HPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定金線蓮中5種農(nóng)藥殘留

吳麗群，羅明可，何文勝，陳文婷

(1.福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院中藥系，福州 350002；2.福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系，福州 350002；3.福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院健康食品系，福州 350002；4.福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院康復(fù)保健系，福州 350002)

金線蓮又名花葉開唇蘭[1]，主要分布在我國(guó)福建、臺(tái)灣、浙江、江西、廣東、廣西等省，其中以福建、臺(tái)灣、浙江和江西為主產(chǎn)地。金線蓮全草均可入藥，性甘、味平，具有保肝、抗病毒、降血壓、抗氧化、降血糖、抗腫瘤、提高免疫力等作用[2]。然而因其生長(zhǎng)環(huán)境遭到人為破壞及過(guò)度采挖，致使金線蓮自然資源日益減少，隨著市場(chǎng)需求量的日益增大，人工繁育成為緩解金線蓮市場(chǎng)供應(yīng)不足的有效途徑之一。目前用于金線蓮人工種植的技術(shù)已相當(dāng)成熟，但是受到高密度栽培的影響，金線蓮在大田種植過(guò)程中極易發(fā)生病蟲害。為了保證金線蓮的品質(zhì)和產(chǎn)量，降低種植成本，農(nóng)藥的使用是無(wú)法避免的，這就會(huì)帶來(lái)農(nóng)藥殘留的問(wèn)題。金線蓮的種植過(guò)程中，主要用到的農(nóng)藥有多菌靈、精甲霜靈、戊唑醇、腈菌唑、三唑磷、吡蟲啉、百菌清、甲基托布津和土霉素等[3-4]。 我國(guó)現(xiàn)有的中草藥中農(nóng)藥殘留檢測(cè)的方法主要是參照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》(簡(jiǎn)稱《藥典》)四部通則2341農(nóng)藥殘留檢測(cè)法。對(duì)比金線蓮病蟲害防治用到的主要農(nóng)藥，其中戊唑醇、精甲霜靈、甲基托布津、土霉素、阿維菌素不在《藥典》通則2341農(nóng)藥殘留檢測(cè)法的列表中。 目前針對(duì)金線蓮中農(nóng)藥殘留檢測(cè)的文獻(xiàn)較少， 沈廷明等[5]用GC法測(cè)定金線蓮中六六六和滴滴涕農(nóng)藥殘留； 劉洪波等[6]用濁點(diǎn)萃取技術(shù)結(jié)合GC-MS法測(cè)定了金線蓮中5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的殘留； 宋曉丹[7]用HPLC法檢測(cè)了金線蓮中多菌靈、 甲基托布津和土霉素的殘留量。

QuEChERS(quick，easy，cheap，effective，rugged，safe)技術(shù)是一種快速、簡(jiǎn)單、低成本的樣品處理方法，該方法采用提取液直接加入吸附劑進(jìn)行凈化，經(jīng)離心后對(duì)上清液進(jìn)行檢測(cè)[8]。HPLC-MS/MS法測(cè)定農(nóng)藥殘留在國(guó)內(nèi)外屢見報(bào)道[9]，此方法不僅有較高的靈敏度，并且具有可以同時(shí)進(jìn)行定性確證和定量分析等優(yōu)點(diǎn)。因此，本研究采用QuEChERS前處理法，結(jié)合HPLC-MS/MS法，建立了一套快速、操作簡(jiǎn)單、有機(jī)溶劑用量少、回收率及精密度高的方法，可同時(shí)檢測(cè)金線蓮中戊唑醇、精甲霜靈、甲基托布津、土霉素和阿維菌素5種農(nóng)藥殘留，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材 料

1.1 儀器 1290 Infinity HPLC儀(美國(guó)Agilent公司)；API5500質(zhì)譜系統(tǒng)(配電噴霧離子源，美國(guó)AB公司)；CR21N型落地式高速冷凍離心機(jī)(日本HITACHI公司)；渦旋混合器(德國(guó)IKA公司)；XSE204型萬(wàn)分之一天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；HM100 刀式研磨儀(北京格瑞德曼公司)。

