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    基于UPE 技術(shù)對胃潰瘍模型小鼠的探究

    2020-11-06 06:12:16曹家楨王富春趙晉瑩劉雁澤哈麗娟
    吉林中醫(yī)藥 2020年9期
    關(guān)鍵詞:魯米諾胃部光子

    曹家楨,王富春,趙晉瑩,劉雁澤,李 鐵,哈麗娟

    (長春中醫(yī)藥大學(xué),長春 130117)

    胃潰瘍是常見的慢性胃腸道消化疾病,是由多種內(nèi)源性或外源性因素如外界應(yīng)激、幽門螺桿菌感染、非甾體類抗炎藥及不良生活習(xí)慣等因素造成,導(dǎo)致侵入性因子(胃酸—胃蛋白酶)和防御性因子(黏液—碳酸氫鹽)失衡[1],造成胃黏膜及肌層受損或壞死,誘發(fā)潰瘍性病變,以胃黏膜損傷形成潰瘍灶或伴有穿孔出血為主要表現(xiàn)[2]。近年來,超微弱發(fā)光(Ultraweak-emission,UPE)技術(shù)逐漸在臨床診斷及基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中得到應(yīng)用,其中以電荷耦合器件(charge-coupled device,CCD)為主的圖像采集系統(tǒng)通過采集光子計數(shù)形成二維圖像,以獲取生物體的UPE 強度的時間及空間信息,多用于檢測生物體的自發(fā)輻射情況[3]。為了在不損傷動物的情況下觀察胃潰瘍造模情況,運用活體成像監(jiān)測是研究的關(guān)鍵手段之一。本研究擬采用UPE 技術(shù),以應(yīng)激性胃潰瘍小鼠模型為觀察對象,通過CCD 圖像采集系統(tǒng)觀察其自發(fā)光光子強度及圖像情況,判斷胃潰瘍造模成功與否,從而為探索胃潰瘍的相關(guān)機制研究奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 動物與分組 選用SPF 級雄性DBA/1J 小鼠16 只,體質(zhì)量(15±2)g,由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供,許可證號:SCXK(京)2016-0011。飼養(yǎng)于長春中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿研究所動物房,飼養(yǎng)條件:環(huán)境溫度(20±3)℃,濕度(50±2)%,12 h 明暗交替,自由攝食和飲水,適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。采用完全隨機法進行分組,空白組8 只,模型組8 只。實驗過程嚴(yán)格遵循國家衛(wèi)生研究院實驗動物護理與使用指南。

    1.2 主要試劑和儀器 魯米諾單鈉鹽(阿法埃莎化學(xué)有限公司),PBS 磷酸鹽緩沖粉劑(北京鼎國昌盛公司),異氟烷(河北一品制藥股份有限公司),恒溫水箱(常州諾基公司),CCD 圖像采集系統(tǒng)(iXon 888,北愛爾蘭Andor公司),小動物呼吸麻醉機(Matrx VIP3000,美國MIDMARK 公司)

    1.3 造模方法 造模方法采用冷水束縛應(yīng)激法[4],將模型組小鼠禁食不禁水24 h,放入由50 mL 離心管自制的冷束縛裝置中,使小鼠保持站立姿勢。在離心管上部制造通氣孔,以使小鼠在整個冷束縛過程中保持正常呼吸,并在側(cè)壁制造多個孔洞,使冷水流入離心管內(nèi),保持內(nèi)外水溫一致。將冷束縛裝置固定在釘板上,放置進恒溫水箱中,使水平面保持在胸骨劍突位置,水溫(22±2)℃,4 h 后將小鼠取出。

    1.4 CCD 圖像采集系統(tǒng) 整個實驗測試在暗室內(nèi)完成,該暗室內(nèi)無任何光源,墻壁及地面均刷黑色油漆,無任何磷光或合成色,溫度保持在(20±1.0)℃,暗室內(nèi)儀器的布局如圖1 所示。實驗人員在進入暗室前將飾品、金屬物品等發(fā)光物品卸下,用中性香皂(無香味、無酒精)清洗手部。進入暗室后,更換黑色工作服。實驗過程中的照明均采用自制的紅光手電筒,經(jīng)測試這種光對測試結(jié)果無影響。

    CCD 圖像采集系統(tǒng)采用背照式CCD 201 相機,像素分辨率為1024×1024,像素大小為13 μm2,暗電流每秒<1 電子/像素。使用0.95/25 mm 氙氣透鏡,附帶有16 mm 圖像傳感器,最大光圈f=0.95,使其在低光照條件下也能提供良好質(zhì)量的圖像。相機光譜靈敏度范圍約為200~1 000 nm,在575 nm 時達(dá)到量子效率峰值(92%)。該系統(tǒng)配備有冷卻頭及水冷式冷卻機,最低可將CCD 相機溫度維持在-120 ℃。

