蒙藥材多葉棘豆和硬毛棘豆對比研究

楊立國　新紅　陳香梅　達(dá)拉胡　蘇都那布其　王秀蘭

【摘 要】 目的：探討多葉棘豆和硬毛棘豆臨床混用的合理性。方法：文章擬以多葉棘豆和硬毛棘豆為研究對象，從顯微特征、薄層色譜、HPLC特征圖譜和總黃酮含量等方面對多葉棘豆和硬毛棘豆進(jìn)行對比研究，以期為多葉棘豆和硬毛棘豆的合理應(yīng)用提供參考。結(jié)果：多葉棘豆和硬毛棘豆在化學(xué)成分方面存在著不小的差別。結(jié)論：建議臨床醫(yī)生謹(jǐn)慎混用多葉棘豆和硬毛棘豆。

【關(guān)鍵詞】 棘豆屬;顯微特征;薄層色譜;HPLC特征圖譜;總黃酮

【中圖分類號(hào)】R282.5?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2020）18-0062-04

Comparative study of Oxytropis myriophylla and Oxytropis hirta

YANG Liguo1，2 XIN Hong2 CHEN Xiangmei1 Dalahu3 Sudunabuqi2 WANG Xiulan1，2

1. College of Mongolian Medicine and Pharmacy， Inner Mongolia University for Nationalities， Tongliao 028000，China;

2. Mongolian Medicine Engineering Technology Institute of Inner Mongolia， Tongliao 028000，China;

3.Kulun Mongolian Hospital， Tongliao 028000，China

Abstract：Objective To explore the rationality of clinical mixed use of Oxytropis myriophylla and Oxytropis hirta. Methods This paper conducts a comparative study on the difference in microscopic characteristics， TLC， HPLC fingerprints and the content of total flavonoids between Oxytropis myriophylla and Oxytropis hirta， and provides the references for further studies. Results There is a big difference in chemical constituents between Oxytropis myriophylla and Oxytropis hirta. Conclusion It is suggested that clinicians should not replace each other when using Oxytropis myriophylla and Oxytropis hirta.

Keywords：Oxytropis; Microscopic Characteristics; TLC; HPLC Fingerprints; Total Flavonoids

棘豆屬植物全世界約300余種，主要分布在北半球，我國約150余種，分布在東北、華北、西北等地[1]。蒙醫(yī)藥中常用的是其中的多葉棘豆和硬毛棘豆，二者均收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)-蒙藥分冊》（1998年版）：多葉棘豆為豆科植物多葉棘豆Oxytropis myriophylla DC.的干燥全草，味苦、甘，性涼、鈍、輕、糙，具有殺“粘”、清熱、燥“協(xié)日烏素”，愈傷、生肌、鎖脈、止血、消腫、通便的功效;硬毛棘豆為豆科植物硬毛棘豆Oxytropis hirta Bge.的干燥地上部分，味苦、甘，性涼、鈍、輕、糙，具有殺“粘”、清熱、燥“協(xié)日烏素”、愈傷、生肌、鎖脈、止血、消腫、通便的功效[2]。據(jù)文獻(xiàn)[3]報(bào)道，多葉棘豆和硬毛棘豆在臨床上經(jīng)?；煊茫ㄈ鐖D1所示）。筆者前期已對多葉棘豆化學(xué)成分進(jìn)行了綜述[4]，另陳思有等[5]通過DNA條形碼將多葉棘豆和硬毛棘豆進(jìn)行鑒定，但多葉棘豆和硬毛棘豆顯微特征、薄層色譜和HPLC特征圖譜對比研究，均未見文獻(xiàn)報(bào)道。多葉棘豆和硬毛棘豆總黃酮成分含量對比研究，僅有1篇文獻(xiàn)[6]報(bào)道。鑒于上述研究現(xiàn)狀，本實(shí)驗(yàn)擬以多葉棘豆和硬毛棘豆為研究對象，從顯微特征、薄層色譜、HPLC特征圖譜和總黃酮含量等方面對多葉棘豆和硬毛棘豆進(jìn)行對比研究，以期為多葉棘豆和硬毛棘豆的合理應(yīng)用提供參考。

1.1 儀器與材料 Nikon E200電子顯微鏡和DS-U3拍照裝置（北京恒三江儀器有限公司）;多葉棘豆Oxytropis myriophylla和硬毛棘豆Oxytropis hirta采自內(nèi)蒙古蒙醫(yī)藥工程技術(shù)研究院藥草園，經(jīng)內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院吳香杰教授鑒定為正品，標(biāo)本保存于內(nèi)蒙古蒙醫(yī)藥工程技術(shù)研究院標(biāo)本室;水合氯醛、稀甘油均為分析純試劑。

