不同晶面能納米硫化鎘致小鼠血液學(xué)指標(biāo)改變及肝組織損傷的研究

郝卓璐 任藝藝 王立元 許明顏 李清釗 曹燕花 孟春燕

華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 河北唐山 063210；①河北省秦皇島市青龍滿族自治縣醫(yī)院

近年來，納米材料已被廣泛用于科研和生產(chǎn)的各個領(lǐng)域，使人類暴露于納米顆粒的途徑變得多種多樣[1]。納米材料的化學(xué)特性、毒性主要決定于其粒徑和長度[2-3]，但對于粒徑相同但晶面能不同的納米材料的毒性大小以及致毒作用機制的研究較少。納米硫化鎘(nano-CdS)是目前使用較為廣泛的半導(dǎo)體材料，因其良好的性能而具有廣泛的潛在應(yīng)用價值[4]。本文主要研究粒徑相同但晶面能不同的兩種納米硫化鎘材料對小鼠血液指標(biāo)及肝臟組織的毒性作用，探討晶面能的差異性是否影響納米材料的致毒作用。

1 材料與方法

1.1主要儀器與試劑 全自動生化測定儀(型號：AU5800，美國，貝克曼庫爾特)；血常規(guī)檢測儀(型號：BC-2600，中國，邁瑞公司)；MDA試劑盒和NO檢測試劑盒均購自南京建成生物制品公司。

1.2實驗動物 24只清潔級昆明種小鼠，體重18～22g，飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)實驗動物中心，動物證號SCXK(京)2009-0004，飼養(yǎng)環(huán)境溫度(22±2)℃，濕度(50±10)%，12小時晝夜交替光照。以滅菌常規(guī)鼠糧和蒸餾水供小鼠自由取食、飲水。

1.3納米材料 納米硫化鎘表征：本研究所用的兩種納米硫化鎘材料為單晶結(jié)構(gòu)的納米棒，直徑20～30nm，長度80～100nm，CdS1和CdS2分別為沿不同晶面生長的兩種納米材料，見圖1。經(jīng)擬合計算CdS2的晶面能量高于CdS1(納米材料及晶面能計算數(shù)據(jù)由南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院劉璐教授惠贈)。

圖1 兩種納米硫化鎘的電鏡照片(a: CdS1[5]；b: CdS2 )

1.4染毒方式 動物隨機分為對照組、CdS1組和CdS2組，每組8只。以20mg/kg的染毒劑量將兩種納米材料(CdS1和CdS2)用生理鹽水配置成0.2mL混懸液，臨用時超聲混勻。經(jīng)腹腔注射進行染毒，每周1次連續(xù)染毒4周。對照組每次腹腔注射0.2mL的生理鹽水。

1.5血常規(guī)與血液生化 染毒結(jié)束后，采集小鼠眼球血。采集的血樣分兩部分收集：一部分置于抗凝采血管中檢測血液中紅細胞數(shù)、白細胞數(shù)、血小板數(shù)、血紅蛋白含量、紅細胞壓積以及紅細胞平均體積等指標(biāo)。另一部分血樣置于不含抗凝劑的離心管中，于冰上靜置約30分鐘，2500r/min(離心半徑5cm)離心10 分鐘，取上清置另一干凈離心管中。檢測血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的含量，并計算相應(yīng)的比值。血液學(xué)檢測結(jié)果均重復(fù)測量3次后取其平均值。

1.6肝臟組織病理檢測 采血結(jié)束后小鼠脫頸處死。于冰上取小鼠肝臟組織，生理鹽水沖洗多余血液，置10%甲醛溶液中進行固定。固定后的肝臟組織經(jīng)脫水、浸蠟、包埋、切片等步驟制作成石蠟切片，進行HE染色，顯微鏡下觀察肝臟組織病理學(xué)改變。

