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    基于p38MAPK通路的電針揚(yáng)刺對(duì)大鼠創(chuàng)面修復(fù)及血清炎性因子表達(dá)的影響

    2020-11-09 10:49杜偉斌陳榮良胡華輝沈福祥曹國(guó)平王利祥全仁夫
    關(guān)鍵詞:炎性因子

    杜偉斌 陳榮良 胡華輝 沈福祥 曹國(guó)平 王利祥 全仁夫

    【摘要】 目的:探討基于p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)通路下的電針揚(yáng)刺法對(duì)大鼠創(chuàng)面修復(fù)及血清相關(guān)炎性因子表達(dá)的影響。方法:選擇健康SD大鼠30只,將其按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、電針組和電針+抑制組,每組10只。模型組制備全層皮膚缺損SD大鼠模型后每天只給予碘伏消毒包扎。電針組給予模型處理后,當(dāng)日即開始電針揚(yáng)刺治療,其后1次/d,共14次。電針+抑制組在每次電針揚(yáng)刺治療前10 min,腹腔注射SB203580 5 mg/kg。術(shù)后觀察三組大鼠的一般行為,比較術(shù)后3、7、14 d三組創(chuàng)面面積愈合情況和術(shù)后3、7 d的血清相關(guān)炎性因子表達(dá)情況。結(jié)果:術(shù)后7、14 d,三組的創(chuàng)面面積和愈合率均優(yōu)于術(shù)后3 d,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);術(shù)后7、14 d,電針組的創(chuàng)面面積及愈合率均優(yōu)于模型組、電針+抑制組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后7 d,三組血清TNF-α、IL-1β、IL-6均低于術(shù)后3 d,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);術(shù)后3、7 d,電針組血清TNF-α、IL-1β、IL-6均低于模型組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);且電針+抑制組血清TNF-α、IL-1β、IL-6均低于模型組和電針組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:電針揚(yáng)刺可抑制p38MAPK通路過度活化,降低大鼠血清中促炎因子過度表達(dá),具有一定抗感染作用,并可加速創(chuàng)面修復(fù)。

    【關(guān)鍵詞】 電針揚(yáng)刺 創(chuàng)面修復(fù) 炎性因子 皮膚缺損

    [Abstract] Objective: To investigate the effects of electroacupuncture on wound repair and expression of serum-related inflammatory factors in rats based on p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK) pathway. Method: A total of 30 healthy SD rats were selected and divided into model group, electroacupuncture group and electroacupuncture + inhibition group according to random number table method, 10 rats in each group. In the model group, SD rats with full-thickness skin defect were treated with iodopor disinfection bandage every day. After the model treatment, the electroacupuncture group started the electroacupuncture needling treatment on the same day, followed by 1 time/d for 14 times in total. In the electroacupuncture + inhibition group, SB203580 5 mg/kg was intraperitoneally injected 10 min before each electroacupuncture needling treatment. The general behaviors of the three groups of rats were observed after surgery, and the wound area healing status of the three groups 3, 7 and 14 d after surgery and the expression of serum related inflammatory factors 3 and 7 d after surgery. Result: The wound area and healing rate of the three groups were better than that of the three groups at 7 and 14 d?after surgery, the differences were statistically significant (P<0.05); 7 and 14 d after surgery, the wound area and healing rate of the electroacupuncture group were better than those of the model group and the electroacupuncture + inhibition group, with statistically significant differences (P<0.05). 7 d after operation, the serum levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 of the three groups were all lower than those of the three groups, the differences were statistically significant (P<0.05); 3 and 7 d after surgery, the serum levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 in the electroacupuncture group were lower than those in the model group, the differences were statistically significant (P<0.05); in addition, the serum levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 in the electroacupuncture + inhibition group were lower than those in the model group and the electroacupuncture group, the differences were statistically significant (P<0.05). Conclusion: Electroacupuncture quintuple puncture can inhibit the over-activation of p38MAPK pathway, reduce the over-expression of pro-inflammatory factors in rat serum, have certain anti-inflammatory effect, and accelerate wound repair.

