)樣品辛普森指數(shù)分別為0.96與0.98，根際土壤的則為0.99，證明建蘭根際與根內(nèi)細(xì)菌種類多樣性高（辛普森指數(shù)的范圍是0～1，越趨近于l表明種類多樣性越高）。Chaol用來判斷群落的物種豐富度，數(shù)值越大，表示物種種類越多。3個根際樣品的平均細(xì)菌Chaol指數(shù)865.43大于根內(nèi)細(xì)菌的Cha01指數(shù)700.99，T-test檢驗結(jié)果顯示根際與根內(nèi)細(xì)菌種群豐富度存在顯著差異（P=0.05）。

2.3 建蘭根際與根內(nèi)細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)

對3叢野生建蘭根際細(xì)菌高通量測序獲得的224635條clear reads進(jìn)行種類注釋，發(fā)現(xiàn)建蘭根際細(xì)菌主要分布在變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、裝甲菌門（Armatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、綠彎菌門（Chlorotlexi）10個門，根際細(xì)菌的10個門含有17綱（+8個未鑒定綱），39目（+5個未鑒定目）和113個確定的屬;根內(nèi)細(xì)菌有13綱（+7個未鑒定綱），37目（+2個未鑒定目）和107個確定的屬。根際細(xì)菌中變形菌門占種群數(shù)量的60.5%，為優(yōu)勢門類，酸桿菌門占20.5%，放線菌門占15.3%，其余7個門類僅占3.7%。根內(nèi)細(xì)菌同樣分布在上述10個門，其中變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）分別占種群數(shù)量的75.3%、7.3%和14.6%。優(yōu)勢種群的綱有酸桿菌綱（Acidobacteriia）、嗜熱油菌綱（Thermoleophilia）、α-變形菌綱（Alpha-proteobacteria）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）和一個放線菌門（Actinobacteria）未確定綱（圖2）。

根際與根內(nèi)細(xì)菌群落中豐富度最高的lO個目是一致的，有一個γ-變形菌綱未定目（unidentifiedGammaproteobacteria），根瘤菌目（Rhizobiales），酸桿菌目（Acidobacteriales），土壤紅桿菌目（Solirubro-bacterales），棒桿菌目（Corynebacteriales），α-變形菌綱未定目（unidentified Alphaproteobacteria），柄桿菌目（Caulobacterales），弗蘭克氏菌目（Frankiales），Solibacterales，Micropepsales（圖3）。根據(jù)與根內(nèi)細(xì)菌豐富度最高的屬存在明顯差別。根際細(xì)菌群落豐富度最高的10個屬分別是一個伯克氏科菌未定屬（unidentified Burkholderiaceae）、熱酸菌屬（Acidothermus）、醋酸桿菌屬（Acidibacter）、Roseiarcus、分支桿菌屬（Mycobacterium）、SoBbacter、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、Conexibacter、Acidipila、和α-變形菌未鑒定屬（unidentified Alpha-proteobacteria）;根內(nèi)細(xì)菌豐富度最高的10個屬分別是一個伯克氏科菌未定屬（unidentified Burkholderiaceae）、Conexibacter、分支桿菌屬（Mycobacterium）、熱酸菌屬（Acidothermus）、Roseiarcus、戴氏菌屬（Dyella）、醋酸桿菌屬（Acidibacter）、新鞘氨醇菌屬（Novosphingobium）、GranuBcella、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）（圖4）。