1 顯微特征對比研究

1.2 方法與結(jié)果 根據(jù)《中國藥典》2015年版四部通則2001顯微鑒別法[7]規(guī)定，取多葉棘豆和硬毛棘豆粉末適量，水合氯醛、稀甘油制片進(jìn)行顯微觀察，生物光學(xué)顯微鏡下觀察顯微特征，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，多葉棘豆和硬毛棘豆藥材粉末的導(dǎo)管均為螺紋導(dǎo)管和具緣紋孔導(dǎo)管，直徑約8～45 μm;氣孔為不定式氣孔，類圓形或橢圓形，直徑10～35 μm;纖維多成束，碎斷，壁較厚，直徑8～38 μm;木栓細(xì)胞直徑約18～62 μm，二者（根部）均存在。綜上所述，二者粉末顯微特征基本相似，無顯著差異，組織切片顯微特征對比研究待進(jìn)一步開展。

2 基于薄層色譜的多葉棘豆和硬毛棘豆對比研究

2.1 儀器與材料 硅膠G板（青島海洋化工公司）;聚酰胺薄膜（浙江省臺(tái)州市路橋四甲塑料廠）;ZF-02S型紫外分析儀（北京君意東方電泳設(shè)限公司）;多葉棘豆Oxytropis myriophylla和硬毛棘豆Oxytropis hirta采自內(nèi)蒙古蒙醫(yī)藥工程技術(shù)研究院藥草園，經(jīng)內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院吳香杰教授鑒定為正品，標(biāo)本保存于內(nèi)蒙古蒙醫(yī)藥工程技術(shù)研究院標(biāo)本室;槲皮素（117-39-5，上海源葉生物科技公司）;異鼠李素（480-19-3，上海源葉生物科技公司）;蘆?。?53-18-4，上海源葉生物科技公司）;乙酸乙酯、甲醇、甲酸、冰醋酸均為分析純試劑。

2.2 方法與結(jié)果 供試品溶液的制備：分別取多葉棘豆和硬毛棘豆1 g，加65%乙醇10 mL，加熱回流2 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，備用。

對照品溶液的制備：分別取槲皮素、異鼠李素、蘆丁0.5 mg，用1 mL甲醇溶解，作為對照品溶液，備用。

展開與檢視：分別取多葉棘豆、硬毛棘豆、槲皮素、異鼠李素、蘆丁溶液各3 μL，點(diǎn)于聚酰胺薄膜上，用甲醇-水-冰醋酸=12∶3∶3展開，取出，晾干，365 nm紫外燈下檢視，結(jié)果如圖3所示;分別吸取多葉棘豆、硬毛棘豆溶液各3 μL，點(diǎn)于硅膠G板上，用乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水=15∶1∶1∶2展開，取出，晾干，10%硫酸-乙醇顯色，電吹風(fēng)加熱至斑點(diǎn)清晰，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，多葉棘豆和硬毛棘豆化學(xué)成分均很復(fù)雜，二者化學(xué)成分存在較大差異。

3 基于HPLC特征圖譜的多葉棘豆和硬毛棘豆對比研究

3.1 儀器與材料 Ultimate 3000高效液相色譜儀（LC-20AT四元泵、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20A柱溫箱、SPD-M20A紫外檢測器）;超聲波清洗器SK8200 HP（上?？茖?dǎo)超聲儀器公司）;METTLER-TOLEDO AG-285型電子分析天平（METTLER-TOLEDO有限公司）;多葉棘豆Oxytropis myriophylla和硬毛棘豆Oxytropis hirta采自內(nèi)蒙古蒙醫(yī)藥工程技術(shù)研究院藥草園，經(jīng)內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院吳香杰教授鑒定為正品，標(biāo)本保存于內(nèi)蒙古蒙醫(yī)藥工程技術(shù)研究院標(biāo)本室;乙腈為色譜純;乙酸為分析純;蒸餾水自制。

3.2 方法與結(jié)果 色譜條件：色譜柱為Waters Xterra MS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱;流動(dòng)相為乙腈-0.4%乙酸水溶液，梯度洗脫程序見表1;檢測波長為260 nm;柱溫30℃;流速1 mL/min;進(jìn)樣量10 μL。

供試品溶液的制備：分別取多葉棘豆和硬毛棘豆0.5 g，加65%乙醇10 mL，密塞，稱定重量，超聲處理40 min，取出，放冷，再稱定重量，65%乙醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過。濾液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

HPLC特征圖譜建立：分別吸取多葉棘豆、硬毛棘豆供試品溶液各10 μL，進(jìn)樣，按表1程序進(jìn)行梯度洗脫，得到多葉棘豆和硬毛棘豆HPLC特征圖譜，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，多葉棘豆和硬毛棘豆化學(xué)成分均很復(fù)雜，二者化學(xué)成分存在較大差異。

4 總黃酮含量對比研究

4.1 儀器與材料? FW-177高速萬能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器公司）;752-PC紫外-可見分光光度計(jì);HW-526數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海恒科學(xué)儀器公司）;BS224 S分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）;多葉棘豆Oxytropis myriophylla和硬毛棘豆Oxytropis hirta采自內(nèi)蒙古蒙醫(yī)藥工程技術(shù)研究院藥草園，經(jīng)內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院吳香杰教授鑒定為正品，標(biāo)本保存于內(nèi)蒙古蒙醫(yī)藥工程技術(shù)研究院標(biāo)本室;蘆?。?53-18-4，上海源葉生物科技公司）;亞硝酸鈉（天津市永大化學(xué)試劑公司）;硝酸鋁（天津市大茂化學(xué)試劑公司）;氫氧化鈉（天津市大茂化學(xué)試劑公司）;95%乙醇（天津市永大化學(xué)試劑公司）;其他試劑均為分析純。

