散結(jié)通脈方對ApoE-/-小鼠AS 斑塊逆轉(zhuǎn)和消退的作用機制研究

丁云錄，李 卓，成光宇，劉愛東

（長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，長春 130021）

“散結(jié)通脈方”為全國名中醫(yī)黃永生教授臨床經(jīng)驗方，臨床使用逾20 年，療效確切，臨床依據(jù)充分。本方逆轉(zhuǎn)冠狀動脈粥樣硬化斑塊有確切的療效，具有進一步開發(fā)與研究的價值和意義。本課題通過建立ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型，從主動脈斑塊逆轉(zhuǎn)、消退及血清TNF-α、ox-LDL、ET-1 和IL-10 含量等方面探討痰瘀同治法穩(wěn)定易損斑塊的可能機制，進一步確證中醫(yī)藥的作用靶點及治療機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 實驗動物，SPF 級8 周齡ApoE-/-小鼠（品系C57BL/6J），雄性，60 只，分籠飼養(yǎng)，室溫（23±1）℃，相對濕度50%，通風(fēng)良好，室內(nèi)12 h 明暗自動切換（光照時間7:00～19:00）。動物許可證號：SCXK（京）2016-0006，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。藥品及試劑，散結(jié)通脈方浸膏，性狀：處方14 味藥，棕褐色至棕色浸膏，氣微，味苦。批號：20180329，長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實驗研究中心提供。阿托伐他汀鈣片，規(guī)格：每片10 mg，每盒7 片，批號：20171221，國藥準(zhǔn)字H20133127，浙江新東港藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品。戊巴比妥鈉，規(guī)格：每瓶500 mg，批號：WXBB6772V，美國Sigma 公司產(chǎn)品。膽固醇，規(guī)格：分析純，每瓶500 g，批號：LOT5AF10250，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；膽酸鈉（豬），規(guī)格，分析純，每瓶500 g，批號：K01N8B47111,上海源葉生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒，規(guī)格：每盒96 T、氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）試劑盒，規(guī)格：每盒96 T、內(nèi)皮素-1（ET-1）試劑盒，規(guī)格：每盒96 T、白細(xì)胞介素-10（IL-10）試劑盒，規(guī)格：每盒96 T，批號：E20190601A，均購自美國RD 公司。儀器及器材 光學(xué)顯微鏡，型號：OlympusBX51，日本 Olympus 公司產(chǎn)品；圖像分析系統(tǒng)，型號：NIS-ELEMNT BR，日本NIKON 公司產(chǎn)品；石蠟切片機，型號：Leica RM2255，德國 Leica 公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀，型號：BIO680，Japan BIO RAD 公司產(chǎn)品；臺式高速低溫離心機，型號：Biofuge Stratos，德國賀利氏公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 選用8 周齡ApoE-/-小鼠（品系C57BL/6J），雄性，60 只。小鼠予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機分為正常對照組，模型對照組，陽性對照藥阿托伐他汀鈣49.5 mg·kg-1·d-1給藥劑量組；散結(jié)通脈方設(shè)高劑量（13.5 g·kg-1·d-1）、中劑量（6.75 g·kg-1·d-1）和低劑量（3.40 g·kg-1·d-1）3 個給藥劑量組，共6 組，每組10 只。

1.2.2 造模及給藥 建立動脈粥樣硬化斑塊模型，除正常對照組外，其余實驗組均飼以高脂飼料（2%膽固醇、0.4%膽酸鹽、10%脂肪、69.6%普通飼料）喂養(yǎng)12 周。實驗期間自由攝食飲水，節(jié)律光照。造模同時灌胃給予供試藥品混懸液，正常對照組及模型對照組灌胃給予蒸餾水。每3 日稱量各組小鼠體質(zhì)量1 次，以調(diào)整給藥量[1-5]。

1.2.3 麻醉及取材 實驗周期結(jié)束，禁食12 h，1%戊巴比妥0.5～1.0 mL腹腔麻醉，眼眶采血，室溫靜置1 h，4℃下3 000 r·min-1離心10 min，取上層血清，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。血樣采集結(jié)束后進行剖檢，大體觀察后，分離剪取主動脈弓，放入4%多聚甲醛固定。

