創(chuàng)面修復(fù)軟膏促進(jìn)大鼠創(chuàng)面愈合的藥效學(xué)研究

楊 盟，陳敏燕，王 蓉，韓 璐，原永芳

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院藥劑科，上海 200011)

創(chuàng)傷愈合是指外部皮膚斷開或組織缺損后機(jī)體的愈合過程，包括組織再生、肉芽組織增生、瘢痕形成等，體現(xiàn)為各種修復(fù)過程的協(xié)同作用。創(chuàng)面愈合過程受多種炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子、生長因子和修復(fù)細(xì)胞的調(diào)節(jié)，可以分為炎癥期、細(xì)胞增殖期和組織再生期[1]。目前西醫(yī)對于創(chuàng)傷組織的治療常采用清創(chuàng)敷料、抗感染、皮膚移植等措施，不僅費(fèi)用昂貴、患者痛苦且難愈性創(chuàng)面治療效果差，而獨(dú)特的中醫(yī)外治理論和卓有成效的外用方劑，在中醫(yī)藥治療創(chuàng)面的臨床實(shí)踐中發(fā)揮著巨大的作用。

創(chuàng)面修復(fù)軟膏(滬藥制字Z05060611)為上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院院內(nèi)制劑，由紫草、當(dāng)歸、輕粉、地骨皮、甘草、地黃、大黃、豬皮粉等多味藥材組成?！侗静菥V目》記載，該配方具有收斂止血、活血化瘀、解毒收斂、消腐、增肌的作用。其中君藥紫草和臣藥當(dāng)歸能涼血活血生?。淮簏S可以促進(jìn)血液循環(huán)并減少腫脹，生肌止痛；豬皮粉和輕粉化腐提毒，收濕斂瘡；地黃和地骨皮清熱涼血；甘草可以瀉火解毒，助生新肌，調(diào)和諸藥。各味藥材相互配伍、協(xié)同作用，共同發(fā)揮治療瘡瘍的作用。本研究對創(chuàng)面修復(fù)軟膏促進(jìn)一般創(chuàng)面及燒燙傷創(chuàng)面愈合的藥效學(xué)進(jìn)行研究，以完善其藥效學(xué)評(píng)價(jià)，為創(chuàng)面修復(fù)軟膏新藥的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀器和試藥 創(chuàng)面修復(fù)軟膏、空白軟膏(本院自制)；京萬紅軟膏(天津達(dá)仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司)；鹽酸氯胺酮注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)；注射用青霉素鈉(80萬U/支，上海上藥新亞藥業(yè))；磷酸鹽緩沖溶液(PBS，武漢谷歌生物科技有限公司)；消毒酒精(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；其他試劑均為分析純。AF6000電子顯微鏡(德國Leica公司)；心電圖紙 (50 mm×30 mm，上海三五紙廠有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 80只SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量(200±20) g，購自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(滬)2016-0016。

2 方 法

2.1 大鼠一般創(chuàng)面模型的建立 將40只SD大鼠按完全隨機(jī)法分為空白組、模型組、陽性對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組10只。參照全層皮膚缺損法[2]制備動(dòng)物體表一般創(chuàng)面模型。4組大鼠腹腔注射1% 鹽酸氯胺酮(3 ml/kg)麻醉，脫毛，用消毒酒精消毒后，在背部取直徑為1 cm的圓形切口，剪開皮膚全層，剪至皮下筋膜層，用無菌敷料加蓋，形成大鼠全層皮膚缺損開放性創(chuàng)面(一般創(chuàng)面)模型。從造模當(dāng)天開始，每組大鼠肌內(nèi)注射青霉素鈉(4000 U/只)預(yù)防感染，連續(xù)注射3 d。

