MTHFR C677T基因多態(tài)性與同型半胱氨酸及冠心病的關(guān)系

趙唱 賀欣

[摘要]目的 探討亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）C677T位點基因多態(tài)性與血漿同型半胱氨酸（Hcy）水平及冠心?。–HD）的關(guān)系。方法 選取2016年12月～2019年10月阜新市第五人民醫(yī)院和錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的153例CHD患者作為CHD組，同期149例健康體檢者作為對照組。收集血脂、Hcy等生化指標(biāo)的臨床資料，應(yīng)用酶循環(huán)法測定血漿Hcy水平，并留取血液樣本，提取基因組DNA，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術(shù)檢測MTHFR基因C677T位點基因多態(tài)性。結(jié)果 在CHD組不同基因型中，Hcy水平在CC基因型中最低，在TT基因型中最高（P<0.05）;在對照組中，不同基因型的Hcy水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。CHD組的CC基因型、C等位基因頻率占比低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;CHD組的TT基因、T等位基因頻率所占比例高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。TT基因型為患CHD的獨(dú)立危險因素（OR=4.388，95%CI：2.091～5.695，P=0.001），CC基因型為CHD的獨(dú)立保護(hù)因素（OR=0.590，95%CI：0.393～0.921，P=0.001）。結(jié)論 MTHFR C677T基因多態(tài)性中TT基因型是CHD的發(fā)病危險因素。血漿Hcy水平與其密切相關(guān)，血漿Hcy水平升高與TT基因型突變和T等位基因有關(guān)。血漿Hcy水平及MTHFR C677T多態(tài)性可以作為研究CHD病因、發(fā)病機(jī)制及其遺傳機(jī)制的重要參考指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞]同型半胱氨酸;亞甲基四氫葉酸還原酶;冠心病;基因多態(tài)性

[中圖分類號] R541.4? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2020）9（b）-0004-04

Relationship between MTHFR C677T gene polymorphism and homocysteine and coronary heart disease

ZHAO Chang1? ?HE Xin2

1. The Third Department of Cardiology， Fuxin Central Hospital， Liaoning Province， Fuxin? ?123000， China; 2. The Third Department of Cardiology， the First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University， Liaoning Province， Jinzhou? ?121000， China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between C677T polymorphism of methylenetetrahydrofolate reductase （MTHFR） and the level of plasma homocysteine （Hcy） as well as coronary heart disease （CHD）. Methods From December 2016 to October 2019， 153 patients with CHD from Fuxin Fifth People′s Hospital and the First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University were selected as CHD group， and 149 subjects for healthy examination were selected as the control group at the same period. The clinical data of biochemical indexes such as blood lipid and Hcy were collected. The plasma Hcy level was measured by enzyme circulation method. The blood samples were taken to extract genomic DNA， and the C677T polymorphism of MTHFR gene was detected by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism （PCR-RFLP）. Results The Hcy level was the lowest in CC genotype and the highest in TT genotype in CHD group （P<0.05）. In the control group， the Hcy level in different genotypes showed no significant difference （P>0.05）. The proportions of CC genotype and C allele frequency in the CHD group were lower than those in the control group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. The proportions of TT genotype and T allele frequency in the CHD group were higher than those in the control group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. TT genotype was an independent risk factor for CHD （OR=4.388， 95%CI： 2.091-5.695， P=0.001）， and CC genotype was an independent protective factor for CHD （OR=0.590， 95%CI： 0.393-0.921， P=0.001）. Conclusion TT genotype in MTHFR C677T polymorphism is a risk factor for CHD. The plasma Hcy level is closely related to it， the increase of plasma Hcy level is related to TT genotype mutation and T allele. Hcy level in plasma and MTHFR C677T polymorphism may be an important reference indexes to study the etiology， pathogenesis and genetic mechanism of CHD.

[Key words] Homocysteine; Methylenetetrahydrofolate reductase; Coronary heart disease; Gene polymorphism

