肺炎Ⅰ號顆粒對肺炎模型小鼠Th1/Th2細(xì)胞因子表達(dá)的影響

劉建璇 李會影 于映霞 赫慧 王增玲

【摘要】 目的：探討肺炎Ⅰ號顆粒對肺炎模型小鼠Th1/Th2細(xì)胞因子表達(dá)的影響，為藥物治療提供理論基礎(chǔ)。方法：選擇60只SPF級BALB/C小鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將其分為空白對照組、模型組、肺炎Ⅰ號高劑量組、肺炎Ⅰ號中劑量組、肺炎Ⅰ號低劑量組，每組12只。連續(xù)給藥7 d后，觀察各組小鼠肺組織病理學(xué)變化情況，檢測BALF中IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α的水平。結(jié)果：肺炎Ⅰ號高劑量組、中劑量組小鼠BALF中IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α水平均明顯低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;肺炎Ⅰ號低劑量組小鼠BALF中IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α水平與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：肺炎Ⅰ號顆粒能顯著減少肺炎模型小鼠的肺部炎癥，改善肺組織病理狀態(tài);其作用機(jī)制與降低肺炎模型小鼠的Th1/Th2細(xì)胞因子IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α的表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 肺炎Ⅰ號顆粒 肺炎模型 Th1/Th2

[Abstract] Objective： To investigate the effect of Pneumonia Ⅰ Granules on the expression of Th1/Th2 cytokines in mice with pneumonia， and to provide theoretical basis for drug therapy. Method： A total of 60 SPF BALB/C mice， using the random number table method， they were divided into blank control group， model group， Pneumonia Ⅰ high-dose group， Pneumonia Ⅰ middle-dose group， Pneumonia Ⅰ low-dose group， 12 cases in each group. After 7 d of continuous administration， the changes of lung histopathology were observed and the levels of IL-1β， IL-12， IFN-γ， TNF-α in BALF were measured. Result： The levels of IL-1β， IL-12， IFN-γ， TNF-α in BALF of Pneumonia Ⅰ high-dose group and middle-dose group were significantly lower than those of model group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The levels of IL-1β， IL-12， IFN-γ， TNF-α in BALF of the Pneumonia Ⅰ low-dose group compared with the model group， the differences were not statistically significant （P>0.05）. Conclusion： Pneumonia Ⅰ Granules can significantly reduce pneumonia model mice lung inflammation， improve lung tissue pathology; the mechanism of action is associated with decreased expression of Th1/Th2 cytokines IL-1β， IL-12， IFN-γ， TNF-α in mice with pneumonia model.

[Key words] Pneumonia Ⅰ Granules Pneumonia model Th1/Th2

First-authors address： Jilin Academy of Traditional Chinese Medicine， Changchun 130012， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.26.006

肺炎患兒機(jī)體感染后，可刺激機(jī)體的淋巴細(xì)胞分泌不同的細(xì)胞因子，從而引發(fā)機(jī)體發(fā)生一系列的炎癥反應(yīng)，表明細(xì)胞因子可能在發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用，是導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生一系列臨床表現(xiàn)及免疫紊亂的重要原因[1]。Th細(xì)胞是重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，根據(jù)分泌的細(xì)胞因子不同，分為Th0、Th1、Th2、Th3四個亞型，對機(jī)體的特異性免疫和非特異性免疫均有調(diào)節(jié)作用。正常情況下，機(jī)體的Th1/Th2細(xì)胞間處于動態(tài)平衡。Th1主要分泌IL-12、IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子，介導(dǎo)細(xì)胞免疫;Th2主要分泌IL-1β等細(xì)胞因子，介導(dǎo)體液免疫;Th1/Th2的動態(tài)平衡一旦被打破，機(jī)體便會出現(xiàn)免疫異常的相關(guān)疾病，因此，維持此動態(tài)平衡及機(jī)體自身穩(wěn)定狀態(tài)具有非常重要的意義[2]。為此，本項目通過建立小鼠銅綠假單胞菌肺炎模型，探討肺炎Ⅰ號顆粒對肺炎模型小鼠Th1/Th2細(xì)胞因子表達(dá)的影響，發(fā)掘藥物治療肺炎小鼠可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物 2019年1-12月選取SPF級BALB/C小鼠60只，雌雄各半，體重20～22 g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供，許可證號：SCXK（遼）2015-0001。飼養(yǎng)于吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院動物室，動物室為清潔級，室溫：20～25 ℃，相對濕度：40%～60%。通風(fēng)換氣次數(shù)≥14次/h，每周更換一次墊草料，光照良好，采用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。籠具15 cm×18 cm×30 cm，每籠6只動物（標(biāo)記組別及每只動物序號）。