1.7氧化損傷檢測 每只小鼠取100mg肝臟組織，用生理鹽水對肝臟組織進行超聲勻漿，離心后取上清液待測。取小鼠血清及肝臟組織蛋白提取液，按照試劑盒說明書的方法分別檢測血清和組織液中丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)的含量。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 用Excel軟件錄入數(shù)據(jù)，并用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，采用One-way ANOVA分析各組別之間的差異，進一步采用SNK法進行兩兩比較，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，以P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同晶面能nano-CdS對小鼠血常規(guī)的影響 CdS1、CdS2組與對照組相比白細胞數(shù)、血小板數(shù)量顯著增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；且CdS2組血小板數(shù)量顯著高于CdS1組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。CdS2組與對照組相比血紅蛋白含量、紅細胞壓積、紅細胞平均體積均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；紅細胞數(shù)有所降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩種晶面能nano-CdS對小鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響

2.2兩種晶面能nano-CdS對小鼠血液生化指標(biāo)的影響 染毒結(jié)束后小鼠血清生化指標(biāo)的變化見圖2。與對照組相比，CdS1組與CdS2組血清中AST/ALT比值顯著增高，且CdS2組較CdS1組顯著增高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 小鼠血液生化指標(biāo)的變化注：與對照組相比，*P<0.05 ；與CdS1組相比，#P<0.05

2.3兩種晶面能nano-CdS對小鼠肝臟的損傷情況 對照組肝臟組織結(jié)構(gòu)清晰完整，肝索排列整齊呈放射狀，可見正常肝血竇、中央靜脈以及門管區(qū)。正常肝細胞為多邊形，細胞核為圓形，見圖3A。CdS1組小鼠肝臟組織切片中肝細胞結(jié)構(gòu)尚完整，細胞輕微水腫，胞漿內(nèi)有散在粉染勻細顆粒,見圖3B(如↓所示)。CdS2組肝臟組織切片中可見肝細胞結(jié)構(gòu)模糊且排列紊亂，胞漿出現(xiàn)輕度水腫，肝臟組織內(nèi)出現(xiàn)明顯的炎性細胞浸潤，見圖3C(如→所示)。

圖3 兩種nano-CdS對小鼠肝臟組織病理的影響(10×40)

2.4兩種晶面能nano-CdS對小鼠肝臟組織以及血清中氧化應(yīng)激產(chǎn)物的影響 CdS1組血清中MDA含量與對照組相比無明顯變化，而CdS2組顯著高于對照組、CdS1組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4A。與對照組相比， CdS1組和CdS2組血清中NO含量均顯著升高，且CdS2組高于CdS1組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4B。CdS1與CdS2組肝臟組織中MDA含量以及NO含量變化不明顯。

圖4 兩種nano-CdS對小鼠血清和肝組織氧化損傷的比較注：與對照組相比，*P<0.05 ；與CdS1組相比，#P<0.05

3 討論

隨著納米材料在人們生產(chǎn)生活中廣泛應(yīng)用，其對機體的損傷作用也受到更多關(guān)注。納米材料具有量子尺寸效應(yīng)的同時擁有比表面大的表面效應(yīng)，能夠直接穿透細胞膜進入到細胞內(nèi)，與生物大分子結(jié)合發(fā)生反應(yīng)，在體內(nèi)可以進行緩釋、靶器官蓄積、免疫識別等功能，因此納米材料的毒性比常規(guī)材料更大；納米材料的毒性與粒徑、濃度、形態(tài)等相關(guān)[2-4]，此外，晶面能也是影響其毒性的一個因素。晶面能可以通過改變晶體的形態(tài)而改變表面積，進而對納米粒子的毒性產(chǎn)生不同影響。研究發(fā)現(xiàn)納米材料晶面能越高，材料本身的穩(wěn)定性就越差，因而其反應(yīng)活性也就越高[6-7]。