最近研究表明，同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）處于高水平是導(dǎo)致冠狀動脈病變的獨(dú)立危險因素[1-2]。作為Hcy代謝的關(guān)鍵酶亞甲基四氫葉酸還原酶（methy-lenetrahy drofolate reductase，MTHFR）基因常在677位發(fā)生錯義突變，導(dǎo)致該酶的活性下降，引起Hcy水平上升。有研究發(fā)現(xiàn)，該基因是心血管疾病發(fā)生的危險因素[3-4]。本研究選取冠心?。╟oronary heart disease，CHD）患者作為研究對象，通過分析MTHFR C677T基因多態(tài)性和等位基因頻率，進(jìn)一步探索MTHFR C677T基因多態(tài)性和血漿Hcy水平的相關(guān)性以及MTHFR C677T基因多態(tài)性與CHD發(fā)病的相關(guān)性，從遺傳角度為CHD的發(fā)病機(jī)制及診療提供新的方法，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2016年12月～2019年10月于阜新市第五人民醫(yī)院和錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院和門診就診的經(jīng)冠狀動脈造影確診的153例CHD患者作為CHD組，同時收集149例健康體檢者作為對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有試驗均符合倫理準(zhǔn)則，并獲得研究對象或親屬的知情同意。CHD診斷標(biāo)準(zhǔn)：中華醫(yī)學(xué)會急性非ST段抬高型急性冠脈綜合征診斷和治療指南及急性ST段抬高型心肌梗死診斷與治療指南中頒布的急性冠脈綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn)[5-6]。

1.2方法

1.2.1實驗室檢測方法? 采集空腹12 h以上外周靜脈血至于EDTA抗凝，血漿-80℃凍存待測Hcy，血細(xì)胞作提取DNA用。Hcy通過酶循環(huán)法測定（上?？迫A卓越生化分析儀），檢測試劑批號：14030403（北京中生公司）。通過全自動生化儀（BeckmanDXC800）測定血脂、腎功能、血糖指標(biāo)。

1.2.2 DNA檢測方法? 采用人外周血DNA提取試劑盒（德國QIAGEN公司，批號：52904），提取人基因組DNA，采用Nano Drop檢測基因組DNA濃度。基因組DNA置于-80℃貯存。應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術(shù)檢測MTHFR基因單核苷酸多態(tài)性（C-T）。PCR引物為：上游5′-AGGCCCTATGGTAGTGCCTTT-3′，下游5′-TCTCTTAGTGCTGTG GTCAC-3′。PCR體系為：基因組DNA模板100 ng，上下游引物各2 μl，2×PCR MIX 25 μl，用ddH2O補(bǔ)足至50 μl。PCR反應(yīng)溫度設(shè)置如下：94℃變性8 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，34個循環(huán)，72℃延伸8 min，PCR產(chǎn)物4℃貯存。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

所有統(tǒng)計學(xué)資料由Epi data軟件整理錄入，采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩兩比較采用LSD-t檢驗;計數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗。基因型頻率的分布采用Hardy-Weinberg平衡χ2檢驗;應(yīng)用Logistic回歸分析CHD患病的危險因素，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 MTHFR基因酶切結(jié)果

MTHFR基因型酶切后電泳結(jié)果顯示三種結(jié)果：CC基因型、CT基因型、TT基因型。PCR目的片段為246 bp，利用HinfI內(nèi)切酶對246 bp的目的片段進(jìn)行酶切，含C等位基因為246 bp，T等位基因被HinfI酶切成兩條片段，分別為174 bp和72 bp。MTHFRC677T基因多態(tài)性符合Hardy-Wenberg平衡，具有群體代表性。

2.2兩組MTHFR基因C677T基因型的比較

CHD組的CC基因型、C等位基因頻率占比低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;CHD組的CT基因型占比與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;CHD組的TT基因、T等位基因頻率所占比例高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.3兩組受試者不同基因型臨床資料的比較

對照組和CHD組不同基因型研究對象的年齡、糖尿病、高血壓、吸煙和生化指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。在CHD組不同基因型中，Hcy水平在CC基因型中最低，在TT基因型中最高（P<0.01）。在對照組中，不同基因型的Hcy水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

2.4不同基因型患CHD的Logistic回歸分析

不同MTHFR基因C677T基因型患CHD的Logistic回歸分析顯示，TT基因型為患CHD的獨(dú)立危險因素（OR=4.388，95%CI：2.091～5.695，P<0.01），而CC基因型為CHD的獨(dú)立保護(hù)因素（OR=0.590，95%CI：0.393～0.921，P<0.01）（表3）。