2.2 大鼠燒燙傷創(chuàng)面模型的建立 將40只SD大鼠按完全隨機(jī)法分為空白組、模型組、陽性對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組10只。4組大鼠實(shí)驗(yàn)前12 h 禁食，自由飲水。大鼠腹腔注射1% 鹽酸氯胺酮(3 ml/kg)麻醉后固定，脫毛，用消毒酒精消毒，室溫下將帶有刻度的兩端無堵頭、內(nèi)徑1 cm的中空塑料管直立于大鼠背部，其一端與大鼠備皮處緊密接觸，接觸壓力保證水不流出且不對皮膚造成損傷，另一端用預(yù)熱后的注射器快速向塑料管內(nèi)注入沸水至2 ml 刻度處，沸水與皮膚持續(xù)接觸10 s后迅速將操作板及大鼠連同中空管翻轉(zhuǎn)，將熱水從塑料管上口倒出。燙傷區(qū)域?yàn)閳A形，直徑1 cm。大鼠背部燙傷后腹腔注射5% 糖鹽水(40 ml/kg)復(fù)蘇。從造模當(dāng)天開始，每組大鼠肌內(nèi)注射青霉素鈉(4000 U/只)預(yù)防感染，連續(xù)注射3 d。

2.3 給藥方法 以空白軟膏作為空白對照藥物，選用市售與創(chuàng)面修復(fù)軟膏主治、劑型以及給藥途徑相同，功能相似的京萬紅軟膏作為陽性對照藥物。造模當(dāng)天清潔創(chuàng)面后，模型組使用生理鹽水紗布覆蓋，空白組、陽性對照組和實(shí)驗(yàn)組分別用1 g空白軟膏、京萬紅軟膏和創(chuàng)面修復(fù)軟膏敷在創(chuàng)面上，然后用無菌紗布覆蓋，并用醫(yī)用膠帶固定。每天換藥一次至所有創(chuàng)面均愈合。實(shí)驗(yàn)期間用心電圖紙計(jì)算大鼠創(chuàng)面面積，觀察和比較大鼠的創(chuàng)面愈合率、愈合時(shí)間、總有效率等，并做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。燒燙傷創(chuàng)面模型大鼠在給藥第7天時(shí)，每組處死2只大鼠，制作蘇木精-伊紅(HE)染色切片，考察大鼠創(chuàng)面病理組織學(xué)。

2.4 考察指標(biāo) 創(chuàng)面愈合時(shí)間是從給藥開始到創(chuàng)面完全愈合所需要的時(shí)間。在造模后第 3、7、14、21 天，計(jì)算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=創(chuàng)面原始面積與創(chuàng)面未愈合面積的差值/創(chuàng)面原始面積×100%。根據(jù)炎性滲出物、肉芽組織及上皮再生情況對大鼠燙傷部位的病理組織學(xué)變化進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[3]見表1。

表1 大鼠燙傷部位的病理組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[3]Table 1 Histopathological scoring standards of scald wound of rats[3]

3 結(jié) 果

3.1 對一般創(chuàng)面愈合的影響 大鼠一般創(chuàng)面模型見圖1A。

圖1 大鼠一般創(chuàng)面模型和燒燙傷創(chuàng)面模型Figure 1 General wound model and burn and scald wound model of rats A ：一般創(chuàng)面；B：燒燙傷創(chuàng)面

3.1.1 對一般創(chuàng)面愈合率的影響 各組大鼠皮膚的一般創(chuàng)面愈合率見表2。給藥第3天，愈合率各組相比無明顯差異(P>0.05)；給藥第7天時(shí)，陽性對照組和實(shí)驗(yàn)組愈合率均顯著高于模型組(P<0.05)；給藥第10天時(shí)，陽性對照組和實(shí)驗(yàn)組愈合率均顯著高于模型組(P<0.05或P<0.01)，實(shí)驗(yàn)組愈合率顯著高于陽性對照組(P<0.05)。

表2 各組大鼠一般創(chuàng)面愈合率比較Table 2 Comparison of healing rate of general wound of rats in each group

3.1.2 對一般創(chuàng)面愈合時(shí)間的影響 與模型組比較，陽性對照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠創(chuàng)面平均愈合時(shí)間明顯縮短(P<0.05或P<0.01)，且實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面平均愈合時(shí)間明顯短于陽性對照組(P<0.05)，見表3。