    [Key words] Electroacupuncture quintuple puncture Wound repair Inflammatory factor Skin defect

    First-authors address: Jiangnan Hospital Affiliated to Zhejiang University of Chinese Medicine, Hangzhou 311201, China

    doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2020.26.007

    皮膚作為人體與外界環(huán)境之間的第一道屏障,是免疫系統(tǒng)的重要組成部分[1]。臨床上各種原因(如創(chuàng)傷、燒傷、切割傷等)引起的皮膚缺損越來越多,而其導(dǎo)致的皮膚面積缺損難愈,是目前臨床治療上的難點(diǎn)之一[2-3]。皮膚組織的自我更新及修復(fù)可概括為炎性反應(yīng)、細(xì)胞增殖分化和組織重塑三個(gè)階段[4-5]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinases,MAPK)是一組細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鬟f到細(xì)胞核內(nèi)的重要傳遞者,而p38MAPK是MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的通路之一。電針刺激是一種可調(diào)動(dòng)皮膚內(nèi)源性電流、糾正創(chuàng)面內(nèi)環(huán)境、加速創(chuàng)面修復(fù)的綠色療法,但其內(nèi)在作用機(jī)制尚不明確[6-7]。本實(shí)驗(yàn)基于p38MAPK通路,以電針揚(yáng)刺為主要手段,觀察干預(yù)后皮膚缺損大鼠創(chuàng)面面積及血清相關(guān)炎性因子表達(dá)的變化,從炎性反應(yīng)階段探討基于p38MAPK通路下的電針刺激對(duì)創(chuàng)面修復(fù)的影響及可能的作用機(jī)制,為中醫(yī)特色治療臨床皮膚缺損疾病提供有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù),開辟新的思路及方法?,F(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑儀器 本實(shí)驗(yàn)研究時(shí)間為2018年9月-2019年5月,清潔級(jí)SD大鼠30只,雌雄各半,體重(220±20)g,購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,SPF級(jí)分籠飼養(yǎng),溫度20~24 ℃,濕度50%~70%,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn),本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。TNF-α、IL-1β、IL-6試劑盒(assay公司,美國(guó))、SB203580抑制劑(selleck公司,美國(guó))、TaKaRa試劑盒、Trizol試劑(Invitrogen公司,美國(guó))、酶標(biāo)儀(Thermo Scientific Varioskan Flash)。

    1.2 全層皮膚缺損模型建立 結(jié)合前期造模基礎(chǔ),制備全層皮膚切除創(chuàng)面大鼠模型。大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1周,造模前12 h禁食水,麻醉后常規(guī)五點(diǎn)固定,造模區(qū)(左側(cè):脊椎左側(cè)旁2 cm;右側(cè):脊椎右側(cè)旁2 cm,選一側(cè))剪毛、脫毛處理,生理鹽水沖洗,碘伏消毒,乙醇脫碘。利用打孔器將造模區(qū)中心皮膚進(jìn)行全層切除,直徑約1.5 cm,深至皮下,制造皮膚全層切除傷模型。分置清潔籠內(nèi)單籠正常喂養(yǎng),保持傷口干燥、防止傷口感染。

    1.3 大鼠分組及處理 將30只健康SD大鼠,按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、電針組和電針+抑制組,每組10只。模型組制備全層皮膚缺損SD大鼠模型后每天只給予碘伏消毒包扎。電針組給予模型處理后,當(dāng)日即開始電針揚(yáng)刺治療(選取創(chuàng)面中心一點(diǎn)和創(chuàng)面邊緣正常皮膚0.5 cm處上下左右各一點(diǎn),給予毫針(0.20 mm×13 mm)針刺,不施針刺手法,然后連接韓氏治療儀進(jìn)行治療,負(fù)極位于中心,正極位于上下左右,頻率2 Hz,輸出電流0.6~1 mA,以毫針出現(xiàn)輕顫為度,1次/d,28 min/次)。電針+抑制組在每次電針揚(yáng)刺治療前10 min,腹腔注射抑制劑SB203580,劑量為5 mg/kg。各組每天均用碘伏消毒包扎,預(yù)防創(chuàng)口感染,喂飼標(biāo)準(zhǔn)飼料。