3討論

在Hcy的代謝途徑中，5，10-亞甲基四氫葉酸還原到5-甲基四氫葉酸的反應(yīng)中，黃素依賴酶MTHFR作為關(guān)鍵酶之一參與到上述還原反應(yīng)中。MTHFR C677T點突變，使MTHFR氨基酸結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而影響MTHFR的活性[7]。Hcy通過促進(jìn)低密度脂蛋白氧化，加速激活血小板聚集，使血管內(nèi)皮受損，進(jìn)而引起一系列心血管事件的發(fā)生[8]。Hcy水平受MTHFR活性的影響，當(dāng)C677T發(fā)生突變時可引起MTHFR活性改變。國外研究認(rèn)為，未發(fā)生MTHFR基因突變的患者其血漿Hcy水平明顯低于發(fā)生突變的患者，等位基因的分布頻率也與高水平的Hcy具有顯著相關(guān)性[9-10]。本研究結(jié)果顯示，MTHFR基因型有三種：CC基因型、CT基因型、TT基因型;MTHFR C677T基因多態(tài)性符合Hardy-Wenberg平衡，具有群體代表性;CHD組的TT基因、T等位基因頻率所占比例高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。CHD組中，Hcy水平在CC基因型中最低，在TT基因型中最高（P<0.01），TT基因型Hcy水平高于CC基因型和TC基因型（P<0.05）。在對照組中，Hcy水平在各個不同基因型中未見明顯差異（P>0.05）。因為Hcy代謝受MTHFR活性的影響，當(dāng)TT基因型發(fā)生突變時會使MTHFR活性下降導(dǎo)致Hcy水平升高。高Hcy血癥一個重要的遺傳因素是MTHFR基因純合突變。MTHFR的三種基因型中，對酶活性影響最大的為TT基因型。通過對37℃時CC與TT基因型發(fā)生突變時的酶活性比較，當(dāng)TT基因型發(fā)生突變時，其酶活性降低明顯，僅為CC型的50%左右[11]。CT基因型發(fā)生突變時酶活性也同樣降低，其酶活性的下降程度居中。本研究可得出與上述一致的結(jié)論。由于Hcy特殊的臨床意義，故可在有條件的情況下通過檢測患者M(jìn)THFR C677T基因多態(tài)性來實現(xiàn)疾病的早期預(yù)防、治療，同時在指導(dǎo)個體化用藥方面同樣具有重要意義。

血漿Hcy水平受基因及環(huán)境因素共同影響。由于MTHFR基因發(fā)生突變，使MTHFR酶活性降低，與葉酸結(jié)合能力下降[12-13]，同時，葉酸、維生素B12缺乏也可使Hcy升高[14]。通過對MTHFR遺傳學(xué)的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)該基因存在多種突變類型，常見的包括MTHFR G1793A、MTHFR T1317C、MTHFR C677T、MTHFR A1298C等[15]，在蛋白質(zhì)表達(dá)過程中TT型形成了酶的不耐熱表型，熱穩(wěn)定型為TC型。目前關(guān)于MTHFR基因多態(tài)性的研究眾多，且結(jié)論眾說紛紜，由于基因具有種族和民族的差異，所以會造成具有差異性的研究結(jié)果。荷蘭的Almawi等[16]對Hcy水平與MTHFR C677T基因多態(tài)性相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，Hcy水平升高及T等位基因增加同樣增加CHD的患病率。Sarecka-Hujar等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在波蘭人群中擁有TT基因型并且吸煙者患早發(fā)CHD的風(fēng)險明顯高于CC基因型且不吸煙者（OR=24.62），認(rèn)為TT基因型是波蘭人群早發(fā)CHD的重要危險因素。于善花等[18]發(fā)現(xiàn)CHD的發(fā)生與MTHFR C677T位點錯義突變相關(guān)聯(lián)。Li等[19]的研究中，MTHFR C677T TT基因型的急性冠狀動脈綜合征（ACS）患者比其他兩個基因型有更嚴(yán)重的冠狀動脈病變。本研究結(jié)果顯示，CHD組中TT基因型個體血漿Hcy水平高于其他兩基因型個體，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;對照組中TC雜合型與CC純合型Hcy水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。因此，Hcy水平受MTHFR基因型影響，當(dāng)MTHFR發(fā)生突變時影響CHD的患病率。TT基因型為患CHD的獨(dú)立危險因素，CC基因型為CHD的獨(dú)立保護(hù)因素（P<0.05）。因此，在心血管疾病的遺傳分析研究中，可將MTHFR基因的遺傳變異廣泛使用[20]。

綜上所述，CHD比較復(fù)雜，可能與基因型、環(huán)境因素、種族[21]等有關(guān)。Hcy升高及其代謝酶（MTHFR）C677T基因多態(tài)性可能與發(fā)生CHD有關(guān)，TT基因型可能為該人群易感基因型。然而，由于本研究樣本例數(shù)偏少，結(jié)果難免存在一定偏差，有待更大規(guī)模的研究揭示該基因與CHD的關(guān)系。

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（收稿日期：2020-02-24）