1.2.4 檢測指標(biāo) 主動脈AS 斑塊指標(biāo)。標(biāo)本制作，剪取小鼠主動脈弓，4%多聚甲醛固定，經(jīng)自動脫水機脫水后包埋，石蠟切片機切片，每張切片厚度為5 μm。蘇木素伊紅染色，脫蠟，蘇木素染色，1%鹽酸乙醇分化，0.5%伊紅液染色，脫水，中性樹膠封片。根據(jù)蘇木素伊紅染色結(jié)果，10 倍鏡下觀察所有斑塊，每只小鼠均選取斑塊面積最大的1 張切片測量，應(yīng)用面積分析軟件，測量出斑塊面積（mm2）、血管橫截面面積（mm2）、脂質(zhì)空泡面積（mm2），計算，斑塊相對面積＝斑塊面積/血管腔面積。相關(guān)細(xì)胞因子檢測：采用ELISA 試劑盒測定血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）、內(nèi)皮素-1（ET-1） 及白細(xì)胞介素-10（IL-10）水平。原理：夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗，檢測相抗體經(jīng)生物素標(biāo)記。樣品和生物素標(biāo)記抗體先后加入酶標(biāo)板孔反應(yīng)后，PBS 洗滌。隨后加入過氧化物酶標(biāo)記的親和素反應(yīng)經(jīng)PBS 的徹底洗滌后用底物TMB 顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化為藍(lán)色，并在酸的作用下最終轉(zhuǎn)化為黃色。顏色的深淺表現(xiàn)出樣品中相關(guān)的細(xì)胞因子水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所列數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，統(tǒng)計學(xué)處理方法采用組間t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組對ApoE-/-小鼠AS 模型主動脈斑塊的影響 見表1。

2.2 各組對ApoE-/-小鼠AS 模型血清TNF-α、ox-LDL、ET-1、IL-10 含量的影響 見表2。

表1 各組對ApoE-/-小鼠AS 模型主動脈斑塊的影響（，n =10）

表1 各組對ApoE-/-小鼠AS 模型主動脈斑塊的影響（，n =10）

注：與模型對照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

表2 各組對ApoE-/-小鼠AS 模型血清TNF-α、ox-LDL、ET-1、IL-10 含量的影響（，n =10）

表2 各組對ApoE-/-小鼠AS 模型血清TNF-α、ox-LDL、ET-1、IL-10 含量的影響（，n =10）

注：與模型對照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

3 討論

動脈粥樣硬化形成時，脂代謝紊亂，ox-LDL 含量異常升高，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能受損，細(xì)胞活化，分泌TNF-α、IL-6、IL-10 等多種致炎性因子，加重血管壁的炎癥[6-8]。單核巨噬細(xì)胞分泌TNF-α，促使單核細(xì)胞攝取ox-LDL，導(dǎo)致泡沫細(xì)胞的形成，泡沫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的壞死和調(diào)亡，平滑肌細(xì)胞的增殖，移行和細(xì)胞外基質(zhì)增生，最終生成粥樣斑塊。另外，長期脂質(zhì)代謝紊亂會刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞活性氧簇（ROS）的產(chǎn)生和蓄積，引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷、壞死，影響血管內(nèi)皮NO 和ET-1 的分泌，血管內(nèi)皮細(xì)胞生成的ET-1 具有很強的血管收縮作用，研究發(fā)現(xiàn)它與人類很多疾病有關(guān)，這其中就包括動脈粥樣硬化、高血壓等[9-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，散結(jié)通脈方干預(yù)后，動脈粥樣硬化模型小鼠血清TNF-α、ox-LDL、ET-1 和IL-10 含量均可明顯降低，表明散結(jié)通脈方能調(diào)節(jié)介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞調(diào)亡和泡沫化的進程，維持血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能的完整，延遲動脈粥樣硬化炎性進程，對治療動脈粥樣硬化具有極為重要的意義。

本研究結(jié)果顯示，散結(jié)通脈方的干預(yù)與血清炎性因子水平下調(diào)和主動脈斑塊面積、脂質(zhì)空泡面積及斑塊相對面積縮小相關(guān)，說明散結(jié)通脈方具有治療動脈粥樣硬化的作用。