    1.4 觀察指標(biāo)與評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) (1)一般行為學(xué)觀察:實(shí)驗(yàn)開始后每天觀察大鼠的精神狀況、反應(yīng)能力、攝食量、攝水量以及存活數(shù)等。(2)創(chuàng)面面積變化的測(cè)定:用游標(biāo)卡尺測(cè)量并計(jì)算各組術(shù)后3、7、14 d創(chuàng)面面積和愈合率。創(chuàng)面面積愈合率=(治療前創(chuàng)面面積-治療后創(chuàng)面面積)/治療前創(chuàng)面面積×100%。(3)ELISA檢測(cè):按照大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒使用說明書進(jìn)行操作,將標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋;加入樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記二抗和酶標(biāo)試劑,37 ℃反應(yīng)1 h;洗板5次,加入顯色液A、B,37 ℃避光顯色10 min;加入終止液終止反應(yīng);上酶標(biāo)儀讀取吸光度(OD值)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液的檢測(cè)結(jié)果得出標(biāo)準(zhǔn)曲線,求出各組樣品的實(shí)際濃度。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料用(x±s)表示,兩組比較采用t檢驗(yàn),多組比較采用F檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,比較采用字2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 三組SD大鼠一般資料比較 三組SD大鼠雌雄數(shù)、體重比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性,見表1。

    2.2 三組一般行為學(xué)觀察結(jié)果 大鼠在術(shù)后首日可能因麻醉、驚嚇等原因普遍精神較差,術(shù)后第2天各組大鼠攝食量、攝水量均不同程度好轉(zhuǎn)并都基本恢復(fù)至正常水平,無死亡。

    2.3 三組創(chuàng)面修復(fù)情況比較 術(shù)后3 d,三組大鼠創(chuàng)面面積和愈合率比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);術(shù)后7、14 d,三組的創(chuàng)面面積和愈合率均優(yōu)于術(shù)后3 d,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);術(shù)后7、14 d,電針組的創(chuàng)面面積及愈合率均優(yōu)于模型組、電針+抑制組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

    2.4 三組血清相關(guān)炎性因子表達(dá)情況比較 術(shù)后7 d,三組血清TNF-α、IL-1β、IL-6均低于術(shù)后3 d,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);術(shù)后3、7 d,電針組血清TNF-α、IL-1β、IL-6均低于模型組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);且電針+抑制組血清TNF-α、IL-1β、IL-6均低于模型組和電針組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

    3 討論

    正常無損傷的皮膚往往維持一種“皮膚電池”作用。一旦皮膚受損,正常的經(jīng)上皮電位會(huì)短路,電流從損傷上皮的底部流出,并在損傷處的邊緣形成穩(wěn)定的電流,這種電流的負(fù)極指向受損皮膚表皮的深層部分,這便是損傷性內(nèi)源性電場(chǎng)[8-9]。大部分慢性難愈性創(chuàng)面表面,內(nèi)源性電場(chǎng)強(qiáng)度變?nèi)?。這使得外加微電流成為促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的一種可能的治療方案。在皮膚損傷后,創(chuàng)面組織和體內(nèi)會(huì)形成大量炎癥反應(yīng),這些炎癥介質(zhì)如未得到有效控制,可導(dǎo)致細(xì)菌的滋生繁衍,不利于創(chuàng)面修復(fù)[10-11]。因此,皮膚損傷后如何抑制過多的炎癥反應(yīng)是加速創(chuàng)面修復(fù)的重要環(huán)節(jié)之一。Gürgen等[12]對(duì)大鼠皮膚創(chuàng)面進(jìn)行2 Hz、15 min的電刺激后,在真皮、肉芽組織、毛囊、皮脂腺的TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎性細(xì)胞因子得到了明顯抑制,證明了電刺激可抑制炎癥反應(yīng)階段,縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間。