1.2 藥品和試劑 阿維菌素(濃度 100.0 μg/ml，批號(hào)S024919)、甲基托布津(濃度100.0 μg/ml，批號(hào)S022255)、精甲霜靈(濃度100.0 μg/ml，批號(hào)S018827)、戊唑醇(濃度103.0 μg/ml，批號(hào)S030729)和土霉素(濃度100.0 μg/ml，批號(hào)ALT600353)標(biāo)準(zhǔn)溶液(天津阿爾塔科技有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國(guó)TEDIA公司)；甲酸(色譜純，上海阿拉丁公司)；吸附劑石墨化碳(GCB，批號(hào)J0423-G2)、N-丙基乙二胺(PSA，批號(hào)J04S13BMX，蘇州納譜分析技術(shù)有限公司)；無(wú)水硫酸鎂(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；超純水用Milli Q系統(tǒng)(美國(guó)Milipore公司)自制。實(shí)驗(yàn)用到的金線蓮干制品分別購(gòu)自福建虎伯寮藥業(yè)有限責(zé)任公司(批號(hào)20190606)、南靖靈蘭農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司(批號(hào)20190624、20190903、20191201)、廈門市珍芝蓮生物科技有限公司(批號(hào)20190923、20191202)、莆田市仙游縣森汶農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司(批號(hào)20190918)。新鮮品購(gòu)自貢享本草(永泰)生物科技有限公司福建省福州市永泰縣芋坑基地(批號(hào)20191229)和嵩口基地(批號(hào)20191209)、龍巖市連城縣基地(批號(hào)20191228)。干制品和新鮮品均經(jīng)福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院中藥教研室高華娟講師鑒定為真品。

2 方法和結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制 精密吸取5種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用乙腈稀釋并定容，配制混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中土霉素、精甲霜靈的濃度為1.0 μg/ml，戊唑醇的濃度為5.0 μg/ml，阿維菌素的濃度為25.0 μg/ml，甲基托布津的濃度為2.5 μg/ml。配制好的溶液于-20 ℃下避光保存。另準(zhǔn)確吸取5種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，分別用乙腈配制成濃度為50 μg/L的各種待測(cè)物的標(biāo)準(zhǔn)工作液，用于質(zhì)譜條件的優(yōu)化。

2.2 色譜及質(zhì)譜條件

2.2.1 色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)，以0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫：0～1.0 min，90% A；1.0～3.0 min，90%～70% A；3.0～5.0 min，70%～30% A；5.0～8.0 min，30%～10% A；8.0～14.0 min，10% A；14.0～15.0 min，10%～90% A；15.0～17.0 min，90% A；柱溫30 ℃；流速0.2 ml/min；進(jìn)樣量2 μl。

2.2.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(ESI)正離子模式；離子源溫度450 ℃；電噴霧電壓4500 V；氣簾氣壓20 psi(1 psi=6.894 76 kPa)；霧化氣壓50.0 psi；輔助氣壓50.0 psi；碰撞室入口電壓9.0 V；碰撞室出口電壓15.0 V；采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描(MRM)模式，5種農(nóng)藥的測(cè)定參數(shù)見表1，MRM譜圖見圖1。

2.3 樣品的制備及測(cè)定 金線蓮干制品的制備：取不少于100 g的金線蓮干制品，置于刀式研磨儀中，以8000 r/min的速度充分搗碎混勻2 min后，過(guò)200目篩，分裝入潔凈的密封袋中，密封避光保存。 金線蓮新鮮品的制備：取不少于 100 g的新鮮金線蓮，置于刀式研磨儀中，以8000 r/min 的速度充分搗碎混勻2 min后，分裝入聚四氟乙烯塑料瓶中，密封后于-18 ℃保存。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式測(cè)定 金線蓮中5種農(nóng)藥的質(zhì)譜分析條件Table 1 Analysis conditions of mass spectrometry for determination of five pesticide residues in Anoectochilus roxburghii by multiple reaction monitoring scanning mode

準(zhǔn)確稱取已粉碎的金線蓮樣品5.00 g于50 ml離心管中，干制品加入10 ml水渦旋混勻并靜置30 min (新鮮品不需加水)。精密加入10 ml乙腈，混勻，再加入4 g無(wú)水硫酸鎂、1 g氯化鈉及1 g檸檬酸三鈉，蓋上離心管蓋，劇烈振搖2 min后以1.3×104×g離心5 min。取5 ml上清液于15 ml離心管中，并加入900 mg無(wú)水硫酸鎂、150 mg PSA及45 mg GCB，渦旋1 min后以1.3×104×g離心5 min，取上清液過(guò)0.22 μm的濾膜，上機(jī)待測(cè)。

2.4 線性關(guān)系考察 以不含5種待測(cè)農(nóng)藥殘留的金線蓮干制品作為空白樣品， 按照 2.3 項(xiàng)下方法處

理得空白基質(zhì)溶液，以空白基質(zhì)溶液配制不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測(cè)定，以5種農(nóng)藥的質(zhì)量濃度為X軸，定量離子的峰面積為Y軸，繪制工作曲線，得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)(r)，結(jié)果見表2。

