萬古霉素血清濃度檢測UPLC法的建立與評價

李發(fā)雙，宗 靜，李惠英，張力麟，李 強(qiáng)，黎林波

(昆明醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院藥劑科,昆明 650228)

萬古霉素是一種主要經(jīng)腎臟排泄的糖肽類抗生素，在臨床上用于治療需氧G+菌感染，可用于治療由耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和腸球菌引起的嚴(yán)重的新生兒感染[1]。在臨床用藥中，萬古霉素劑量不足可能導(dǎo)致耐藥菌株的產(chǎn)生[2]，過量給藥又會造成嚴(yán)重的毒副作用，如腎毒性和耳毒性[3]。此外，萬古霉素的治療窗窄[4]且個體差異大，因此，其血藥濃度監(jiān)測對于確保足夠的治療濃度同時避免藥品不良反應(yīng)(adverse drug reactions,ADRs)是必要的。

治療藥物監(jiān)測(therapeutic drug monitoring,TDM)在藥物治療中起著重要作用，特別是對于治療窗窄的藥物。監(jiān)測兒童血液中的萬古霉素濃度可以避免副作用，并可根據(jù)監(jiān)測結(jié)果及時調(diào)整劑量。目前臨床常用于檢測血清中萬古霉素濃度的免疫學(xué)方法包括化學(xué)發(fā)光免疫分析法(chemiluminescent immunoassays,CMIA)和酶倍增免疫分析法(enzyme-multiplied immunoassays,EMIT)[5]等。而超高效液相色譜(UPLC)法與上述方法相比，在速度、穩(wěn)定性、靈敏度、準(zhǔn)確性和時效上更具優(yōu)勢。本研究建立了一種UPLC法來快速、準(zhǔn)確地檢測兒童血清中萬古霉素的濃度，為臨床合理使用萬古霉素提供參考。

1 材 料

1.1 儀器 UPLC儀(沃特世科技上海有限公司)；MGS氮氣吹掃濃縮裝置(倍捷科技有限公司)；XH-B型旋渦混合器(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)；SC-3616低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥 萬古霉素對照品(含量100%，批號130338-201704)和內(nèi)標(biāo)去甲萬古霉素對照品(含量87.7%，批號130360-201302)均由中國食品藥品檢定研究院提供；乙腈(色譜純，德國Merck公司)；高氯酸為優(yōu)級純；甲酸為分析純；水為純化水；空白血清由昆明醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院提供。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；以0.3%甲酸溶液為流動相A，乙腈為流動相B進(jìn)行梯度洗脫(0～2 min,90%A；2～5 min,60%A；5～6 min,0%A；6～6.1 min,60%A；6.1～7 min,90%A)，檢測波長236 nm，流速0.25 ml/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量5 μl。

2.2 對照品溶液的制備 分別稱取內(nèi)標(biāo)去甲萬古霉素和萬古霉素對照品10 mg，置于10 ml容量瓶中，分別加入純化水溶解并稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度分別為0.877 mg/ml和1 mg/ml的去甲萬古霉素對照品溶液和萬古霉素對照品溶液,于2～8 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 樣品預(yù)處理 精密吸取血清180 μl，加入濃度為0.877 mg/ml的去甲萬古霉素和1 mg/ml的萬古霉素對照品溶液各20 μl，渦旋混合后加入乙腈-4%高氯酸混合液(1∶3.5)200 μl，渦旋1 min后，室溫下以1.4×104×g離心10 min后，取上清液200 μl進(jìn)樣。

2.4 專屬性考察 專屬性實驗樣本為空白血清、空白血清加入20 μl 100 μg/ml萬古霉素對照品溶液、空白血清加入20 μl 87.7 μg/ml去甲萬古霉素對照品溶液(內(nèi)標(biāo)溶液)、空白血清同時加入20 μl 100 μg/ml萬古霉素對照品溶液和20 μl 87.7 μg/ml內(nèi)標(biāo)溶液，以及患者服用藥物后的血清樣品。按2.3項下方法對樣本進(jìn)行處理，按2.1項色譜條件進(jìn)樣分析，得色譜圖(見圖1)。由圖1可見，萬古霉素保留時間為3.862 min，內(nèi)標(biāo)去甲萬古霉素保留時間為3.734 min，各峰完全分離，峰形較好，空白血清的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾萬古霉素和去甲萬古霉素的測定。

2.5 線性和定量下限 取萬古霉素對照品溶液制備成萬古霉素理論濃度為5、10、25、50、75、100 μg/ml的系列對照品溶液。吸取空白血清180 μl至離心管中，分別精密加入20 μl不同濃度的萬古霉素對照品溶液及20 μl濃度為87.7 μg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻，按2.3項下方法處理，再按2.1項下色譜條件進(jìn)樣。以測得的萬古霉素峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(y)對萬古霉素濃度(x)進(jìn)行直線回歸，得萬古霉素的回歸方程為y=1.012 3x-0.152 2(r=0.999 9)，萬古霉素在5～100 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為5 μg/ml。