4.2 方法[8]與結(jié)果

4.2.1 供試品溶液的制備 分別取粉碎過40目的多葉棘豆和硬毛棘豆藥材粉末各5 g，加入50 mL 65%乙醇，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，65%乙醇補(bǔ)足減失的重量，過濾，搖勻，即得供試品溶液。

4.2.2 對照品溶液的制備 精密稱定10.08 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，置于50 mL容量瓶中，加65%乙醇溶解，稀釋至刻度，配制成0.2 mg/mL對照品溶液，冷藏備用。

4.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 從不同濃度（0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.1 mg/mL、0.12 mg/mL）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液中精密量取1 mL，分別置于10 mL量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，靜置6 min后，再加入10%硝酸鋁0.3 mL，再靜置6 min，最后加入4%氫氧化鈉試液4 mL，加入65%乙醇至刻度，搖勻，靜置15 min。采用紫外-可見分光光度法，以65%乙醇為參比溶液，在510 nm處測吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程：Y=11.49X+0.0179，r2 = 0.9990。結(jié)果表明，蘆丁對照品在0.02～0.12 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。如圖5所示。

4.2.4 方法學(xué)考察 精密度試驗(yàn)：精密吸取多葉棘豆供試品溶液1 mL，照“4.2.3”項(xiàng)下制備方法顯色并測定吸光度，連續(xù)測定6次，RSD為0.36%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：在室溫下，精密吸取多葉棘豆供試品溶液1 mL，照“4.2.3”項(xiàng)下制備方法顯色后，放置0、5、10、15、20、25 min后測定其吸光度，計(jì)算RSD為2.29%，表明供試品溶液在25 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批多葉棘豆藥材，照供試品溶液的制備方法制得6份供試品溶液，各取1 mL，照“4.2.3”項(xiàng)下制備方法顯色并測定吸光度，計(jì)算所得總黃酮的平均含量為0.332 mg/g，RSD為2.54%。表明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收率試驗(yàn)：精確吸取已知含量的多葉棘豆供試品溶液0.5 mL，共6份，分別加0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5 mL，照“4.2.3”項(xiàng)下制備方法顯色并測定吸光度，計(jì)算回收率。平均回收率為94.66%，RSD為2.46%，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度。見表2。

4.2.5 多葉棘豆和硬毛棘豆總黃酮含量測定 分別稱取多葉棘豆5.0228 g和硬毛棘豆5.0218 g，按照前述方法測定多葉棘豆和硬毛棘豆中總黃酮含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，多葉棘豆中總黃酮含量為0.552 mg/g，硬毛棘豆中總黃酮含量為0.793 mg/g。

5 討論

多葉棘豆和硬毛棘豆分別為豆科植物多葉棘豆Oxytropis myriophylla DC.和硬毛棘豆Oxytropis hirta Bge.的干燥全草，二者均具有殺“粘”、清熱、燥“協(xié)日烏素”、愈傷、生肌、鎖脈、止血、消腫、通便的功效，且二者在臨床上經(jīng)?；煊肹2-3]。本實(shí)驗(yàn)從顯微特征、TLC、HPLC特征圖譜和總黃酮含量四方面對多葉棘豆和硬毛棘豆進(jìn)行對比研究，發(fā)現(xiàn)：①多葉棘豆和硬毛棘豆藥材粉末顯微特征無顯著性差異;②二者的薄層色譜存在顯著差異，硬毛棘豆化學(xué)成分更為復(fù)雜;③二者的HPLC特征圖譜也存在不小差異，總體上講，硬毛棘豆化學(xué)成分更為復(fù)雜，這與薄層色譜顯示結(jié)果一致;④總黃酮含量方面，硬毛棘豆總黃酮含量（0.793 mg/g）高于多葉棘豆總黃酮含量（0.552 mg/g）。綜上所述，多葉棘豆和硬毛棘豆在化學(xué)成分方面存在著一定的差別，建議臨床醫(yī)生謹(jǐn)慎選用。

另外，多葉棘豆和硬毛棘豆在蒙醫(yī)臨床中應(yīng)用廣泛[9]，但二者現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)仍為1998版蒙藥分冊部頒標(biāo)準(zhǔn)，急需完善更新[10-11]，本研究可為二者質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂完善工作提供一定的參考。

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（收稿日期：2020-04-16 編輯：陶希睿）

基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙藥工程研究中心開放基金項(xiàng)目（MDK2017073）;內(nèi)蒙古民族大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（BS464）;內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2019BS08017）。

作者簡介：楊立國（1985-），男，漢族，博士，講師，研究方向?yàn)槊伤幓瘜W(xué)成分研究。E-mail： yangliguo5366@163.com