2.5 回收率和精密度實(shí)驗(yàn) 在空白金線蓮干制品中添加低、中、高濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加濃度平行制備6份樣品，按2.3項(xiàng)下方法處理樣品，再按2.2項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率及精密度，結(jié)果見表3。5種農(nóng)藥的平均加樣回收率為72.7%～94.9%，RSD為1.8%～10.3%(n=6)。

2.6 檢測(cè)限和定量限 精密稱取同一批(批號(hào)20190606)已粉碎的金線蓮干制品5.00 g，加入2.1項(xiàng)下配制的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，按2.3項(xiàng)下方法處理樣品，再按2.2項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣，以3倍的信噪比(S/N)和10倍的信噪比來(lái)確定方法的檢測(cè)限(LODs)和定量限(LOQs)，結(jié)果見表2。

2.7 樣品中農(nóng)藥殘留量的測(cè)定 分別取從市場(chǎng)上購(gòu)買的7批金線蓮干制樣品和3批金線蓮新鮮品進(jìn)行檢測(cè)，按2.3項(xiàng)下方法處理后，再按2.2項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件測(cè)定，結(jié)果批號(hào)為20190918的金線蓮干制品檢出甲基托布津，含量為84.4 μg/kg；批號(hào)為20191209的金線蓮新鮮品檢出甲基托布津和精甲霜靈，含量分別為96.8和38.6 μg/kg。

表2 5種農(nóng)藥的線性關(guān)系考察結(jié)果Table 2 Linear relationship of five pesticides

表3 5種農(nóng)藥的加樣回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of recovery and precision tests of five pesticides (n=6)

3 分析和討論

3.1 色譜和質(zhì)譜條件的選擇 預(yù)實(shí)驗(yàn)中采用直接進(jìn)樣的方式，分別將濃度為50 μg/L的各種待測(cè)物的標(biāo)準(zhǔn)工作液注入離子源，每種待測(cè)物選擇兩對(duì)響應(yīng)值高的特征離子對(duì)作為定量及定性的離子對(duì)，并對(duì)MRM參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。同時(shí)優(yōu)化了色譜流動(dòng)相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以水-乙腈作為流動(dòng)相，5種待測(cè)物的峰型較好，無(wú)拖尾現(xiàn)象，故本研究選用水-乙腈體系作為流動(dòng)相。在正離子模式下，甲酸可以增大目標(biāo)離子的離子化效率，并能改善峰型，故本研究以加入0.1%甲酸的乙腈作為HPLC法梯度洗脫中的有機(jī)流動(dòng)相。

3.2 提取溶劑的選擇 5種待測(cè)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)差異較大，但都易溶于有機(jī)溶劑，因此本研究選擇常用的乙腈、甲醇、丙酮進(jìn)行提取效果考察。相對(duì)于其他溶劑，乙腈去除雜質(zhì)的效果及對(duì)農(nóng)藥的提取效率最佳，因其滲透性強(qiáng)，溶解性能良好，不僅能提高5種農(nóng)藥的回收率，而且能減少提取液中色素、蛋白質(zhì)、多糖等共萃取物的含量，有利于后續(xù)的凈化，因此本研究選擇乙腈作為提取劑。另外在研究中發(fā)現(xiàn)，對(duì)于金線蓮干制品，提取前加水浸泡可以提高對(duì)農(nóng)藥殘留的提取效率，但隨著水量的增加，回收率開始降低?？赡艿脑蚴?，當(dāng)加水浸泡后，金線蓮粉末充分泡開，便于待測(cè)物溶出；而水量太多時(shí)，有機(jī)溶劑相對(duì)較少， 根據(jù)“相似相溶”原理推測(cè)， 不利于待測(cè)物的提取。 最終選擇用10 ml的水量浸泡金線蓮干制品。

3.3 樣品凈化條件的選擇 金線蓮中含有大量的色素、多糖、有機(jī)酸等物質(zhì)，為了減少這些物質(zhì)對(duì)后續(xù)液相色譜柱和質(zhì)譜系統(tǒng)的污染，并確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，提取液必須進(jìn)一步凈化。PSA可有效去除糖類、酚類、脂肪酸和少量色素。GCB可有效去除色素、維生素類、固醇類和一些具有平面結(jié)構(gòu)的干擾物質(zhì)。本研究參照文獻(xiàn)[10]，選擇900 mg無(wú)水硫酸鎂、150 mg PSA及45 mg GCB作為QuEChERS法的凈化劑。研究結(jié)果表明，經(jīng)凈化后的提取液顏色明顯變淺，且5種農(nóng)藥的加樣回收率均>70%，說(shuō)明該凈化方法可用于這5種農(nóng)藥殘留量檢測(cè)時(shí)樣品的凈化。