    圖1 暗室內(nèi)布局

    1.5 觀察指標(biāo) CCD 成像觀察:將小鼠及小動物呼吸麻醉機提前放置在暗室內(nèi),進行2 h 暗適應(yīng)。以2.5%濃度的異氟烷0.5 L/min 麻醉條件下完成誘導(dǎo)麻醉后,放置在觀察臺上,以1.5%濃度異氟烷0.5 L/min 的麻醉條件維持麻醉,小鼠呈仰臥位。采用Andor Solis 4.3圖像采集軟件運行Single 模式對小鼠胃部在體表投影位置進行拍照,以確保鏡頭在小鼠胃部正上方,兩者之間距離為30 cm。在確定位置之后,以Accumlate 模式對小鼠進行圖像采集15 min。完成后按體質(zhì)量濃度10 μL/g 對每只小鼠腹腔注射相應(yīng)量的0.01 mg/μL 魯米諾溶液。魯米諾[5]是一種小分子光子供體,可被活性氧(ROS)激活產(chǎn)生更強的光子,是常用的光子增強劑,對生物無危害。2 min 后再以Accumlate 模式進行圖像采集15 min,觀察CCD 成像情況。

    光子強度:運用Andor Solis 4.3 軟件選定小鼠左上腹部為測試部位,對其范圍內(nèi)的光子強度進行數(shù)字化提取,導(dǎo)出到Excel 表格中,定量分析2 組小鼠組內(nèi)及組間注射魯米諾前后光子強度差異。

    胃黏膜觀察及潰瘍指數(shù)評分:測試完成后將小鼠從暗室取出,頸椎脫臼處死,立即剖腹取胃,沿胃大彎剪開胃壁,用磷酸鹽緩沖液(PBS)在冰上對胃黏膜進行漂洗數(shù)次后,將胃黏膜展開,平鋪于顯微鏡下,以10 倍視野觀察并按Guth 標(biāo)準(zhǔn)計算胃黏膜損傷指數(shù)[6]:斑點糜爛計1 分,糜爛直徑<1 mm 為2 分,1 mm <糜爛直徑<2 mm 之間計3 分,2 mm <糜爛直徑≤4 mm 計4 分,糜爛直徑>4 mm 計5 分,寬度>2 mm 時分值×2,最后所得分相加為潰瘍指數(shù)。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,所有數(shù)據(jù)先進行正態(tài)檢驗和方差齊性檢驗,符合正態(tài)分布的以均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。組內(nèi)比較用配對t檢驗,組間比較用獨立樣本t檢驗,以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 2 組小鼠CCD 圖像觀察 從采集的圖像可觀察到CCD 相機在暗室環(huán)境下均可捕捉到小鼠圖像。通過肉眼觀察,小鼠整體輪廓清晰,且2 組小鼠胃部圖像無顯著差異。在注射魯米諾后,模型組小鼠左上腹部近胃部光子強度明顯增強,并可出現(xiàn)白色圓形光團;空白組小鼠無明顯改變,見圖2。

    圖2 各組小鼠UPE 圖像

    2.2 2 組小鼠胃部光子強度比較 見表1。

    2.3 2 組潰瘍損傷指數(shù)比較 空白組小鼠胃黏膜光滑,無黏膜糜爛、出血等損傷;模型組小鼠胃竇部有條形點或片狀出血糜爛灶,直徑<2.5 mm;Guth 指數(shù)為(3.13±0.64)分,2 組有顯著差異(P<0.05),提示造模成功。

    表1 2 組小鼠胃部光子強度比較()

    表1 2 組小鼠胃部光子強度比較()

    注:與空白組注射魯米諾前比較,# P <0.05;與空白組注射魯米諾后比較,△P <0.05;與模型組注射魯米諾前比較,▲P <0.05

    3 討論

    目前,生物光學(xué)成像技術(shù)已成為生物醫(yī)學(xué)研究的重要工具,將新型宏觀光子成像技術(shù)與數(shù)字化分析手段結(jié)合,為研究人員提供了多種可視化生物觀察技術(shù)的同時,也提供了科學(xué)的研究技術(shù)。UPE 技術(shù)作為一種非侵入性監(jiān)測手段,能有效的對機體生理、病理情況進行長期觀察。特別是以CCD 為主的圖像采集系統(tǒng)在實驗研究中被廣泛實使用。

    本研究通過采集CCD 圖像與光子能量的差異變化驗證胃潰瘍小鼠的造模成功與否,確定UPE 技術(shù)為觀察胃潰瘍造模成功的有利手段。通過本方法,不需要將小鼠解剖觀察胃黏膜損傷指數(shù),可以在活體狀態(tài)下觀察胃潰瘍造模的成功情況,確立胃潰瘍模型,節(jié)約實驗成本、人力及物力資源,為實驗的后續(xù)研究奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。本次實驗通過對束縛冷應(yīng)激之一造模方法進行胃潰瘍的造模及光子強度的判斷,既對胃潰瘍的機制研究提供了理論依據(jù),且為后續(xù)針刺治療胃潰瘍的機制研究奠定了基礎(chǔ)。

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