2.4 建蘭根際與根內(nèi)細(xì)菌差異分析

通過T-test檢驗，在門、綱、目、屬分類單元下找出根際與根內(nèi)組間的差異物種。在P=0.05差異水平下，建蘭根際與根內(nèi)僅有酸桿菌門（Acidobacteria）數(shù)量存在顯著差異;在綱分類單元下有酸桿菌綱（Acidobacteriia）差異顯著;根際與根內(nèi)細(xì)菌種群存在顯著差異的目有：根瘤菌目（Rhizobiales）、酸桿菌目（Acidobacteriales）、柄桿菌目（Caulobacterales）、弗蘭克氏菌目（Frankiales）、粘球菌目（Myxococcales）、腸桿菌目（Enterobacteriales）、咸水球形菌目（Salinisphaerales）、Catenulisporales和噬纖維菌目（Cytophagales），還包括一個酸桿菌門未定目（unidentified Acidobacteriia）和一個疣微桿菌門未定目（unidentified Verrucomicrobiae）。有12個屬：熱酸菌屬（Acidothermus）、醋酸桿菌屬（Acidibacter）、SoBbacter、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、酸桿菌門未鑒定屬（unidentifiedAcidobacteriia）、不粘柄菌屬（Asticcacaulis）、柄細(xì)菌屬（Caulobacter）、Pedosphaera、Pajaroellobacter、嗜鹽囊菌屬（Haliangium）、Actinospica、游魚孢菌屬（Jporichthya）在建蘭根際與根內(nèi)中的種群數(shù)量存在顯著差異（圖5）。

分別分析3叢不同居群建蘭的根際、根內(nèi)細(xì)菌的共有種類，共篩選到根際共有OTUs 588個，根內(nèi)共有OTUs 379個（圖6），其中根內(nèi)共有的379個細(xì)菌OTUs中的339個同時分布在根際土壤中，僅有40個OTUs是根內(nèi)特有的。分別對共有OTUs進(jìn)行鑒定，根際的588個OTUs涉及到16綱39目93屬，根內(nèi)的379個共有OTUs鑒定出13綱，36目，64屬;根際與根內(nèi)共有的OTUs包含8門，13綱，32目60屬;根際與根內(nèi)共有的40個OTUs分布在6門，7綱，14目，能確定的屬有10個，分別是雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、Protochlamydia、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、Bauldia、紅游動菌屬（Rhodoplanes）、新鞘氨醇桿菌（Novosphingobium）、嗜酸菌屬（Acidiphilium）、蛭弧菌屬（Bdellovibrio）、沙雷氏菌屬（Serratia）。

3 討論與結(jié)論

應(yīng)用16S rDNA高通量測序鑒定3叢野生建蘭根際土壤（Rhiz）和根內(nèi)（Endo）共生細(xì)菌的種類，結(jié)果表明建蘭根際土壤和根內(nèi)都存在豐富的細(xì)菌，種類多樣性高，根際土壤細(xì)菌種類多樣性顯著高于根內(nèi)細(xì)菌（P=0.05）。對其種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)根際和根內(nèi)細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)中變形菌門細(xì)菌數(shù)量占絕對優(yōu)勢。分析3叢不同居群建蘭的根際與根內(nèi)細(xì)菌的共有OTUs，發(fā)現(xiàn)根內(nèi)絕大多數(shù)OTUs同樣存在于根際土壤中，僅有10個屬的細(xì)菌是根內(nèi)特有的。但是，差異性分析發(fā)現(xiàn)，根際與根內(nèi)細(xì)菌種類豐富度存在顯著性差異，這可能與土壤環(huán)境較植物組織內(nèi)部系統(tǒng)更為復(fù)雜有關(guān)。根內(nèi)特有細(xì)菌主要與根內(nèi)特定真菌結(jié)合形成真菌內(nèi)共生細(xì)菌（EndofungalBacteriun，EFB）。EFB主要為真菌宿主提供生物能力、糖化合物和維生素等必需因子，促進(jìn)真菌宿主降解有毒性氧化物質(zhì)的功能，從而提高植株菌根的形成量。因建蘭種子萌發(fā)需要依靠特定的菌根真菌的侵染為其提供所需的營養(yǎng)，推測真菌在完成侵染后，需要特定的細(xì)菌進(jìn)入根內(nèi)，為真菌宿主的代謝、繁殖和抗逆性提供輔助作用，從而出現(xiàn)不同生態(tài)位的細(xì)菌的生物學(xué)功能出現(xiàn)較大差異現(xiàn)象。因此，研究建蘭根際和根內(nèi)細(xì)菌的生物學(xué)功能對揭示根部共生細(xì)菌對建蘭生長的影響具有重要意義。