實(shí)驗(yàn)中剪開大鼠皮膚全層，剪至皮下筋膜層，創(chuàng)面直徑1 cm，術(shù)中可見明顯出血，創(chuàng)面周圍有輕微紅腫。24 h 后，創(chuàng)面輕微縮小，創(chuàng)面邊緣腫脹，使創(chuàng)面邊緣向中心集中，平均直徑為0.8 cm。術(shù)后第3天，陽性對照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠創(chuàng)面干燥，邊緣腫脹消退，表面逐漸形成黃痂皮，創(chuàng)面縮小，直徑0.7～0.8 cm，呈不規(guī)則的橢圓形或圓形，質(zhì)地柔軟。但模型組和空白組大鼠的創(chuàng)面仍呈圓形，直徑0.8～1.0 cm。實(shí)驗(yàn)第7天，模型組和空白對照組的結(jié)痂顏色明顯深于陽性對照組和實(shí)驗(yàn)組，質(zhì)地較硬，創(chuàng)面的平均直徑為0.8 cm，而陽性對照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠創(chuàng)面的平均直徑為0.5 cm。術(shù)后第14天，模型組大鼠的創(chuàng)面長出黑色硬皮(平均直徑為0.8 cm)，其中一些可以剝離，結(jié)痂下面為新生皮膚組織(見圖2A)；空白組的創(chuàng)面已大致愈合(見圖2B)，疤痕的平均直徑約為0.4 cm，質(zhì)地相對堅(jiān)硬；陽性對照組創(chuàng)面已基本愈合，結(jié)痂變小(見圖2C)；實(shí)驗(yàn)組大鼠創(chuàng)面基本愈合，無結(jié)痂，效果較陽性對照組好(見圖2D)。

表3 各組大鼠一般創(chuàng)面愈合時(shí)間的比較Table 3 Comparison of general wound healing time of rats in each group (n=10，t/d)

圖2 各組大鼠一般創(chuàng)面愈合情況Figure 2 General wound healing of rats in each group A：模型組；B：空白組；C:陽性對照組；D：實(shí)驗(yàn)組

3.2 對燒燙傷創(chuàng)面愈合的影響 成功建立大鼠淺Ⅱ度燙傷模型，大鼠表現(xiàn)疼痛，且體重減輕，食物攝入量減少，皮膚局部發(fā)紅腫脹，形成水皰，含黃色血漿，有肉眼可見的紅色創(chuàng)面。大鼠淺Ⅱ度燙傷后，燙傷部位皮膚發(fā)白并出現(xiàn)輕微水腫，見圖1B。

在造模后第7天，根據(jù)表1評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對大鼠燙傷部位病理組織學(xué)變化進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果見表4，與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組與陽性對照組創(chuàng)面表面炎性滲出評(píng)分均具有顯著性差異(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)組肉芽組織再生評(píng)分顯著高于模型組(P<0.05)，而其他組之間比較無顯著性差異(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組與陽性對照組表皮再生修復(fù)評(píng)分均顯著高于模型組(P<0.05)。結(jié)果表明，創(chuàng)面修復(fù)軟膏在燒燙傷創(chuàng)面愈合過程中能夠顯著減少創(chuàng)面炎性滲出，促進(jìn)肉芽組織再生及上皮再生修復(fù)。

表4 各組大鼠燒燙傷創(chuàng)面病理組織學(xué)評(píng)分Table 4 Histopathological scores of burn and scald wound of rats in each group 分)

創(chuàng)面修復(fù)軟膏對各組大鼠燒燙傷創(chuàng)面治療效果見表5。創(chuàng)面修復(fù)軟膏可以縮短創(chuàng)面脫痂和愈合的時(shí)間，并能縮小創(chuàng)面面積，實(shí)驗(yàn)組大鼠長好后的皮膚與正常皮膚相似，未發(fā)現(xiàn)疤痕增生。

表5 各組大鼠燒燙傷創(chuàng)面治療效果的比較Table 5 Comparison of therapeutic effect on burn and scald wound of rats in each group

各組大鼠病理組織圖見圖3，由圖3可見，實(shí)驗(yàn)組大鼠皮膚結(jié)構(gòu)清晰，表皮被完全覆蓋，鱗狀上皮較薄，真皮中的充血性炎癥細(xì)胞未浸潤，附件結(jié)構(gòu)完整。在模型組和空白組中，創(chuàng)面有更多的炎性滲出物，肉芽組織已再生和修復(fù)，在創(chuàng)面邊緣有少量的上皮再生，并且逐漸覆蓋了創(chuàng)面。 與模型組比較，陽性對照組和實(shí)驗(yàn)組用藥后具有促進(jìn)創(chuàng)面愈合，減少炎性滲出，促進(jìn)肉芽和上皮組織再生的優(yōu)點(diǎn)，且實(shí)驗(yàn)組較陽性對照組效果更加明顯。病理組織學(xué)觀察結(jié)果還表明，創(chuàng)面修復(fù)軟膏可以促進(jìn)創(chuàng)面愈合，減少炎癥滲出液，使肉芽組織更加成熟。