圖1 人血清中萬古霉素的UPLC譜圖A：空白血清；B:空白血清+20 μl 100 μg/ml萬古霉素對照品溶液；C：空白血清+20 μl 87.7 μg/ml去甲萬古霉素 對照品溶液(內(nèi)標(biāo)溶液)；D：空白血清+20 μl 87.7 μg/ml內(nèi)標(biāo)溶液+20 μl 100 μg/ml萬古霉素對照品溶液； E:萬古霉素血清樣品+87.7 μg/ml內(nèi)標(biāo)溶液;1:萬古霉素；2:內(nèi)標(biāo)去甲萬古霉素

2.6 回收率和精密度實驗 制備低、中、高濃度為10、50、75 μg/ml的萬古霉素血清樣品，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣，每個濃度取5個樣本檢測；同時配制低、中、高濃度為10、50、75 μg/ml的萬古霉素對照品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，每個濃度取5個樣本檢測。以樣品實測濃度與對照品溶液峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線算得的濃度的比值為提取回收率,樣品實測濃度與理論濃度的比值為方法回收率,結(jié)果顯示該方法符合樣品分析要求。配制低、中、高濃度為10、50、75 μg/ml的萬古霉素血清樣品，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，每個濃度取5個樣本檢測，每天測定5次，連續(xù)測定5 d，計算該方法的日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度，結(jié)果見表1。

表1 回收率及精密度實驗結(jié)果 (n=5，%)

2.7 穩(wěn)定性實驗 取空白血清加入萬古霉素對照品溶液，分別配制低、中、高濃度分別為10、50、75 μg/ml的萬古霉素血清樣品，分別于室溫放置24 h、4 ℃冰箱放置24 h、-20 ℃冰箱放置3 d、反復(fù)凍融兩次考察其穩(wěn)定性，結(jié)果顯示萬古霉素在上述條件下穩(wěn)定性良好。

2.8 臨床應(yīng)用 選取本院100例使用了萬古霉素的嚴(yán)重感染新生兒(萬古霉素用法用量1 g,q6 h，ivgtt)，于用藥第3天第4劑萬古霉素給藥前30 min取外周靜脈血2 ml，采用本研究建立的方法測定萬古霉素血藥濃度(即谷濃度)[6]，結(jié)果見表2。根據(jù)中國藥理學(xué)學(xué)會治療藥物監(jiān)測分會制訂的《萬古霉素治療藥物監(jiān)測指南》中的參考值，在所測樣品中僅有33%的血樣中萬古霉素血藥濃度在10～20 μg/ml的有效谷濃度[7]范圍內(nèi)，表明萬古霉素血藥濃度在新生兒不同個體間存在較大差異，經(jīng)驗性給藥達(dá)到有效血藥濃度的比例不高。

表2 100例新生兒萬古霉素血藥濃度的分布情況

3 討 論

萬古霉素在臨床主要用于治療G+菌引起的嚴(yán)重感染，其藥理作用與血藥濃度之間有一定的相關(guān)性[4]，且萬古霉素血藥濃度在不同個體間存在較大差異，經(jīng)驗性給藥達(dá)到有效血藥濃度的比例不高，為了確?；颊哂盟幍寞熜Ъ鞍踩?，建議使用萬古霉素時監(jiān)測血藥濃度。本研究建立了一種UPLC法測定兒童血清中的萬古霉素。對流動相的選擇，在預(yù)實驗中考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.5 mol/L KH2PO4溶液和甲醇-0.5 mol/L KH2PO4溶液等系統(tǒng)，并調(diào)整了流動相比例，但仍會出現(xiàn)拖尾或者雙重肩峰，經(jīng)過優(yōu)化最終確定了乙腈-0.3%甲酸溶液為流動相梯度洗脫，在本研究設(shè)定的洗脫條件下萬古霉素和去甲萬古霉素可以很好地分離，峰形對稱，無拖尾，且穩(wěn)定性較好。

作者嘗試了多種有機(jī)溶劑如甲醇，5%、7%、10%高氯酸溶液，乙酸乙酯，10%三氯乙酸等處理血樣，結(jié)果表明采用乙腈-4%高氯酸溶液(1∶3.5)進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀的效果優(yōu)于其他有機(jī)溶劑，沉淀后離心，可直接取上清進(jìn)樣。此方法簡便，樣品回收率高，可有效避免空白血清內(nèi)源性物質(zhì)對待測物的干擾，色譜基線穩(wěn)定，響應(yīng)值高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性也較好。

有文獻(xiàn)報道[8]選用替硝唑或維生素B12作為內(nèi)標(biāo)物，但這些藥物在臨床上常與萬古霉素聯(lián)合用藥，會影響測定結(jié)果，最終沒有選擇。去甲萬古霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)與萬古霉素相似，在本研究條件下能與萬古霉素完全分離，且出峰間隔時間短，因此選擇其作為內(nèi)標(biāo)。

萬古霉素TDM被推薦用于藥物療效和安全性評估。本研究建立的UPLC法具有較高的選擇性、靈敏度和準(zhǔn)確度，通過對100例新生兒血清中萬古霉素濃度的測定，確定了本法的可行性與實用性。