蘭科植物依其所屬生態(tài)類型可分為地生蘭、附生蘭和腐生蘭3類，建蘭屬于地生蘭，現(xiàn)有研究已經(jīng)證實菌根真菌在促進(jìn)建蘭種子萌發(fā)和植株生長方面起著重要的作用，而蘭科植物根際細(xì)菌，尤其是根內(nèi)生細(xì)菌的作用也逐漸被挖掘，比如石斛屬（Dendrobium）。但是關(guān)于建蘭根共生內(nèi)細(xì)菌及其與建蘭之間營養(yǎng)關(guān)系的研究尚未有報道。本文發(fā)現(xiàn)建蘭根際、根內(nèi)細(xì)菌中種群數(shù)量最高的前10個屬有中分別有8、9個確定的屬。其中，短根瘤菌屬（Bradyrhizobium）在根際和根內(nèi)都有檢測到。該屬細(xì)菌地域分布范圍很廣，能夠與多種豆科植物形成共生關(guān)系，促進(jìn)宿主N素的吸收。短根瘤菌屬在建蘭根際土壤和根內(nèi)部豐富度較高，推斷該細(xì)菌在與建蘭的生長發(fā)育存在密切的聯(lián)系，短根瘤菌是否與建蘭形成共生關(guān)系，需要獲得純培養(yǎng)菌株并進(jìn)一步接種建蘭加以驗證。很少有證據(jù)表明柄細(xì)菌屬（Caulobacter）細(xì)菌對植物有益，最新的研究發(fā)現(xiàn)Caulobacter sp RHGl菌株可以定殖擬南芥的根和芽，促進(jìn)根中的側(cè)根形成，并增加枝條中的葉數(shù)和葉大小，該屬細(xì)菌是否促進(jìn)建蘭生長根系發(fā)育需要進(jìn)一步研究。明確此類細(xì)菌與建蘭的營養(yǎng)關(guān)系能夠為建蘭人工繁育提供有效的促生因子，但是，建蘭根際和根內(nèi)存在多個目前不能培養(yǎng)的細(xì)菌，如Solibacter屬細(xì)菌，對于此類細(xì)菌功能的研究可利用宏基因組技術(shù)進(jìn)行研究。

比較建蘭根際土壤與根內(nèi)細(xì)菌種類的異同，相對豐度最高的10個屬，根際與根內(nèi)細(xì)菌存在多個相同的屬，但是Solibacter和Acidipila屬僅在根際中檢測到，而戴氏菌（Dyella）、新鞘氨醇菌（Novosphingobium）和GranuBcella屬僅存在建蘭根內(nèi)。在不同分類單元上，均存在豐度差異顯著的細(xì)菌類群;而且除了根內(nèi)特有的細(xì)菌種類，其余顯著性差異的細(xì)菌類群都是根際細(xì)菌含量高于根內(nèi)同類細(xì)菌，OTUs數(shù)量同樣顯示根際細(xì)菌的細(xì)菌數(shù)量大于根內(nèi)細(xì)菌，這與土壤環(huán)境更為復(fù)雜，微生物類群更為豐富的普遍認(rèn)知相一致。

綜述所述，建蘭根際土壤和根內(nèi)存在種類豐富的細(xì)菌，具有極高的生物多樣性，而且根際與根內(nèi)細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)存在差異，部分種類差異顯著。本研究為從建蘭根際和根內(nèi)細(xì)菌中挖掘促生因子奠定了理論基礎(chǔ)，具有一定的指導(dǎo)意義。