1.2 實(shí)驗用藥 肺炎Ⅰ號顆粒，是由麻黃、苦杏仁、甘草、石膏、栝樓、黃芩、清夏、葶藶子等十二味中藥組成的復(fù)方制劑。實(shí)驗用肺炎Ⅰ號干膏粉，本品呈棕褐色，味微苦、澀。每克粉相當(dāng)于5.81 g生藥，由吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院制劑室提供。配制方法：臨用時將肺炎Ⅰ號顆粒以蒸餾水配成所需濃度，用時搖勻，4 ℃保存。該藥具有清熱開閉、滌痰平喘之功效，用于小兒肺炎急性期，處于邪熱亢盛、正邪相爭階段的治療。

1.3 菌株 銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC（B）10104，由上海魯微科技有限公司提供。將銅綠假單胞菌菌落混懸于PBS液中，充分震蕩，混勻，應(yīng)用血細(xì)胞計數(shù)板調(diào)節(jié)密度至1×107 cfu/mL。

1.4 主要儀器、試劑 戊巴比妥鈉（生產(chǎn)廠家：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，規(guī)格：25 g/瓶）;低速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司，型號：KDC-2046）;酶標(biāo)儀（上海科華實(shí)驗系統(tǒng)有限公司，型號：ST-360）;細(xì)胞因子試劑盒（IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α）由美國RD公司提供。

1.5 實(shí)驗方法

1.5.1 分組及造模 實(shí)驗前小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，正常進(jìn)食，自由飲水。采用隨機(jī)數(shù)字表法，將60只BALB/C小鼠按體重分為5組，空白對照組、模型組、肺炎Ⅰ號高劑量組、肺炎Ⅰ號中劑量組、肺炎Ⅰ號低劑量組，每組12只。各組小鼠造模前稱量體重，對照組小鼠腹腔注射生理鹽水，經(jīng)鼻孔滴入生理鹽水;其余各組小鼠均腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，小鼠麻醉后，將小鼠頭后仰，經(jīng)鼻孔滴入銅綠假單胞菌液，使菌液流入呼吸道，滴入的同時注意觀察小鼠的呼吸情況和鼻尖及耳廓的顏色，若出現(xiàn)窒息情況立即給予牽拉前肢、擠壓心臟處理。模型評價標(biāo)準(zhǔn)：（1）觀察小鼠的精神、毛色等一般狀態(tài)，是否存在呼吸困難、皮膚發(fā)紺等狀況;（2）計算肺炎模型標(biāo)本中每克肺組織的含菌量，一般認(rèn)為一個標(biāo)本中含菌量>1×103 cfu/g為菌液接種成功;（3）小鼠肺組織病理學(xué)觀察：肺組織標(biāo)本中毛細(xì)血管和肺泡周圍存在大量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞的浸潤;支氣管肺泡周圍存在水腫、充血;伴有纖維素樣滲出;支氣管肺泡有萎縮、塌陷、壞死灶等情況的出現(xiàn)[3]。

1.5.2 給藥 造模成功后，空白對照組和模型組分別給予生理鹽水灌胃，肺炎Ⅰ號高、中、低劑量組分別按劑量給予肺炎Ⅰ號顆粒灌胃，肺炎Ⅰ號顆粒的臨床等效劑量為37.92 g生藥/kg，本次實(shí)驗涉及的高、中、低劑量組分別為75.84 g生藥/kg，37.92 g生藥/kg，18.96 g生藥/kg。各組小鼠均連續(xù)給藥7 d，用藥期間每天觀察各組小鼠表現(xiàn)，如小鼠存活、進(jìn)食、飲水、活動度、精神狀態(tài)差，有無豎毛寒戰(zhàn)、咳嗽，口鼻分泌物有無增多。給藥結(jié)束后，小鼠采用腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，麻醉后固定于解剖板。75%酒精消毒后，剖胸腔，從右心室插至肺動脈，生理鹽水快速沖洗干凈后，4%的甲醛溶液注入進(jìn)行內(nèi)固定，待小鼠全身僵硬固定后取肺上葉，放入4%的甲醛溶液外固定24 h以上，然后采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測BALF中IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子的水平，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗;計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般資料比較 空白對照組，雌6只，雄6只，平均體重（20.7±2.3）g;模型組雌6只，雄6只，平均體重（20.9±2.5）g;肺炎Ⅰ號高劑量組雌6只，雄6只，平均體重（20.6±2.1）g;肺炎Ⅰ號中劑量組雌6只，雄6只，平均體重（21.1±2.4）g;肺炎Ⅰ號低劑量組雌6只，雄6只，平均體重（20.9±2.3）g。各組小鼠一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 各組小鼠一般狀況觀察 銅綠假單胞菌接種后第1天，小鼠的進(jìn)食、飲水、活動度正常，精神狀態(tài)略差。接種第2天開始，小鼠的進(jìn)食、飲水明顯減少，活動度開始下降，精神狀態(tài)差，豎毛寒戰(zhàn)，尤其是口鼻部分泌物明顯增多，頻繁出現(xiàn)張口呼吸、打噴嚏、咳嗽等癥狀?？瞻讓φ战M小鼠的一般狀況無異常表現(xiàn)。

