線粒體靶向載體的合成以及生物活性研究*

王 睿，董 超，金小紅，高 濤**

(1.湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧 437100;2.湖北科技學院非動力核技術與化學生物學院)

線粒體是真核細胞中重要的細胞器，在細胞的能量代謝，鈣穩(wěn)態(tài)調控及細胞凋亡控制中發(fā)揮重要的作用[1-2]。許多疾病如癌癥、阿爾茨海默癥、糖尿病、衰老等都和線粒體的狀態(tài)相關[3]。因此，線粒體也是細胞的“狀態(tài)風向標”。以腫瘤細胞為例，腫瘤細胞的無序增殖，需要更多的能量參入細胞的代謝。因此，正常細胞和癌細胞的線粒體存在較大的差異[4]。研究發(fā)現，癌細胞線粒體的跨膜電勢遠高于正常細胞線粒體，以此為靶點的藥物能富集于癌細胞線粒體，藥物在癌細胞中濃度比正常細胞高近千倍[5]。在使用此類藥物進行治療時，可以極大地提高藥物對腫瘤細胞的活性而降低對正常細胞的影響，是解決抗腫瘤藥物的副作用及耐藥性的重要手段[6-8]。此外，將抗氧化的小分子化合物靶向進入線粒體，也是合成治療神經退行性新疾病及抗衰老藥物的重要策略[9]。

藥物的線粒體靶向功能的實現，和線粒體靶向載體的選擇密切相關。目前常用的線粒體靶向載體有 Rhodamine-123、F16、三苯基膦鹽等電子移位親脂性陽離子(DLCs)[10-12]。但是這些化合物存在熒光強度弱，合成難度大，細胞毒性大的弱點，有待進一步的改進。作為前期工作，本課題組在線粒體靶向載體的篩選方面做了大量的預研工作。我們使用吡啶-4-甲醛合成了具有熒光特性的化合物吡啶-BODIPY，進一步通過碘甲烷對吡啶進行修飾，合成了吡啶鹽-BODIPY。該化合物展現出熒光量子產率高，細胞毒性低、穩(wěn)定性好的優(yōu)勢，并且具有線粒體靶向功能，是一種非常優(yōu)秀的線粒體靶向熒光母體。因此，使用吡啶鹽-BODIPY對二碳基配體進行修飾，合成得到了化合物PBT；通過核磁氫譜、碳譜對化合物進行了表征；利用MTT實驗研究了PBT對人肺腺癌細胞(H1975)的細胞毒性；并使用激光共聚焦顯微成像技術研究PBT的線粒體靶向能力。上述研究表明，PBT是一種生物相容性好、光物理性質穩(wěn)定的新型線粒體靶向熒光載體，該研究對線粒體靶向藥物的研發(fā)具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ZF-6型三用紫外分析儀(鞏義市予華儀器有限責任公司)，日立F-4500型熒光分光光度計(日本日立)；400M型核磁共振儀(德國布魯克)；LCMS8040型液質聯用儀(日本島津)；NOL-LSM 710型雙光子激光共聚焦顯微鏡(德國蔡司)；所用試劑均為分析純。

1.2 合成

以4-吡啶甲醛、2，4-二甲基吡咯、三氟化硼乙醚為原料，經兩步反應合成熒光化合物1；1，4-二溴丁烷和對羥基苯乙酮在堿性條件下制備化合物2；化合物2進一步和三氟乙酸乙酯反應制備化合物3；化合物1和3在高溫回流的條件下制備得到目標化合物4(PBT)。圖1為PBT的合成路線。

圖1 載體化合物的合成路線圖

1.2.1 化合物1的合成

常溫下，將4-吡啶甲醛(428mg，4mmol)溶于400mL干燥二氯甲烷中，加入2，4-二甲基吡咯(760mg，8mmol)與催化劑三氟乙酸2滴，常溫反應8h。然后加入DDQ(908mg，4mmol)，常溫條件反應2h后加入8mL三乙胺和5mL三氟化硼乙醚，再常溫反應8h，反應結束，加入等量碳酸氫鈉溶液，萃取后取有機層，旋干得黑褐色油狀物質。采用柱層析提純(400目硅膠)，洗脫劑比例(石油醚∶乙酸乙酯=5∶1，V/V)，得化合物1(390mg，產率30%)橙色固體。

1H NMR (400MHz，CDCl3)δ8.78(d，J=5.6Hz，1H)，7.30(d，J=5.7Hz，1H)，6.01(s，1H)，2.56(s，3H)，1.41(s，3H)。13CNMR(101MHz，CDCl3)δ156.45，150.67，143.55，142.67，137.66，130.34，123.29，121.82，77.42，77.10，76.78，14.62。

1.2.2 化合物2的合成

在500mL圓底燒瓶中加入N，N-二甲基甲酰胺(200mL)，再加入1，4-二溴丁烷(2.13g，10mmol)和無水碳酸鉀(1.38g，10mmol)，攪拌0.5h。再取對羥基苯乙酮(0.68g，5mmol)溶于30mL N，N-二甲基甲酰胺，將所得溶液添加至初始溶液中，常溫條件下繼續(xù)反應12h。反應液進行過濾，除去無水硫酸鉀固體，將濾液溶于兩倍體積水中，用等體積乙酸乙酯萃取兩次，合并有機層。無水硫酸鈉干燥有機層，過濾掉無水硫酸鈉，濃縮有機相，將濃縮液過柱層析柱(400目硅膠，展開劑：石油醚)，得化合物中間體(1.74g，產率80%)黃色油狀物。