    杜偉斌等[13]總結(jié)得到MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下的電針療法可產(chǎn)生多種效應(yīng),對(duì)多種臨床疾病具有較大的研究?jī)r(jià)值。在MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路家族中,p38MAPK、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK-1/2)和c-jun末端激酶(JNK)3個(gè)途徑被最多研究。而p38MAPK信號(hào)通路能受到低氧、紫外線等因素刺激后發(fā)生磷酸化從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi),并通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性及細(xì)胞因子的合成,對(duì)炎性反應(yīng)的調(diào)控和創(chuàng)面愈合起著關(guān)鍵性的作用[14-15]。有研究表明,燒傷后p38MAPK明顯活化,并介導(dǎo)了炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生,在創(chuàng)面愈合中扮演著重要角色[16-17]。

    皮膚創(chuàng)傷相當(dāng)于中醫(yī)學(xué)的“潰瘍”“金瘍”“折瘍”。早在周代就有瘡瘍的詳細(xì)記載,并成立了獨(dú)立的???。作為祖國(guó)醫(yī)學(xué)的瑰寶,中醫(yī)針灸在治療骨傷科、皮膚科疾病方面一直被認(rèn)為是重要的治法之一。揚(yáng)刺法源自《靈樞·官針》:“揚(yáng)刺者,正內(nèi)(納)一,傍內(nèi)(納)四而浮之,以治寒氣之博大者也”。本法適用于病變范圍大、病變位置較淺的病癥,本法有舒筋活絡(luò),消腫散結(jié),益氣補(bǔ)血之功。電針刺激療法是在針刺基礎(chǔ)上外加電刺激,具有針刺及電刺激的雙重效益[18]。本課題組一直從事皮膚缺損創(chuàng)面修復(fù)的研究,電針揚(yáng)刺是指揚(yáng)針刺結(jié)合電針儀,在傳統(tǒng)針刺的基礎(chǔ)上,外加生物電的刺激,利用兩者協(xié)同作用,形成對(duì)創(chuàng)面的有效治療,是對(duì)祖國(guó)醫(yī)學(xué)中針灸學(xué)的一項(xiàng)重要革新和推進(jìn)。

    本研究基于p38MAPK通路,巧妙地運(yùn)用揚(yáng)刺法和電刺激的優(yōu)勢(shì),基于創(chuàng)面穩(wěn)態(tài)電流概念,使皮膚損傷區(qū)損傷性內(nèi)源性電場(chǎng)得到重建,發(fā)揮改善局部微循環(huán)功能,探討了對(duì)創(chuàng)面修復(fù)及血清相關(guān)炎性因子表達(dá)的影響。結(jié)果顯示:術(shù)后7、14 d,電針組愈合面積和愈合率均優(yōu)于模型組和電針+抑制組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示p38MAPK信號(hào)通路是創(chuàng)面愈合的重要靶點(diǎn),電針揚(yáng)刺可有效加速創(chuàng)面修復(fù)的作用機(jī)制可能是抑制了p38MAPK信號(hào)通路的過度活化產(chǎn)生。術(shù)后3、7 d,電針+抑制組血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量均低于模型組和電針組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示電針揚(yáng)刺可抑制過度炎癥反應(yīng)階段,且與一定程度的p38MAPK信號(hào)通路活化有關(guān),這可能是縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間作用機(jī)制之一。

    綜上所述,本研究通過電針揚(yáng)刺糾正損傷性內(nèi)源性電場(chǎng)失衡現(xiàn)象,重建創(chuàng)面穩(wěn)態(tài)電流回路發(fā)現(xiàn),其可有效加速創(chuàng)面修復(fù)。其作用機(jī)制可能是抑制了p38MAPK信號(hào)通路過度活化,降低了血清或局部組織TNF-α、IL-1β、IL-6的含量,抑制了創(chuàng)面愈合的多度炎癥反應(yīng)階段,最終縮短了創(chuàng)面愈合時(shí)間。然而皮膚組織修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜的過程,包含了炎癥反應(yīng)、再上皮化、肉芽組織新生、早期血管化等一系列演變,這需要深入研究,發(fā)揮中醫(yī)藥的作用優(yōu)勢(shì),進(jìn)一步多靶點(diǎn)研究其可靠的作用機(jī)制,并為臨床治療提供有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    參考文獻(xiàn)

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    (收稿日期:2020-03-04) (本文編輯:張爽)

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