4 討 論

中醫(yī)藥治療潰瘍歷史悠久，療效良好。中藥軟膏外敷方法簡單，副作用小，療效確切并在臨床應(yīng)用廣泛。創(chuàng)面修復(fù)軟膏各味藥材解毒化瘀、生肌斂瘡，起效迅速?，F(xiàn)代研究表明，紫草具有祛腐生肌、活血、解毒、消毒止痛等功效，且有較強(qiáng)的收斂作用，而紫草油對創(chuàng)面有滋潤營養(yǎng)作用，對于慢性創(chuàng)面治療效果較好[4]。當(dāng)歸對多種致炎劑引起的急性毛細(xì)血管通透性增高、組織水腫及慢性炎性損傷均有抑制作用，且有鎮(zhèn)痛、抗炎、促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖等作用[5]。大黃外用清熱化瘀、消腫止痛、祛瘀生新，是治療皮膚創(chuàng)傷的傳統(tǒng)藥物。大黃素是大黃的主要有效成分，具有抗菌、抗炎、抑制血小板聚集、改善微循環(huán)、促進(jìn)創(chuàng)面愈合等藥理作用[6]。

皮膚潰瘍創(chuàng)面的愈合規(guī)律是腐去肌生、肌平皮長，且煨膿長肉是中醫(yī)治療創(chuàng)傷組織的傳統(tǒng)規(guī)律[7]。本研究中模型組大鼠創(chuàng)面的平均愈合時(shí)間較長，新上皮的生長較慢，而實(shí)驗(yàn)組大鼠創(chuàng)面有大量分泌物，呈黃色黏稠狀，無味，且創(chuàng)面表面的肉芽組織新鮮，創(chuàng)面愈合較快，生長旺盛。創(chuàng)面修復(fù)軟膏中各味中藥配伍使用，解毒消腫、生肌止痛，為創(chuàng)面愈合創(chuàng)造了較好條件。

本研究通過大鼠一般創(chuàng)面模型和燒燙傷創(chuàng)面模型證實(shí)了創(chuàng)面修復(fù)軟膏可以促進(jìn)創(chuàng)面愈合。據(jù)報(bào)道，皮膚癤癰潰瘍的愈合可能與藥物的抗菌作用和免疫增強(qiáng)作用有關(guān)[8]。創(chuàng)面修復(fù)軟膏的治療作用可能與改善創(chuàng)面微環(huán)境、抑菌作用和減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)，這在一般創(chuàng)面模型中更為明顯。創(chuàng)面修復(fù)軟膏具有良好的屏障作用，能有效抵抗細(xì)菌入侵，預(yù)防感染；將創(chuàng)面保持在濕潤的微環(huán)境中，不僅有利于創(chuàng)面愈合，而且可以浸潤裸露的末梢神經(jīng)；有效吸收創(chuàng)面分泌物，避免粘連；與皮膚潰瘍表面有良好的接觸性能，可以明顯促進(jìn)大鼠皮膚創(chuàng)面的愈合過程。

灼傷和燙傷作為一種壓力性創(chuàng)面，不僅會(huì)造成身體局部損傷，而且還會(huì)誘發(fā)由神經(jīng)內(nèi)分泌、細(xì)胞因子和其他炎癥介質(zhì)介導(dǎo)的全身性炎癥反應(yīng)綜合征，不僅延緩了局部燒燙傷創(chuàng)面的愈合，也會(huì)引起嚴(yán)重的并發(fā)癥，給治療帶來困難[9]。本研究結(jié)果表明，創(chuàng)面修復(fù)軟膏具有明顯的鎮(zhèn)痛、抗炎和抗菌作用，有望成為促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的新藥。

圖3 給藥7天后各組大鼠燒燙傷創(chuàng)面的病理組織圖(×100)Figure 3 Histopathological changes of burn and scald wound surfaces of rats in each group(×100) A：模型組；B：空白組；C：陽性對照組；D：實(shí)驗(yàn)組