在50mL圓底燒瓶中加入0.15g氫化鈉(50%)和10mL干燥的四氫呋喃，通入氮氣保護，置于冰浴中攪拌，緩慢滴加三氟乙酸乙酯(1.42g，10mmol)，攪拌10min。待溫度降到零攝氏度后，將第一步所得黃色油狀產物(2.56g，10mmol)溶于5mL四氫呋喃中，滴加至反應瓶中，滴完后，室溫條件下攪拌6h。反應液用50mL水淬滅，用30mL乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，用飽和食鹽水洗滌一次，取有機層干燥，旋干得黃色固體。過柱層析(400目硅膠，洗脫劑丙酮∶正乙烷=1∶6，V/V)，得產物化合物2(2.74g，產率75%)紅色晶體。

1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.92(d，J=8.9Hz，1H)，6.97(d，J=8.9Hz，1H)，6.50(s，1H)，4.09(t，J=5.9Hz，1H)，3.50(t，J=6.4Hz，1H)，2.14-2.04(m，1H)，2.04-1.94(m，1H)。13C NMR(101MHz，CDCl3)δ186.18，175.91，163.86，131.09，130.07，125.49，118.85，116.04，114.79，91.57，91.55，77.35，77.03，76.72，67.35，33.18，29.29，27.69。

1.2.3 化合物3(PBT)的合成

取吡啶鹽-BODIPY(0.36g，1mmol)和化合物2(0.367g，1mmol)于50mL圓底燒瓶，加入適量的甲苯，加熱回流過夜。反應產生紅色固體，用二氯甲烷重結晶，即可得到純品化合物PBT(0.28g，產率40%)。

1H NMR(400MHz，DMSO)δ 9.22(s，1H)，8.25(s，1H)，7.72(d，J=18.1Hz，1H)，6.90(d，J=47.0Hz，1H)，6.06(s，1H)，4.67(s，1H)，3.94(s，1H)，2.26(s，4H)，1.97(s，1H)，1.55(s，1H)，1.19(s，3H)。13C NMR(101MHz，DMSO-d6)δ195.57，185.92，172.54，163.07，157.33，151.28，146.57，142.91，135.16，131.70，130.69，130.37，129.92，129.45，128.90，122.92，114.89，114.69，93.13，92.81，67.69，61.21，44.51，42.41，40.53，40.32，40.11，39.90，39.69，39.48，39.28，28.13，25.45，21.53，15.24，14.79，8.96。

2 結果與討論

2.1 PBT的光物理性質

PBT的光學性質在甲醇溶液中以10μmol/L的濃度進行研究(如圖2所示)，現化合物PBT具有較好的光學性質，其吸收波長最大為510nm，最大發(fā)射波長為585nm。

深色線條為紫外吸收光譜，淺色線條為熒光發(fā)射光譜

2.2 細胞毒性實驗

通過MTT法(具體步驟見表1)研究化合物3對人肺腺癌細胞(H1975)的生物活性。PBT的細胞毒性結果見圖3。由圖3可以看出，PBT對H1975的生物活性影響較小，證明該配體毒性很小，具有較好的生物相容性。

表1 MTT法的具體步驟

圖3 化合物PBT的細胞活性圖

2.3 細胞線粒體定位實驗

將人宮頸癌細胞(HeLa)鋪于經特殊處理的小皿內，其具有良好透光性，待細胞貼壁后，換用含5μmol/L化合物3的培養(yǎng)基處理0.5h。棄培養(yǎng)基，加PBS，加入2μM MTR(MitoTracker?Red CM-H2XRos)對細胞線粒體進行染色標記。置于培養(yǎng)箱中37℃避光染色0.5h后，棄染色液，加入PBS，利用共聚焦顯微鏡對熒光信號進行檢測，并記錄結果。

在共焦激光掃描顯微鏡下研究了化合物PBT細胞線粒體定位能力(見圖4，封二)。如圖4所示，化合物PBT具有綠色熒光信號，線粒體熒光染料具有紅色熒光信號，且化合物PBT產生的綠色熒光信號與線粒體熒光染料產生的紅色熒光信號完全重疊?；衔颬BT的細胞線粒體定位實驗表明，其在細胞內主要集中的細胞器是線粒體，具有線粒體靶向特性，能在細胞線粒體中選擇性集聚。化合物PBT在細胞中具有良好的線粒體靶向特性和亞細胞實時成像能力。

3 結 論

以吡啶鹽-BODIPY為熒光母體修飾二碳基配體，合成得到線粒體靶向載體PBT，通過核磁氫譜和碳譜明確了化合物結構。進一步，用過紫外和熒光分光光度計研究了化學PBT的光物理性質。通過MTT實驗評估的化合物的細胞毒性，發(fā)現化合物的細胞毒性極低，具有非常好的生物相容性。在此基礎上，通過激光共聚焦顯微成像技術，使用線粒體商品染料MTR，研究PBT的細胞成像及亞細胞的定位能力，發(fā)現化合物具有較好的線粒體定位成像能力。綜上，化合物具有生物相容性好，光物理性質穩(wěn)定，能靶向進入線粒體，是一例非常優(yōu)秀的線粒體靶向載體。PBT分子中獨特的二羰基結構可以負載鉑等稀土化合物，可以用于線粒體熒光探針及線粒體靶向抗腫瘤藥物的合成。