白細胞在機體防御系統(tǒng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，具有抗炎、預(yù)防感染、傷口修復(fù)等功能；紅細胞數(shù)量體現(xiàn)血液運輸氧氣和二氧化碳的能力；血小板具有促凝、止血、抑制纖溶系統(tǒng)的生理功能，因此血液學(xué)指標(biāo)在一定程度上能夠反映機體的生理狀態(tài)[8-9]。本實驗結(jié)果表明，nano-CdS對小鼠進行染毒后，小鼠血細胞計數(shù)變化顯著，白細胞數(shù)量明顯增多，提示小鼠體內(nèi)存在炎癥反應(yīng)；紅細胞數(shù)量下降，血紅蛋白、紅細胞壓積、紅細胞平均體積等血液學(xué)指標(biāo)水平均降低，提示血液正常攜氧功能受到抑制；血小板數(shù)量顯著增加，提示凝血功能異常。這可能是由于炎癥細胞因子增多，促進血小板聚集，也可能與紅細胞在生成過程中被納米粒子破壞有關(guān)[9]。以上結(jié)果中，具有較高晶面能的CdS2損傷作用均較CdS1變化明顯。

AST和ALT含量可體現(xiàn)肝臟代謝及通透性變化，其比值能較敏感地反映肝臟功能[10]。本研究結(jié)果中，nano-CdS引起血清中AST/ALT升高，且CdS2組較CdS1組高(圖2)。組織病理學(xué)結(jié)果顯示，晶面能不同的兩種nano-CdS均能造成小鼠肝臟組織病理學(xué)改變(圖3)，CdS2組肝臟組織內(nèi)明顯可見炎癥細胞浸潤。以上結(jié)果均提示nano-CdS可造成小鼠血液學(xué)指標(biāo)的改變，引起肝臟功能改變，造成肝臟組織損傷，且納米材料晶面能越大，其損傷作用越明顯。

MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的標(biāo)志性產(chǎn)物[11]。諸多研究結(jié)果均證實納米材料進入機體后會誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致自由基和活性氧的產(chǎn)生，誘導(dǎo)機體發(fā)生氧化損傷[12-13]。納米材料進入機體內(nèi)可誘導(dǎo)機體活性氧(ROS)、活性氮(RNS)水平上升。多余的ROS可與脂質(zhì)、DNA、蛋白質(zhì)等多種生物大分子發(fā)生氧化反應(yīng)，從而引起血清中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平等明顯增加[13]。NO作為氧化應(yīng)激反應(yīng)中一類重要的信號傳導(dǎo)分子[14]，可能誘導(dǎo)RNS生成增加，破壞氧化還原系統(tǒng)的平衡。大量NO可刺激下游信號通路，增強血管通透性，使其釋放更多的炎癥因子，從而加重機體的炎癥反應(yīng)[15-16]。本研究結(jié)果顯示染毒組小鼠血清氧化應(yīng)激產(chǎn)物增多，且晶面能較高的CdS2生成的氧化產(chǎn)物更多(圖4)。CdS2具有較高的晶面能和較強的反應(yīng)活性，因此機體的氧化應(yīng)激反應(yīng)表現(xiàn)的更為劇烈。氧化應(yīng)激反應(yīng)可刺激免疫系統(tǒng)，破壞血管內(nèi)皮細胞，釋放更多的炎癥介質(zhì)，造成血液學(xué)指標(biāo)變化[17]。本研究中肝臟病理學(xué)已經(jīng)發(fā)生改變，但在肝臟組織中MDA、NO水平的變化并無統(tǒng)計學(xué)差異。分析原因可能與肝臟代謝水平高有關(guān)，組織中的氧化產(chǎn)物被快速轉(zhuǎn)移至血清中[18]，也可能因為檢測敏感度不夠。關(guān)于這兩種不同晶面能nano-CdS材料對肝臟組織的毒作用機制有待深一步研究和探討。

以上實驗結(jié)果均提示nano-CdS可以造成機體血液系統(tǒng)和肝臟組織損傷，晶面能高的納米材料可能具有更高的反應(yīng)活性，穩(wěn)定性相對較差，在肝臟損傷、炎癥等方面毒作用更強。國際上已經(jīng)開始重視納米材料毒性的防護工作，唐敬龍等也對2017年WHO發(fā)表的《人造納米材料職業(yè)防護指南》做了解讀，指導(dǎo)職業(yè)暴露人群如何采取有效保護措施[19]，本文研究結(jié)果從晶面能角度評價納米材料的毒性，也可指導(dǎo)納米材料的職業(yè)防護。