2.3 各組小鼠肺組織病理學(xué)變化情況 空白對照組正常小鼠肺組織內(nèi)解剖位置內(nèi)未見炎細(xì)胞浸潤，氣道通暢，未見炎性滲出，肺泡形態(tài)規(guī)整，未見肺泡間隔增寬，為正常肺組織，見圖1。銅綠假單胞菌肺炎模型組小鼠，肺組織內(nèi)可見較大肺膿腫，大量中性粒細(xì)胞集中分布在肺內(nèi)主氣道附近的肺泡與肺間隔內(nèi)，局部肺泡結(jié)構(gòu)破壞、崩解、出血;部分肺間隔增寬增厚，其內(nèi)可見炎細(xì)胞聚集性浸潤;殘存肺泡擴(kuò)張融合，形成較小的肺氣腫，符合典型肺炎急性感染期的形態(tài)變化，見圖2。肺炎Ⅰ號高劑量組肺炎小鼠肺內(nèi)炎癥浸潤程度與累計范圍明顯減輕，與模型組比較，肺組織病理狀態(tài)改善明顯，見圖3。中劑量組肺內(nèi)氣道周圍可見輕度炎癥反應(yīng)，肺泡間隔中度增寬，肺泡中度擴(kuò)張，未加明顯肺實(shí)變與肺膿腫形成，有效減少憤怒炎癥反應(yīng)，有效保護(hù)肺臟對抗細(xì)菌攻擊，見圖4。低劑量組肺內(nèi)氣道旁可見中度炎癥反應(yīng)，肺泡間隔增寬，可見局部肺泡融合，炎細(xì)胞浸潤程度重于高、中劑量組，與模型組比較，炎癥程度與受累范圍有減輕，可以在一定程度上，控制炎癥的擴(kuò)散范圍，見圖5。

2.4 肺炎Ⅰ號顆粒對于肺炎模型小鼠BALF中細(xì)胞因子表達(dá)的影響 模型組小鼠BALF中IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α水平均明顯高于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;肺炎Ⅰ號高劑量組、中劑量組小鼠BALF中IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α水平均明顯低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;肺炎Ⅰ號低劑量組小鼠BALF中IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α水平與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

3 討論

小兒肺炎被世界衛(wèi)生組織列為全球三種重要的兒科疾病之一，我國政府也將其列為兒科重點(diǎn)防治的四種疾病之一[4]。肺炎Ⅰ號顆粒是在祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)理論指導(dǎo)下，經(jīng)臨床醫(yī)院長期應(yīng)用而確定的經(jīng)驗方，該方是基于“開”法治療痰熱閉肺型小兒肺炎的全新研究，治療時通過向外、向上宣肺、清肺以祛邪，向內(nèi)、向下肅降痰熱水濕，以恢復(fù)肺的升降出入功能。本項目通過深入研究中醫(yī)藥治療小兒肺炎的優(yōu)勢特色，旨在發(fā)掘中醫(yī)藥治療小兒肺炎的創(chuàng)新技術(shù)方法，為進(jìn)一步促進(jìn)中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展貢獻(xiàn)力量[5-6]。

銅綠假單胞菌是全球公認(rèn)的醫(yī)院獲得性感染最常見、最重要的致病菌之一，在呼吸內(nèi)科住院患者肺部感染病原菌中，革蘭陽性桿菌感染約為47%，銅綠假單胞菌約占15%。呼吸系統(tǒng)感染疾病在臨床上較為常見，但實(shí)驗動物通常對于致病菌具有較強(qiáng)的耐受性，為了建立穩(wěn)定可靠的肺炎模型，關(guān)鍵在于選取致病力強(qiáng)而毒性穩(wěn)定的感染菌株，且造模過程操作熟練，切實(shí)保證小鼠肺炎模型的成功率，從而建立與人類肺炎疾病相似的模型[7-12]。

本實(shí)驗采用銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC（B）10104建立小鼠肺炎模型，造模成功率高，模型小鼠肺組織內(nèi)可見較大肺膿腫，局部肺泡結(jié)構(gòu)破壞、崩解、出血;部分肺間隔增寬增厚，其內(nèi)可見炎細(xì)胞聚集性浸潤;殘存肺泡擴(kuò)張融合，形成較小的肺氣腫，符合典型肺炎急性感染期的形態(tài)變化[13-20]。通過采用ELISA法檢測BALF中IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α水平發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠BALF中IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α水平均明顯高于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;肺炎Ⅰ號高劑量組、中劑量組小鼠BALF中IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α水平均明顯低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;肺炎Ⅰ號低劑量組小鼠BALF中IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α水平與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

綜上所述，肺炎Ⅰ號顆粒能顯著減少肺炎模型小鼠的肺部炎癥，改善肺組織病理狀態(tài);其作用機(jī)制與降低肺炎模型小鼠的Th1/Th2細(xì)胞因子IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α的表達(dá)有關(guān)。

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（收稿日期：2020-03-04） （本文編輯：張爽）